一種磷細菌及利用該細菌生產微生物肥料菌種劑的方法
2023-06-09 14:27:11 1
專利名稱：一種磷細菌及利用該細菌生產微生物肥料菌種劑的方法
技術領域：
本發明所述的技術方案屬於農業肥料領域，具體的講，是屬於生物肥料領域中的微生物肥料領域，依據國際專利分類法，屬於C05F 11/08領域。
背景技術：
我國人口多、耕地少，且隨著人口增長、工業和城市的發展耕地逐年遞減。據有關部門統計，我國人口平均每年增加1600萬，而耕地每年減少400萬畝。1950年人口5.5億，耕地16.5億畝，人均耕地2.99畝，1980年人均耕地1.51畝，1990年人均耕地降到1.1畝，大大低於世界人均耕地4.03畝的水平，也低於亞洲人均耕地2.1畝的水平。為此，我國增加農產品產量的唯一可行途徑是提高單位面積產量。才能滿足工業發展和人口增加對農產品的需求，化肥也就順理成章的得到了廣泛應用。
長期以來不合理使用化學肥料帶來的土壤板結、地力下降、生態破壞、環境汙染以及農副產品品質下降問題，已經受到國家有關部門和農業科技界的高度重視。化肥的大量施用，造成了土壤肥力下降，土壤板結和農業生產成本不斷提高的弊病。近幾十年來，我國一直努力探索合理施肥、克服化肥的弊端及提高化肥利用率的有效途徑。
農業肥料包括化學肥料和生物肥料，是我國農業生產不可替代的重要生產資料。其中，生物肥料作為農業生物工程學科的重要分支和土壤肥料學的重要組成部分，近十年無論在基礎研究和應用研究方面都得到了迅速發展。而農業肥料中的微生物肥料(屬於生物肥料的一種)作為一種重要的農業技術措施在發展高產、優質、高效農業中的作用越來越被人們所認識，這給它的開發、推廣、應用提供了相當大的發展空間，特別是在發展有機農業、生產A級、AA級綠色食品中的不可替代性，充分體現了它潛在的魅力。
近幾年來我國微生物肥料發展很快，有多家企業從事生產經營，品種不斷增加，同時也有一些國外產品打入國內市場。由於菌種等原因，目前市場的產品質量參差不齊，生產應用上出現了一些問題。據最近幾年農業部監督抽查、跟蹤抽查，國家統檢的情況看，抽查合格率不到60％，產品質量問題主要是有效菌數不達標，保質期過短。微生物肥料中有效活菌數是產品質量的重要指標，有效活菌數不達標，產品質量就得不到保證，反映出來的是應用效果不穩定，其中原因主要是菌種問題，菌種在製備為微生物菌種劑後，在保藏過程中的存活能力下降，存活時間變短。在生產使用過程中表現為菌種活性下降，生產性能減弱，繁殖速度變慢，抗逆性差。因此，菌種問題一直困擾我國微生物肥料的生產和發展。在這樣的情況下，本發明提供的菌種和利用該菌種生產的微生物菌種劑可以非常好的解決菌數達標和保質期延長的問題，這使得本發明顯得十分重要和有意義。
發明內容
微生物肥料是以微生物生命活動的作用導致得到特定肥料效應的一種製品，是農業生產中所使用肥料的一種，與傳統化肥和有機肥在要領和內涵上有所不同。微生物肥料生產成本低，使用方便，應用效果好，不汙染環境，施用後不僅增產，而且能提高農產品質量和減少傳統化肥用量。微生物肥料是生產綠色食品的肥料，是保護綠色環境的肥料，是很有發展前途的肥料。目前該項目在我國正處於新的發展階段。
要解決的技術問題在國家有關部門充分重視使用化學肥料帶來的土壤板結、地力下降、生態破壞、環境汙染以及農副產品品質下降問題後，生物肥料中的微生物肥料得到了迅猛的發展，但是，由於菌種等原因，目前市場的產品質量參差不齊，在生產應用上出現了一些問題。據最近幾年農業部監督抽查、跟蹤抽查，國家統檢的情況看，抽查合格率不到60％，產品質量問題主要是有效菌數不達標，保質期過短。微生物肥料中有效活菌數是產品質量的重要指標，有效活菌數不達標，產品質量就得不到保證，反映出來的是應用效果不穩定、保質期短，其中原因主要是菌種問題，菌種在製備為微生物菌種劑後，在保藏過程中的存活能力下降，存活時間變短。這個問題實際上是由於這些微生物菌種劑所使用的菌種要麼不能產生芽孢，要麼產生芽孢的能力比較弱，或者產生的芽孢萌發能力差，不能很好度過微生物菌種劑生產過程中的脅迫條件和庫存、保藏過程，從而在生產使用過程中表現為菌種活性下降，生產性能減弱，繁殖速度變慢等等。菌種問題一直困擾我國微生物肥料的生產和發展。在這樣的情況下，本發明提供的新菌種和利用新技術方案生產的微生物菌種劑可以非常好的解決菌數達標和保質期延長的問題，這使得本發明顯得十分重要和有意義。
技術方案首先，需要明確的是本發明中提到的百分比和比例均是指重量百分比和重量比例。
本發明提供了一種解決上述問題的技術方案，具體的，本發明提供了一種微生物(蠟狀芽孢桿菌，Bacillus cereus)，具體的，菌種被命名為「新磷1號」(已於2004年4月15日在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，保藏號為CGMCC1132)，該微生物從高產農田中分離，並經馴化，長期以來性狀穩定。
該菌種的生物學特性為菌體杆狀，大小0.6-0.8*2-3微米，革蘭氏陽性，細胞原生質染色均勻，鞭毛側生，芽孢中生或偏中生，形狀柱形或橢圓形，不使菌體膨大，在牛肉蛋白腖培養基上菌落為乳白色，圓形，邊緣不規則毛狀突出，直徑1-2毫米。能利用多種氮源、碳源，生長溫度20-55℃最佳生長溫度37℃最適PH7.1。在不良條件下，菌體轉化為芽孢，芽孢對不良環境抗逆性強，可耐受100℃高溫和乾燥等惡劣條件。
申請人認為，因為菌種是新的，所以該菌種使用傳統的微生物菌種劑生產方法生產微生物菌種劑的技術方案具有新穎性，如果生產出的微生物菌種劑能夠克服上述的缺點(有效菌數不達標，保質期過短)，具有突出的特點和顯著的進步，就具有了創造性和實用性，具有了被授予專利權的基本條件。
傳統的微生物菌種劑生產中用到的培養基和培養方法在《磷細菌》(陳延偉等編，農業出版社，1959年，北京)一書中有詳細的描述。
同時，申請人在本發明中，對新磷1號的發酵條件進行摸索，得出了1個非常適用於該菌種的培養基和發酵條件(該培養基和發酵條件也適用於其他部分菌種)。申請人認為，因為菌種是新的，本發明提供的培養基和發酵條件也是新的，所以該菌種使用本發明提供的新的微生物發酵條件生產微生物菌種劑的技術方案具有新穎性，如果生產出的微生物菌種劑能夠克服上述的缺點(有效菌數不達標，保質期過短)，具有突出的特點和顯著的進步，就具有了創造性和實用性，具有了被授予專利權的基本條件。
該新的培養方案所使用到的培養基有新磷1號培養基(斜面培養基)蛋白腖5g/L，氯化鈉5g/L，牛肉膏5g/L，瓊脂1.5％-2.0％，PH調至6.5-7.8。
新磷1號液體培養基該培養基不含瓊脂，其他成分和含量與新1培養基相同，PH調至6.5-7.8。
新磷2號培養基澱粉5g/L，蔗糖1g/L，酵母浸出汁0.2g/L，蛋白腖5g/L，牛肉膏5g/L，硫酸氨1g/L，磷酸二氫鉀0.5g/L，硫酸鎂0.2g/L，氯化鈉5g/L，PH調至6.5-7.8。
新磷3號培養基澱粉10g/L，蔗糖5g/L，酵母浸出汁0.1g/L，蛋白腖0.5g/L，豆餅粉10g/L，硫酸氨1g/L，磷酸二氫鉀0.5g/L，氯化鈉5g/L，PH調至6.5-7.8。
新磷4號培養基澱粉10g/L，蔗糖2.5g/L，酵母浸出汁0.1g/L，蛋白腖0.5g/L，豆餅粉5g/L，硫酸氨1g/L，磷酸二氫鉀0.5g/L，氯化鈉5g/L，PH調至6.5-7.8。
以上所有培養基均在使用前經高壓蒸汽滅菌(121℃，1.1kg/cm3，30分鐘)，冷卻。
微生物菌種劑的具體生產方式一、菌種保藏及活化培養菌種以劃線培養的方式在新磷1號培養基(斜面培養基)上保藏，短期保藏條件為4℃，每2月活化1次；長期保藏條件為-20℃，每6個月活化1次。
二、微生物培養1、微生物培養(傳統微生物發酵生產方法)培養基澱粉3％，豆餅粉1％，蛋白腖0.1％，硫酸銨0.2％，磷酸氫二鉀0.2％，酵母粉0.1％，碳酸鈣0.01％，PH7.2-7.4。
將菌種活化後接入1000ml上述培養基中，三角瓶搖瓶160RPM 30-38℃培養16小時，然後按1％接種量接種到200L種子發酵罐中(仍為同種培養基)，通氣，30-38℃培養16小時，再按10％接種量接到2000L發酵罐中(仍為同種培養基)，30-38℃培養20小時後升溫至40-45℃在培養10小時，待80％菌體產生芽孢後停止發酵。
2、微生物培養(本發明提供的方法)1)自保存斜面取種後，劃線接入斜面培養基(新磷1號培養基)，30-38℃培養箱靜置黑暗條件下培養36小時；2)用無菌水衝洗斜面，形成菌懸液；3)將1體積菌懸液接入約20體積的新磷1號液體培養基中，30-38℃有氧培養至菌體濃度為108個/ml數量級；4)將步驟3)得到的菌懸液加入到約5-10倍體積的新磷2號培養基中，30-38℃有氧培養至菌體濃度為108個/ml數量級；5)將步驟4)得到的菌懸液加入到約100-200倍體積的新磷3號培養基中，35-38℃有氧培養至菌體濃度為108個/ml數量級；6)將步驟5)得到的菌懸液加入到約20-40倍體積的新磷4號培養基中，35-38℃培養有氧培養至菌體濃度為109個/ml數量級。
三、微生物菌種劑的生產將優質草炭粉(市售)進行乾熱滅菌後冷卻，根據想要得到微生物菌種劑中微生物的含量加入到發酵結束(傳統微生物發酵生產方法的或本發明提供的生產方法的)得到的發酵液中，進行充分攪拌，用造粒機造粒，低溫烘乾，包裝入庫成為微生物菌種劑產品，使用時根據需要與普通化肥或有機載體混合即可成為微生物肥料。
有益的效果使用本發明所提供的菌種生產的微生物菌種劑有較高的有效菌數和較長的保質期。
在本菌種使用傳統發酵方式進行發酵生產的菌種劑，入庫時進行有效菌數檢測，其結果明顯優於市售其他微生物菌種劑中的有效菌數，有效菌數是國家標準的3.2倍。解決了菌種數不達標的問題。
在本菌種使用本發明提供的發酵方式進行發酵生產的菌種劑入庫時進行有效菌數檢測，其結果明顯優於市售其他微生物菌種劑中的有效菌數，有效菌數是國家標準的3.7倍。也解決了菌種數不達標的問題。
本菌種使用傳統發酵方式進行發酵生產的菌種劑在倉庫中保存2年後，進行有效菌數檢測，其結果明顯優於市售其他微生物菌種劑中的有效菌數，有效菌數是國家標準的2.95倍。解決了保質期短的問題。
本菌種使用本發明提供的發酵方式進行發酵生產的菌種劑在倉庫中保存2年後，進行有效菌數檢測，其結果明顯優於市售其他微生物菌種劑中的有效菌數，有效菌數是國家標準的3.4倍。解決了保質期短的問題。
具體實施例方式
實施例1利用傳統方法對新磷1號進行發酵製備微生物菌種劑培養基澱粉3％，豆餅粉1％，蛋白腖0.1％，硫酸銨0.2％，磷酸氫二鉀0.2％，酵母粉0.1％，碳酸鈣0.01％，PH7.2-7.4。
將菌種活化後接入1000ml上述培養基中，三角瓶搖瓶160RPM 37℃培養16小時，然後按1％接種量接種到200L種子發酵罐中(仍為同種培養基)，通氣，37℃培養16小時，再按10％接種量接到2000L發酵罐中(仍為同種培養基)，37℃培養20小時後升溫至42℃在培養10小時，待80％菌體產生芽孢後停止發酵。檢測菌體濃度，達到109，然後按1∶4的重量百分比與進行乾熱滅菌後冷卻的優質草炭粉(市售)混合，再進行造粒，低溫烘乾成為微生物菌種劑。
實施例2利用本發明提供的方法對新磷1號進行發酵製備微生物菌種劑先對菌種進行活化，再用5ml無菌水衝洗斜面，形成菌懸液，菌懸液接入500ml三角瓶，該三角瓶含100ml新磷1號液體培養基，使用搖床培養18小時，培養條件為37℃，180-200rpm，檢測菌體濃度，在濃度達到108數量級，進行下一步；將500ml三角瓶中的100ml菌液轉接入2000ml三角瓶中，該三角瓶含700ml新磷2號培養基，使用搖床培養20小時，培養條件為37℃，180-200rpm；檢測菌體濃度，在濃度達到108數量級，進行下一步；將2000ml三角瓶中取出菌液接入1m3發酵罐中，接入量為3.5升，該發酵罐中含有500L新磷3號培養基，發酵條件為溫度36-38℃，罐壓0.5kg/cm，通氣量20m3/h，培養8小時；檢測菌體濃度，在濃度達到108數量級，進行下一步；將1m3發酵罐中的菌液取出接入5m3發酵罐，接入量為130升，該發酵罐含有3m3新4培養基，發酵條件為溫度36-38℃，罐壓0.5kg/cm，通氣量120m3/h，培養15小時。檢測菌體濃度，在濃度達到109數量級，停止發酵。然後按1∶4的比例與進行乾熱滅菌後冷卻的優質草炭粉(市售)混合，再進行造粒，低溫烘乾成為微生物菌種劑。
實施例3對利用傳統方法製備的微生物菌種劑在未長時間庫存的條件下進行菌數檢測按照常規的稀釋平板記數法檢測微生物菌種劑中的活菌含量。稱取微生物菌種劑1克(庫存半個月)，用無菌水溶解，用無菌水稀釋至菌體數為20-100個/ml，然後移取1ml稀釋液到無菌培養皿中，加入適量新磷1號培養基(斜面培養基)，充分混合後凝固，在37℃保溫箱中倒置培養48小時，統計平板上的菌落，重複三次以上，以平均值乘以該一克微生物菌種劑稀釋為菌體濃度為20-100個/ml時的毫升數即為每克微生物菌種劑的菌種數。我們對利用傳統方法製備的微生物菌種劑在未長時間庫存的條件下進行菌數檢測，檢測結果為6.4*108個/克，為國家標準的3.2倍(國家標準為2.0*108個/克)。解決了菌種劑微生物數目不達標的問題。
實施例4對利用本發明提供的方法製備的微生物菌種劑在未長時間庫存的條件下進行菌數檢測按照常規的稀釋平板記數法檢測微生物菌種劑中的活菌含量。稱取微生物菌種劑1克(庫存半個月)，用無菌水溶解，用無菌水稀釋至菌體數為20-100個/ml，然後移取1ml稀釋液到無菌培養皿中，加入適量新磷1號培養基(斜面培養基)，充分混合後凝固，在37℃保溫箱中倒置培養48小時，統計平板上的菌落，重複三次以上，以平均值乘以該一克微生物菌種劑稀釋為菌體濃度為20-100個/ml時的毫升數即為每克微生物菌種劑的菌種數。我們對利用本發明提供的方法製備的微生物菌種劑在未長時間庫存的條件下進行菌數檢測，檢測結果為7.4*108個/克個/克，為國家標準的3.7倍。解決了菌種劑微生物數目不達標的問題。
實施例5對利用傳統方法製備的微生物菌種劑在長時間庫存的條件下進行菌數檢測按照常規的稀釋平板記數法檢測微生物菌種劑中的活菌含量。稱取微生物菌種劑1克(庫存兩年)，用無菌水溶解，用無菌水稀釋至菌體數為20-100個/ml，然後移取1ml稀釋液到無菌培養皿中，加入適量新磷1號培養基(斜面培養基)，充分混合後凝固，在37℃保溫箱中倒置培養48小時，統計平板上的菌落，重複三次以上，以平均值乘以該一克微生物菌種劑稀釋為菌體濃度為20-100個/ml時的毫升數即為每克微生物菌種劑的菌種數。我們對利用傳統方法製備的微生物菌種劑在長時間庫存(兩年)的條件下進行菌數檢測，檢測結果為5.9*108個/克，為國家標準的2.95倍。解決了菌種劑微生物數目不達標的問題和保藏期太短的問題。
實施例6對利用本發明提供的方法製備的微生物菌種劑在長時間庫存的條件下進行菌數檢測按照常規的稀釋平板記數法檢測微生物菌種劑中的活菌含量。稱取微生物菌種劑1克(庫存兩年)，用無菌水溶解，用無菌水稀釋至菌體數為20-100個/ml，然後移取1ml稀釋液到無菌培養皿中，加入適量新磷1號培養基(斜面培養基)，充分混合後凝固，在37℃保溫箱中倒置培養48小時，統計平板上的菌落，重複三次以上，以平均值乘以該一克微生物菌種劑稀釋為菌體濃度為20-100個/ml時的毫升數即為每克微生物菌種劑的菌種數。我們對利用本發明提供的方法製備的微生物菌種劑在長時問庫存(兩年)的條件下進行菌數檢測，檢測結果為6.8*108個/克，為國家標準的3.4倍。解決了菌種劑微生物數目不達標的問題和保藏期太短的問題。
實施例7未長期庫存的微生物菌種劑與肥料混合後使用的效果將雞糞、粉碎玉米芯、煤渣以1∶2∶3重量百分比混合均勻，調整含水量為30％，在溫度大於30℃的條件下堆積7-10天，把庫存半個月的微生物菌種劑與之以1∶9的重量百分比混合，製成微生物肥料。
將製成的微生物肥料在不同作物上進行與基質肥以及等價常規肥比較的小區肥效實驗，小區面積0.16畝，實驗設3個重複。實驗時每畝施微生物肥料25公斤；基質肥(經由雞糞、粉碎玉米芯、煤渣以1∶2∶3重量百分比混合均勻，調整含水量為30％後，在溫度大於30℃的條件下堆積7-10天製成)每畝施25公斤；等價常規肥(磷酸二氨∶尿素∶氯化鉀為3∶3∶2混合)每畝施25公斤。均作為基肥，一次施完，不追加。空白對照不施肥。
實驗結果如下(數據均為各肥料相對於空白對照的增產百分比)
結果表明，該微生物菌種劑能夠很好發揮作用，具有良好的增產效果。
實施例8長期庫存(兩年)的微生物菌種劑與肥料混合後使用的效果將雞糞、粉碎玉米芯、煤渣以1∶2∶3重量百分比混合均勻，調整含水量為30％，在溫度大於30℃的條件下堆積7-10天，把庫存兩年的微生物菌種劑與之以1∶9的重量百分比混合，製成微生物肥料。
將製成的微生物肥料在不同作物上進行與基質肥以及等價常規肥比較的小區肥效實驗，小區面積0.16畝，實驗設3個重複。實驗時每畝施微生物肥料25公斤；基質肥(經由雞糞、粉碎玉米芯、煤渣以1∶2∶3重量百分比混合均勻，調整含水量為30％後，在溫度大於30℃的條件下堆積7-10天製成)每畝施25公斤；等價常規施肥(磷酸二氨∶尿素∶氯化磷為3∶3∶2混合)每畝施25公斤。均作為基肥，一次施完，不追加。空白對照不施肥。
實驗結果如下(數據均為各肥料相對於空白對照的增產百分比)
結果表明，該微生物菌種劑能夠很好的解決保質期問題，由它製備的肥料相對於未長期保存的微生物菌種劑製備的肥料在使用效果上沒有顯著差別，解決了本發明想要解決的問題。
權利要求
1.一種磷細菌，其特徵在於它在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心的保藏號為CGMCC1132。
2.一種磷細菌微生物菌種劑，其特徵在於該菌種劑含有權利要求1所述的磷細菌。
3.權利要求2所述的磷細菌微生物菌種劑，其特徵在於它由權利要求1所述的磷細菌經過公知的微生物發酵方法進行發酵並進一步加工製成。
4.權利要求2所述的磷細菌微生物菌種劑，其特徵在於它由權利要求1所述的磷細菌經過本發明提供的微生物發酵方法進行發酵並進一步加工製成。
5.一種微生物肥料，其特徵在於該肥料含有權利要求1所述的磷細菌。
6.權利要求5所述的微生物肥料，其特徵在於它是由權利要求2或3或4所述的磷細菌微生物菌種劑經過進一步加工，與公知化肥和或有機載體混合而成。
7.一種生產微生物菌種劑的方法，其特徵在於使用了權利要求1所述的磷細菌進行發酵。
8.權利要求7所述的方法，其特徵在於對權利要求1所述的磷細菌的發酵是以公知的發酵方法進行的。
9.權利要求7所述的方法，其特徵在於對權利要求1所述的磷細菌的發酵是以本發明提供的發酵方法進行的。
10.一種生產微生物肥料的方法，其特徵在於使用了權利要求1所述的磷細菌。
11.權利要求10所述的方法，其特徵在於它是由權利要求2或3或4所述的磷細菌微生物菌種劑經過進一步加工，與公知化肥和或有機載體混合而成。
全文摘要
本發明所述的技術方案屬於生物肥料領域中的微生物肥料領域。最近幾年，微生物肥料，據國家統檢，抽查合格率不到60％，產品質量問題主要是有效菌數不達標，保質期過短。菌種在製備為微生物菌種劑後，在保藏過程中的存活能力下降、存活時間變短。在生產使用過程中表現為菌種活性下降，生產性能減弱，繁殖速度變慢，抗逆性差。菌種問題一直困擾微生物肥料的發展。本發明提供的新磷菌種和利用新技術方案生產的微生物菌種劑可以非常好的解決菌種數達標和保質期延長的問題，這使得本發明顯得十分重要和有意義。
文檔編號C12N1/20GK1624110SQ20041008885
公開日2005年6月8日 申請日期2004年11月8日 優先權日2004年11月8日
發明者麻林濤, 王莉 申請人:麻林濤, 王莉