同時檢測三種鏈球菌的三重實時螢光pcr方法及試劑盒的製作方法
2023-06-09 13:42:41 2
同時檢測三種鏈球菌的三重實時螢光pcr方法及試劑盒的製作方法
【專利摘要】本發明提供一種同時檢測三種鏈球菌的三重實時螢光PCR方法及試劑盒，試劑盒包括：無乳鏈球菌的檢測引物對如序列表SeqIDNo.1和2所示及探針如序列表SeqIDNo.3所示，停乳鏈球菌的檢測引物對如序列表SeqIDNo.4和5所示及探針SeqIDNo.6所示，海豚鏈球菌的檢測引物對如序列表SeqIDNo.7和8及探針SeqIDNo.9所示、三種陽性對照品如序列表SeqIDNo.16、17和18所示，陰性對照品(ddH2O)和螢光實時定量PCR擴增所需的PCR緩衝液，dNTP，TaqDNAPolymerase。該方法簡單快速、特異性好。
【專利說明】同時檢測三種鏈球菌的三重實時螢光PCR方法及試劑盒
【技術領域】
[0001] 本發明屬於生物【技術領域】，具體涉及一種同時檢測三種鏈球菌的三重實時螢光 PCR方法及試劑盒。
【背景技術】
[0002] 鏈球菌屬（Streptococcus )是一個具有龐大種群的屬，該屬已發現至少有60 多個菌種和亞種，在水生動物中致病性鏈球菌屬病原菌種群種類並不多，從養殖魚類上已 經分離到的鏈球菌有海豚鏈球菌（S. iniae)、難辨鏈球菌（S. diffucilis )、無乳鏈球菌（ S. agalactiae )、米氏鏈球菌（S. milleri )、副乳房鏈球菌（S.parauberis )、停乳鏈 球菌（S. dysgalactiae )，但已報導的致病性鏈球菌主要是無乳鏈球菌、停乳鏈球菌和海 豚鏈球菌，可引起多種海、淡水魚類發病，在世界各主要魚類養殖國家均有發生，對溫帶和 熱帶、亞熱帶地區養殖魚類危害尤為嚴重，已有6大洲的23個國家報導了魚類鏈球菌病。 目前，魚類鏈球菌病已經成為一種呈世界性分布的疾病，每年給世界水產養殖業造成巨大 的經濟損失。
[0003]目前，針對無乳鏈球菌、停乳鏈球菌和海豚鏈球菌的檢測通常採用常規增菌培養、 生化鑑定及自動酶聯螢光免疫檢測方法相結合，存在工序繁瑣、檢測周期長、檢測靈敏度不 高、檢出效率低、假陰性普遍等缺點。因此，發展操作簡便、快速準確、靈敏度高且易推廣的 檢測方法，對魚類鏈球菌病進行早診斷和早預防，提高水產品質量和保障人類健康均具有 重要意義。
[0004] 實時突光定量 PCR 技術（Real-time quantitative Polymerase Chain Reaction, Real Time PCR)從眾多檢測技術中脫穎而出，它不僅具有快速、簡便、靈敏等優 點，而且與常規PCR方法相比，由於引物和探針的"雙保險"，因此特異性更強、自動化程度 更高，並實現了實時在線檢測，PCR擴增過程無需對PCR擴增產物進行後處理，有效地解決 了 PCR產物汙染導致的假陽性及不能準確定量的問題，因而成為檢測領域越來越重要的一 種檢測手段。但是，螢光定量PCR技術只能檢測一個靶標。
[0005] 多重螢光定量PCR技術是在螢光定量PCR基礎上發展起來的一個新技術，它強調 在同一個反應體系裡同時擴增多個靶標。最近已有多項研究將多重定量PCR技術應用於細 菌檢測領域。Andrea G.等建立了大腸桿菌0157:H7、沙門氏菌和單細胞增生李斯特氏菌多 重螢光PCR檢測方法，Moniserrat E.等建立了魚類和水產品中副溶血弧菌、霍亂弧菌等5 種弧菌的多重PCR檢測方法，結果顯示多重PCR體系與單一擴增結果在靈敏度和特異性方 面基本相同。但是到目前為止，尚無報導有同時檢測無乳鏈球菌、停乳鏈球菌和海豚鏈球菌 的試劑盒。
【發明內容】
[0006] 基於以上不足之處，本發明的目的在於提供一種能同時檢測水生動物主要三種致 病性鏈球菌無乳鏈球菌、停乳鏈球菌和海豚鏈球菌的多重定量Taqman PCR方法，同時基於 該方法提供相應的試劑盒。
[0007] 本發明的目的是通過以下技術實現的： 1、一種利用實時螢光PCR方法同時檢測三種鏈球菌的引物對及探針， 無乳鏈球菌： 上引物cpsF- FP，如序列表Seq ID No. 1所示， 下引物〇口8?-1^，如序列表569 10 1^〇.2所示， 探針cpsF-PROBE，如序列表Seq ID No. 3所示； 停乳鏈球菌： 上引物MIG- FP，如序列表Seq ID No. 4所示， 下引物MIG- RP，如序列表Seq ID No. 5所示， 探針MIG-PROBE，如序列表Seq ID No. 6所示； 海豚鏈球菌： 上引物16SrRNA- FP，如序列表Seq ID No. 7所示， 下引物16SrRNA_RP，如序列表Seq ID No. 8所示， 探針16SrRNA-PR0BE，如序列表Seq ID No. 9所示； cpsF-PROBE探針，MIG-PR0BE探針和16SrRNA-PR0BE探針的5'端標記的螢光素不同， 分別為FAM、HEX和R0X。
[0008] 2、一種含有如上所述的一種利用實時突光PCR方法同時檢測三種鏈球菌的引物 對及探針的試劑盒。
[0009] 3、一種利用實時螢光PCR方法同時檢測三種鏈球菌的陽性對照品PCR擴增引物 對， 無乳鏈球菌： 上引物SA-F，如序列表Seq ID No. 10所示， 下引物SA-R，如序列表Seq ID No. 11所示； 停乳鏈球菌： 上引物SD-F，如序列表Seq ID No. 12所示， 下引物SD-R，如序列表Seq ID No. 13所示； 海豚鏈球菌： 上引物SI-F，如序列表Seq ID No. 14所示， 下引物SI-R，如序列表Seq ID No. 15所示。
[0010] 4、一種利用實時螢光PCR方法同時檢測三種鏈球菌的陽性對照品， pMD-T-cpsF，如序列表 Seq ID No. 16 所不； pMD-T-MIG，如序列表 Seq ID No. 17 所示； pMD-T_16SrRNA，如序列表 Seq ID No. 18 所示。
[0011] 5、如上所述的一種利用實時螢光PCR方法同時檢測三種鏈球菌的引物對及探針， 檢測鏈球菌的實時螢光PCR反應體系如下 ：
【權利要求】
1. 一種利用實時螢光PCR方法同時檢測三種鏈球菌的引物對及探針，其特徵在於， 無乳鏈球菌： 上引物cpsF- FP，如序列表Seq ID No. 1所示， 下引物〇口8?-1^，如序列表569 10 1^〇.2所示， 探針cpsF-PROBE，如序列表Seq ID No. 3所示； 停乳鏈球菌： 上引物MIG- FP，如序列表Seq ID No. 4所示， 下引物MIG- RP，如序列表Seq ID No. 5所示， 探針MIG-PROBE，如序列表Seq ID No. 6所示； 海豚鏈球菌： 上引物16SrRNA- FP，如序列表Seq ID No. 7所示， 下引物16SrRNA_RP，如序列表Seq ID No. 8所示， 探針16SrRNA-PR0BE，如序列表Seq ID No. 9所示； cpsF-PROBE探針，MIG-PR0BE探針和16SrRNA-PR0BE探針的5'端標記的螢光素不同， 分別為FAM、HEX和R0X。
2. -種含有如權利要求1所述的一種利用實時突光PCR方法同時檢測三種鏈球菌的引 物對及探針的試劑盒。
3. -種利用實時螢光PCR方法同時檢測三種鏈球菌的陽性對照品PCR擴增引物對，其 特徵在於， 無乳鏈球菌： 上引物SA-F，如序列表Seq ID No. 10所示， 下引物SA-R，如序列表Seq ID No. 11所示； 停乳鏈球菌： 上引物SD-F，如序列表Seq ID No. 12所示， 下引物SD-R，如序列表Seq ID No. 13所示； 海豚鏈球菌： 上引物SI-F，如序列表Seq ID No. 14所示， 下引物SI-R，如序列表Seq ID No. 15所示。
4. 一種利用實時螢光PCR方法同時檢測三種鏈球菌的陽性對照品，其特徵在於， pMD-T-cpsF，如序列表 Seq ID No. 16 所不； pMD-T-MIG，如序列表 Seq ID No. 17 所示； pMD-T_16SrRNA，如序列表 Seq ID No. 18 所示。
5. 根據權利要求1所述的一種利用實時螢光PCR方法同時檢測三種鏈球菌的引物對及 探針，其特徵在於，檢測鏈球菌的實時螢光PCR反應體系如下 ：
擴增反應條件均為: Step 1 95 °C 15min ； Step 2 94°C 60s Step 3 60°C 60s Step 4 讀數，Go to Step 2 for 40 個循環。
6. 根據權利要求3所述的一種利用實時螢光PCR方法同時檢測三種鏈球菌的陽性對照 品的製備方法，其特徵在於，包括以下步驟： (1) PCR模板的製備：三種鏈球菌基因組DNA的提取和純化， (2) 選擇無乳鏈球菌cpsF基因作為靶基因，步驟（2)中，三種靶基因的PCR反應體系 均如下：
，？〇?的反應條件均為：預變性951：51^11;941：158、57.61：2〇8、721：3〇8,35個循 環；終延伸72°C lOmin ; 設計陽性對照品的PCR擴增引物： 上引物SA-F，如序列表Seq ID No. 10所示， 下引物SA-R，如序列表Seq ID No. 11所示，並進行靶基因的PCR擴增； 選擇停乳鏈球菌MIG基因作為靶基因，設計陽性對照品的PCR擴增引物：上引物SD-F， 如序列表Seq ID No. 12所示， 下引物SD-R，如序列表Seq ID No. 13所示，並進行靶基因的PCR擴增； 選擇海豚鏈球菌16SrRNA基因作為靶基因，設計陽性對照品的PCR擴增引物： 上引物SI-F，如序列表Seq ID No. 14所示， 下引物SI-R，如序列表Seq ID No. 15所示，並進行靶基因的PCR擴增； (3) 陽性對照品 pMD-T-cpsF，pMD-T-MIG，pMD-T-16SrRNA 的製備； 步驟（3)中，陽性對照品的製備過程，包括如下步驟：將步驟（2)中所得PCR產物與克 隆載體pMD-19-T vector連接，轉化大腸桿菌感受態JM109,獲得陽性克隆菌株，並製備質 粒 pMD-T-cpsF、pMD-T-MIG 和 pMD-T-16SrRNA 作為陽性對照品。
7. -種同時檢測三種鏈球菌的三重實時螢光PCR方法的試劑盒，其特徵在於，包括： 無乳鏈球菌： 上引物cpsF- FP，如序列表Seq ID No.l所示， 下引物〇口8?-1^，如序列表569 10 1^〇.2所示， 探針cpsF-PROBE，如序列表Seq ID No. 3所示； 停乳鏈球菌： 上引物MIG- FP，如序列表Seq ID No. 4所示， 下引物MIG- RP，如序列表Seq ID No. 5所示， 探針MIG-PROBE，如序列表Seq ID No. 6所示； 海豚鏈球菌： 上引物16SrRNA- FP，如序列表Seq ID No. 7所示， 下引物16SrRNA_RP，如序列表Seq ID No. 8所示， 探針16SrRNA-PR0BE，如序列表Seq ID No. 9所示； 三種陽性對照品： 口]\?-1'-〇口8?，如序列表369 10 1')〇.16所不， pMD-T-MIG，如序列表 Seq ID No. 17 所示， pMD-T_16SrRNA，如序列表 Seq ID No. 18 所示， 陰性對照品（ddH20)和螢光實時定量PCR擴增所需的PCR緩衝液，dNTP，Taq DNA Polymerase。
【文檔編號】C12N15/11GK104152572SQ201410425186
【公開日】2014年11月19日 申請日期:2014年8月27日 優先權日:2014年8月27日
【發明者】李丹丹, 徐義剛, 高慎陽, 蔡波 申請人:海南出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心