以花生種子休眠芽胚軸為外植體的農桿菌介導的遺傳轉化方法

2023-06-10 06:55:56 1

專利名稱：以花生種子休眠芽胚軸為外植體的農桿菌介導的遺傳轉化方法
技術領域：
本發明涉及一種花生遺傳轉化的方法，特別涉及一種利用農桿菌
"graZ^c^7'wm似me/flde"s)介導的簡便、高效地將外源基因轉化進入花 生成熟種子的休眠芽胚軸外植體內的轉化方法。
背景技術：
花生是重要的油料和經濟作物，具有豐富的營養價值。雖然它是農杆 菌的天然宿主之一，但具有和多數豆科作物相同的弱點，即外源基因導入 難度大，遺傳轉化在花生育種上的工作受到一定限制，進展較慢。
國外從上世紀40年代開始花生組織培養研究，我國則從70年代開始， 已經建立了多種花生營養和生殖器官再生體系。農桿菌介導的外源基因遺 傳轉化是花生重要的遺傳轉化手段之一。自1994年Eapen和George首次 報導獲得花生轉基因植株以來，農桿菌介導途徑進行花生基因轉化的研究 己有較多成功的報導。
雖然近十幾年來，花生的遺傳轉化隨著其體細胞植株再生技術的進步 取得了一定進展。已能夠通過農桿菌介導的方法獲得轉基因花生再生株系。 但轉化及再生率過低，而且同樣的遺傳轉化體系在不同基因型的花生中轉 化效果差異明顯，不能滿足現代基因工程進行遺傳育種的需要。究其原因， 除了多數豆科作物共同的難以被轉化的弱點外及轉化過程影響因素較多 外，主要由於沒有找到合適的轉化外植體，來建立高效的植株再生體系。 目前已成功獲得轉基因植株的外植體可概括為兩大類， 一類是來源於幼苗 或萌動種子的幼葉、胚軸或子葉；另一類是帶子葉的成熟胚。但利用這些 外植體進行轉化均存在再生周期長、轉化及再生率低、在不同基因型花生 品種間不穩定等問題，因此，正確選擇轉化外植體，建立穩定高效的植株 再生體系的是的解決目前花生中基因轉化有效性問題的關鍵環節
發明內容
為了克服現有的花生遺傳轉化方法中再生周期長、轉化及再生率低、 轉化效果不穩定等問題，本發明的目的在於提供一種以花生成熟種子休眠 芽胚軸為轉化外植體的農桿菌介導的穩定高效遺傳轉化方法。本發明採用 花生成熟種子的休眠芽胚軸作為轉化外植體，並就遺傳轉化中涉及的侵染 菌液濃度、侵染時間、共培養時間、植物激素濃度和生根條件等處理因素 對轉化和再生效率的影響進行了研究。該方法採用具有活躍分生能力並易 於脫分化的休眠芽胚軸細胞作為遺傳轉化外植體，只需常規的菌株和培養 基，無須基因槍等貴重儀器，不需要金粉等昂貴的實驗載體材料，而且操 作簡便易行，實驗周期短，轉化頻率高，在不同基因型花生品種間的轉化 效果十分穩定。
本發明的目的通過下述技術方案來實現 一種以花生成熟種子休眠芽 胚軸為外植體的農桿菌介導的遺傳轉化方法，包括如下步驟
(1) 轉化外植體分離消毒後的花生種子浸泡後，在無菌環境中除去 花生種子皮，沿子葉間縫隙切開種子，將完整的胚從子葉中剝離，切除胚 根和胚芽，保留餘下的花生成熟種子休眠芽胚軸部分作為待轉化的休眠芽 胚軸外植體；將上述休眠芽胚軸外植體在預培養基上於24 28'C預培養 0.5 1天，得到預培養後的休眠芽胚軸外植體。
(2) 侵染液製備將含待轉化質粒的農桿菌菌株接種至YEB液體培
養液中，2sx:振蕩培養過夜；將培養物離心收集農桿菌菌體，並重懸於預
冷至4"C的含有100mMol/L乙醯丁香酮的液體MS培養基中，使農桿菌重 懸液的濃度在OD6。Q=0.2 1.5，即得到含有農桿菌的液體MS培養基。
(3) 轉化將預培養後的休眠芽胚軸外植體浸浮在上述含有農桿菌的 液體MS培養基中，使農桿菌與休眠芽胚軸外植體充分接觸5 30分鐘進 行轉化後，取出休眠芽胚軸外植體，濾幹菌液後平鋪於共培養培養基於24 28°C， 16小時光照/8小時黑暗的培養條件中，共培養2 4天，得到共培養 後的休眠芽胚軸外植體。 .
(4) 芽誘導培養將共培養後的休眠芽胚軸外植體轉移至芽誘導培養 基上進行誘導培養。
(5) 篩選培養將芽誘導培養後的休眠芽胚軸外植體轉移至篩選培養 基上進行篩選，每隔10天更換一次篩選培養基，共轉移2 3次，得到篩 選培養的叢生芽。 '(6) 生根培養將經過篩選培養的叢生芽轉移至生根培養基，在生根
培養基上生長2 4周，代根長至4 12釐米長，得到生根的植株。
(7) 移植將步驟(6)中生根的植株移至溼度為70 85%的滅菌砂 土中，培養馴化後；便可將其移入溫室生長、開花、結實。
所述預培養基組成為固體MS+3mg/L6-BA(6-苄氨基嘌吟)；所述共培 養培養基組成為MS+3mg/L 6-苄氨基嘌呤+100uM Acetosyringone (乙醯丁 香酮)；所述芽誘導培養基組成為MS+3mg/L 6-苄氨基嘌呤+300mg/L頭 孢黴素；所述篩選培養基組成為MS+3mg/L 6-苄氨基嘌呤+300mg/L頭 孢黴素+20mg/L潮黴素；所述生根培養基組成為1/2MS+3mg/LIBA(吲哚 丁酸)+0. lmg/L NAA(奈乙酸)。
為了再生和轉化效果最為穩定和高效，實驗過程中兩個步驟十分關鍵 在步驟(1)中，製備待轉化的休眠芽胚軸外植體時，芽原基去除要徹底， 避免產生由芽原基直接發育而成幼芽;使休眠芽胚軸外植體在含有3mg/L 6-苄氨基嘌呤的預培養基上預培養0.5 1天，是提高再生率的關鍵因素。
所述步驟(1)中消毒是將成熟花生種子經0.1%的升汞溶液表面消毒 IO分鐘，再用無菌水清洗3次。所述步驟(1)中浸泡是在50。C的溫水中 浸泡3小時。
所述步驟(2)中待轉化質粒為植物表達載體pCAMBIA1301-PR10、 pCAMBIA1301-LjCYC或pCAMBIA1301-GmFAD3C。 所述步驟(2)中農桿菌為EHA105菌株。
所述步驟(4)中芽誘導培養條件為24 28°C， 16小時光照/8小時黑 暗，培養時間為5 10天。
本發明原理是休眠芽胚軸部分的細胞層具有高度分化能力，且分裂 速度快，此時是導入外源基因的最佳時期。植物基因工程上較好的器官形 成途徑是採用由體細胞直接發生的方式，例如直接誘導外植體分化不定芽。 因為直接發生方式具有獲得再生植株周期短，不經過脫分化，體細胞無性 系變異小，能較好保持受體細胞的遺傳穩定性以及轉化的外源基因也能實 現穩定遺傳等優點。花生成熟種子休眠芽的胚軸部分'的細胞具有較強分化 能力，能夠在合適的激素組合下通過直接發生方式形成再生芽，從而實現 花生的高效、快速再生。
本發明與現有技術相比，具有如下優點和有益效果1、 以花生成熟種子休眠芽的胚軸部分作為轉化外植體，由於被侵染的 組織為具有高度分生能力的活躍分生組織細胞，而且易於脫分化，因此再
生率和轉化率更高，再生效率達91.5%。
2、 花生成熟種子休眠芽的胚軸部分細胞具有活躍的高度分生能力且易 於脫分化這是不同基因型花生的共性，因此本發明方法在不同基因型花生 的遺傳轉化中的效果穩定。
3、 本發明方法中再生芽的發生途徑繞開了由愈傷組織離體培養再生植 株的漫長途徑，3個月內可形成生根的植株；使轉化周期縮短了50%。
4、 外植體來源不受花生種植、發育時間的限制。


圖1為本發明中花生成熟種子休眠芽的胚軸外植體的製備圖。
其中，la 、消毒後的完整花生種子材料；lb、花生胚與子葉分離開來； lc、胚從上至下被切為三部分，分別是芽原基、休眠芽的胚軸、胚根；ld、 用作外植體的休眠芽胚軸。
圖2為本發明中花生成熟種子休眠芽胚軸外植體上再生芽的形成過程 圖，其中2d已有明顯可見的叢生的再生芽。
其中，2a、在芽誘導培養基上5天以後的休眠芽胚軸外植體；2b、在 芽誘導培養基上IO天以後的休眠芽胚軸外植體；2c、耷芽誘導培養基上15 天以後的休眠芽胚軸外植體；2d、在芽誘導培養基上25天以後的休眠芽胚 軸外植體，已出現綠色叢生芽。
圖3為本發明中的轉化方法轉化AhPR10基因的轉基因植株圖。
其中，3a、用本發明中轉化方法轉化AhPRlO基因的花生轉基因叢生 芽；3b、用本發明中的轉化方法轉化AhPR10基因的轉基因植株。
圖4為採用PCR方法對實施例 一 中轉PR10基因的轉基因植株進行PCR 鑑定的PCR鑑定電泳圖。
圖5為採用PCR方法對實施例二中轉LjCYC基因的轉基因植株進行鑑 定的PCR鑑定電泳圖。
圖6為採用PCR方法對實施例三中轉GmFAD3C'基因的轉基因植株進 行鑑定的PCR鑑定電泳圖。
具體實施例方式
下面結合實施例及附圖對本發明作進一步詳細的描述，但本發明的實 施方式不限於此。
實施例一以花生成熟種子休眠芽胚軸為外植體的農桿菌介導的遺傳 轉化方法用於AhPRlO基因的轉化
(1) 選取成熟飽滿的花生種子，在超淨工作檯的無菌環境中，將花生
種子經0.1% (W/V)的升汞溶液表面消毒10分鐘，再用無菌水清洗3次。 用5(TC的溫水浸泡3小時後，除去種皮，用無菌解剖刀沿子葉間縫隙切開 種子，用解剖刀將完整的胚從子葉中剝離，切除胚根和芽原基，保留餘下 的花生成熟種子休眠芽胚軸部分作為待轉化的休眠芽胚軸外植體，並在預 培養基(固體MS+3mg/ L 6-苄氨基嘌呤)上預培養0.5天。如圖1所示， 為花生成熟種子胚休眠芽胚軸外植體的製備圖。圖2為本發明中花生成熟 種子休眠芽胚軸外植體上再生芽的形成過程圖，其中2d已有明顯可見的叢 生的再生芽。
(2) 以花生AhPR10基因為待轉基因，將花生AhPR10基因兩端分別 連上Ncol和Spel酶切位點，用Ncol和Spel雙酶切後連入用Ncol和Spel 雙酶切的pCAMBIA1301載體，構建包含花生AhPRlO基因的植物表達載 體pCAMBIA1301-AhPR10。將該載體導入農桿菌EHA105菌株，將經鑑定 為陽性的克隆按照l : 100的體積比接種至200mlYEB液體培養液中(含有 50mg/L慶大黴素，50mg/L卡那黴素，100mMol/L乙醯丁香酮)中，28°C 振蕩培養過夜。將培養物於2800轉/分鐘，離心10分鐘收集菌體，重懸於 4。C預冷的液體MS培養基，並添加100mMol/L乙醯丁香酮，使OD6(X)=0.2， 得到重懸的菌液。
(3) 將預培養的休眠芽胚軸外植體浸浮在OD,二0.2的上述步驟(2) 中重懸的菌液中，使農桿菌與花生休眠芽胚軸外植體充分接觸進行轉化後， 間或輕輕搖動，接觸(轉化)時間為30分鐘，然後用鑷子輕輕夾起休眠芽 胚軸外植體，稍濾幹菌液，平鋪於共培養基上，於24'C, 16小時光照/8小 時黑暗的培養條件中進行共培養3天。
(4) 將共培養後的休眠芽胚軸外植體轉移至芽誘導培養基(MS+3mg/L 6-苄氨基嘌呤+300mg/L頭孢黴素)上誘導叢生芽，培養條件24°C， 16 小時光照/8小時黑暗，培養時間為5天。(5) 將芽誘導培養後的休眠芽胚軸外植體轉移至篩選培養基
(MS+3mg/L 6-節氨基嘌呤+300mg/L頭孢黴素+20mg/L潮黴素)上進行篩 選，每隔10天更換一次篩選培養基，共轉移2次。
(6) 將經過篩選培養的叢生芽轉移至生根培養基(1/2MS +3mg/L吲 哚丁酸+0.1mg/L奈乙酸)， 一周後即可生根。生根培養基上生長兩周後， 代根長至4 12釐米長。
(7) 將生根的植株移至高溼度(溼度為70 85%)的滅菌砂土中，用 透明的保鮮膜封好以保持溼度，於23 27"C下、相對溼度為75%、光照 強度為15Opmolm々s"、光周期為18 h的培養室培養1 2周。2 7d內 逐漸揭去保鮮膜使苗馴化。然後便可將其移入溫室生長、開花、結實。
圖3為本發明中的轉化方法轉化AhPR10基因的轉基因植株圖。如圖4 所示，為採用PCR方法對本實施例轉AhPR10基因的轉基因植株進行PCR 鑑定的PCR鑑定電泳圖。其中，Marker: DL2000; 1-5:不同轉化植株的
PCR鑑定結果。6:以非轉化植株為摸板的陰性對照；7:以PR10基因質粒
為模板的陽性對照；PCR引物為篩選標記基因hpt基因的特異性引物。
實施例二花生成熟種子休眠芽胚軸為外植體的農桿菌介導的遺傳轉 化方法用於百脈根LjCYC基因的轉化
(1) 選取成熟飽滿的花生種子，在超淨工作檯的無菌環境中，將花生 種子經0.1% (W/V)的升汞溶液表面消毒10分鐘，再用無菌水清洗3次。 用5(TC的溫水浸泡3小時後，除去種皮，用無菌解剖刀沿子葉間縫隙切開 種子，用解剖刀將完整的胚從子葉中剝離，切除胚根和芽原基，保留餘下 的花生成熟種子休眠芽胚軸部分作為待轉化的休眠芽胚軸外植體，並在預 培養基(固體MS+3mg/L6-苄氨基嘌呤)上預培養1天。
(2) 以百脈根LjCYC基因為待轉基因，採用實施例一相同的方法， 將LjCYC基因序列連入pCAMBIA1301載體，構建包含LjCYC基因的植 物表達載體pCAMBIA1301-LjCYC。將該載體導入農桿菌EHA105菌株， 將經鑑定為陽性的克隆按照l : 100的體積比接種至200ml YEB液體培養 液中(含有50 ug/ml慶大黴素，50ug/ml卡那黴素，100mMol/L乙醯丁香 酮)中，28"C振蕩培養過夜。將培養物於2800轉/分鐘，離心10分鐘收集 菌體，重懸於4。C預冷的液體MS+100mMol/L乙醯丁香酮培養基中，使OD600 =1.0。(3) 將預培養的休眠芽胚軸休眠芽胚軸浸浮在OD6=1.0的上述(2) 重懸好的菌液中，使農桿菌與花生休眠芽胚軸外植體充分接觸進行轉化後， 間或輕輕搖動，接觸(轉化)時間為15分鐘，然後用鑷子輕輕夾起休眠芽 胚軸外植體，稍濾幹菌液，平鋪於共培養基上，於28-C， 16小時光照/8小 時黑暗的培養條件中進行共培養2天。
(4) 將共培養後的休眠芽胚軸外植體轉移至芽誘導培養基(MS+3mg/L 6-苄氨基嘌呤+300mg/L頭孢黴素)上誘導叢生芽，培養條件28°C， 16 小時光照/8小時黑暗，培養時間為10天。
(5) 將芽誘導培養後的休眠芽胚軸外植體轉移至篩選培養基 (MS+3mg/L 6-苄氨基嘌呤+300mg/L頭孢黴素+20mg/L潮黴素)上進行篩 選，每隔10天更換一次篩選培養基，共轉移2次。
(6) 將經過篩選培養的叢生芽轉移至生根培養基(1/2MS +3mg/L吲 哚丁酸+0.1mg/L奈乙酸)， 一周後即可生根。生根培養基上生長四周後， 代根長至4 12釐米長。
(7) 將生根的植株移至高溼度(溼度為70 85%)的滅菌砂土中，用 透明的保鮮膜封好以保持溼度，於23 27"C下、相對溼度為75%、光照 強度為150Mmolm々s"、光周期為18 h的培養室培養1 2周。2 7 d內 逐漸揭去保鮮膜使苗馴化。然後便可將其移入溫室生長、開花、結實。
如圖5所示，為採用PCR方法對本實施例中轉LjCYC基因的轉基因植 株進行鑑定的PCR鑑定電泳圖。其中，Marker: DL2000; 1-3:不同轉化 植株的PCR鑑定結果。4:以非轉化植株為摸板的陰性對照；5:以LjCYC 基因質粒為模板的陽性對照；PCR引物為篩選標記基因hpt基因的特異性 引物。
實施例三以花生成熟種子休眠芽胚軸為外植體的農桿菌介導的遺傳 轉化方法用於大豆GmFAD3C基因的轉化
(1)選取成熟飽滿的花生種子，在超淨工作檯的無菌環境中，將花生 種子經0.1% (W/V)的升汞溶液表面消毒10分鐘，再用無菌水清洗3次。 用50'C的溫水浸泡3小時後，除去種皮，用無菌解剖刀沿子葉間縫隙切開 種子，用解剖刀將完整的胚從子葉中剝離，切除胚根和芽原基，保留餘下 的花生成熟種子休眠芽胚軸部分作為待轉化的休眠芽胚軸外植體，並在預培養基(固體MS+3mg/L6-苄氨基嘌呤)上預培養0.5 1天。
(2) 以大豆GmFAD3C基因為待轉基因，採用實施例一相同的方法， 將大豆GmFAD3C基因序列連入pCAMBIA1301載體，構建包含GmFAD3C 基因的植物表達載體pCAMBIA1301-GmFAD3C。將該載體導入農桿菌 EHA105菌株，將經鑑定為陽性的克隆按照1 : 100的體積比接種至200ml YEB液體培養液中(含有50 ug/ml慶大黴素，50 ug/ml卡那黴素，100mMol/L 乙醯丁香酮)中，28"振蕩培養過夜。將培養物於2800轉/分鐘，離心IO 分鐘收集菌體，重懸於4。C預冷的液體MS+100mMol/L乙醯丁香酮培養基 中，使OD6oo二1.5。
(3) 將預培養的休眠芽胚軸外植體浸浮在OD6。。=1.5的上述(2)重懸好 的菌液中，使農桿菌與花生休眠芽胚軸外植體充分接觸進行轉化後，間或 輕輕搖動，接觸(轉化)時間為5分鐘，然後用鑷子輕輕夾起休眠芽胚軸 外植體，稍濾幹菌液，平鋪於共培養基上，於26'C， 16小時光照/8小時黑 暗的培養條件中進行共培養4天。
(4) 將共培養後的休眠芽胚軸外植體轉移至芽誘導培養基(MS+3mg/L 6-苄氨基嘌呤+300mg/L頭孢黴素)上誘導叢生芽，培養條件26°C， 16 小時光照/8小時黑暗，培養時間為10天。
(5) 將芽誘導培養後的休眠芽胚軸外植體轉移至篩選培養基 (MS+3mg/L 6-節氨基嘌呤+300mg/L頭孢黴素+20mg/L潮黴素)上進行篩 選，每隔10天更換一次篩選培養基，共轉移3次。
(6) 將經過篩選培養的叢生芽轉移至生根培養基(1/2MS +3mg/L吲 哚丁酸+0.1mg/L奈乙酸)， 一周後即可生根。生根培養基上生長三周，代 根長至4 12釐米長。
(7) 將生根的植株移至高溼度(溼度為70 85%)的滅菌砂土中，用 透明的保鮮膜封好以保持溼度，於23 27"C下、相對溼度為75%、光照 強度為150Mmolm々s'1、光周期為18 h的培養室培養1 2周。2 7 d內 逐漸揭去保鮮膜使苗馴化。然後便可將其移入溫室生長、開花、結實。經 檢測，轉化效率達80%以上。
如圖6所示，為採用PCR方法對本實施例轉GmFAD3C基因的轉基因 植株進行鑑定的PCR鑑定電泳圖。其中，Marker: DL2000; 1-4:不同轉 化植株的PCR鑑定結果；PCR引物為篩選標記基因hpt基因的特異性引物,陽性對照和陰性對照結果未顯示。
上述實施例為本發明較佳的實施方式，但本發明的實施方式並不受上 述實施例的限制，其他的任何未背離本發明的精神實質與原理下所作的改 變、修—飾、替代、組合、簡化，均應為等效的置換方式，都包含在本發明 的保護範圍之內。
權利要求
1、一種以花生成熟種子休眠芽胚軸為外植體的農桿菌介導的遺傳轉化方法，其特徵在於包括如下步驟(1)轉化外植體分離消毒後的花生種子浸泡後，在無菌環境中除去花生種子皮，沿子葉間縫隙切開種子，將完整的胚從子葉中剝離，切除胚根和芽原基，保留餘下的花生成熟種子休眠芽胚軸部分作為待轉化的休眠芽胚軸外植體；將上述休眠芽胚軸外植體在預培養基上於24～28℃預培養0.5～1天，得到預培養後的休眠芽胚軸外植體；(2)侵染液製備將含待轉化質粒的農桿菌菌株接種至YEB液體培養液中，28℃振蕩培養過夜；將培養物離心收集農桿菌菌體，並重懸於預冷至4℃的含有100mMol/L乙醯丁香酮的液體MS培養基中，使農桿菌重懸液的濃度在OD600＝0.2～1.5，即得到含有農桿菌的液體MS培養基；(3)轉化將預培養後的休眠芽胚軸外植體浸浮在上述含有農桿菌的液體MS培養基中，使農桿菌與休眠芽胚軸外植體充分接觸5～30分鐘進行轉化後，取出休眠芽胚軸外植體，濾幹菌液後平鋪於共培養培養基於24～28℃，16小時光照/8小時黑暗的培養條件中，共培養2～4天，得到共培養後的休眠芽胚軸外植體；(4)芽誘導培養將共培養後的休眠芽胚軸外植體轉移至芽誘導培養基上誘導叢生芽；(5)篩選培養將芽誘導培養後的休眠芽胚軸外植體轉移至篩選培養基上進行篩選，每隔10天更換一次篩選培養基，共轉移2～3次，得到篩選培養的叢生芽；(6)生根培養將經過篩選培養的叢生芽轉移至生根培養基，在生根培養基上生長2～4周，代根長至4～12釐米長，得到生根的植株；(7)移植將步驟(6)中生根的植株移至溼度為70～85％的滅菌砂土中，培養馴化後；便可將其移入溫室生長、開花、結實；所述預培養基組成為固體MS+3mg/L 6-苄氨基嘌呤；所述共培養培養基組成為MS+3mg/L 6-苄氨基嘌呤+100uM乙醯丁香酮；所述芽誘導培養基組成為MS+3mg/L 6-苄氨基嘌呤+300mg/L頭孢黴素；所述篩選培養基組成為MS+3mg/L 6-苄氨基嘌呤+300mg/L頭孢黴素+20mg/L潮黴素；所述生根培養基組成為1/2MS+3mg/L吲哚丁酸+0.1mg/L奈乙酸。
2、 根據權利要求1所述的一種以花生成熟種子休眠芽胚軸為外植體的農杆 菌介導的遺傳轉化方法，其特徵在於所述步驟(1)中消毒是將成熟花生種子 經0.1%的升汞溶液表面消毒10分鐘，再用無菌水清洗3次。
3、 根據權利要求1所述的一種以花生成熟種子休眠芽胚軸為外植體的農杆 菌介導的遺傳轉化方法，其特徵在於所述步驟(1)中浸泡是在5(TC的溫水中 浸泡3小時。
4、 根據權利要求1所述的一種以花生成熟種子休眠芽胚軸為外植體的農杆 菌介導的遺傳轉化方法，其特徵在於所述步驟(2)中待轉化質粒為植物表達 載體 pCAMBIA1301-PR10 、 pCAMBIA1301-LjCYC 或 pCAMBIA1301 畫GmFAD3C。
5、 根據權利要求1所述的一種以花生成熟種子休眠芽胚軸為外植體的農杆 菌介導的遺傳轉化方法，其特徵在於所述步驟(2)中農桿菌為EHA105菌株。
6、 根據權利要求1所述的一種以花生成熟種子休眠芽胚軸為外植體的農杆 菌介導的遺傳轉化方法，其特徵在於所述步驟(4)中芽誘導培養條件為24 28°C， 16小時光照/8小時黑暗，培養時間為5 10天。
全文摘要
本發明公開了一種以花生成熟種子休眠芽胚軸為外植體的農桿菌介導的花生遺傳轉化方法，該方法以花生成熟種子休眠芽胚軸為外植體，經過預培養脫分化後，採用農桿菌介導的方法進行遺傳轉化。並通過優化芽誘導培養和生根培養過程，有效提高了轉化再生率和生根速度。本發明不依賴於基因槍等貴重儀器，不需要金粉等昂貴的實驗載體材料，僅需一個超浮工作檯以及相關農桿菌菌株就能在最簡單地實驗環境下實現花生成熟種子胚的休眠芽胚軸外植體的高效轉化，而且周期短，在不同基因型品種間的轉化效果穩定。
文檔編號C12N15/82GK101445808SQ20081021935
公開日2009年6月3日 申請日期2008年11月24日 優先權日2008年11月24日
發明者劉海燕, 梁炫強, 溫世傑 申請人:廣東省農業科學院作物研究所