敬釗纓毛蜘蛛毒素提取物—敬釗毒素—v在製備鎮痛藥物中的應用的製作方法

2023-06-09 11:02:46

專利名稱：敬釗纓毛蜘蛛毒素提取物—敬釗毒素—v在製備鎮痛藥物中的應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種多肽活性物質在醫用配製品中的用途，尤其是敬釗纓毛蜘
蛛毒素提取物 一 敬釗毒素一 v在製備鎮痛藥物中的用途。
背景技術：
ZL200610031864.5號專利申請公開了從敬釗纓毛蜘蛛粗毒中提取分離出新 型神經毒素一敬釗毒素一V (簡稱敬釗鎮痛肽)的方法。敬釗鎮痛肽是一種新型 哺乳動物神經毒素，其化學結構為由29個胺基酸殘基以特定的順序組成的多肽， 含有三對鏈內二硫鍵，其化學結構如下式
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發明內容
本發明的目的旨在提供敬釗纓毛蜘蛛毒素提取物一敬釗毒素一v在製備鎮
痛藥物中的應用，這種鎮痛藥物既能夠明顯減輕病人的疼痛，且沒有類似嗎啡 的成癮毒副作用。
本發明所述的敬釗鎮痛肽的化學結構式如圖l所示，其中Y為酪氨酸，C為 半胱氨酸，Q為穀氨酸，K為賴氨酸，W為色氨酸，M為甲硫氨酸，T為蘇氨 酸，D為天門冬氨酸，S為絲氨酸，R為精氨酸，A為丙氨酸，E為穀氨酸，G 為甘氨酸，L為亮氨酸，I為異亮氨酸。敬釗鎮痛肽可作為單一有效活性組份用 於製備鎮痛藥物。
鎮痛藥物是一類能夠減輕疾病痛苦的物質，不僅能夠選擇性地減輕或緩解 疼痛感覺，也可以緩解因劇烈疼痛而引起的恐懼、緊張及焦慮等不愉快的情緒。 目前的鎮痛藥物可以分為解熱鎮痛藥和麻醉性鎮痛藥物兩類，前者以阿斯匹林 為代表，通過對組織中前列腺素合成過程的抑制作用，減輕神經末梢對致痛物質的敏感性，主要用於解除炎症性疼痛和其他鈍疼；後者以嗎啡為代表，其作 用部位主要在丘腦和皮層，作用於中樞神經系統中的p-型阿片受體，以緩解銳痛、 鈍痛和內臟絞痛，從而產生鎮痛作用，主要用於各種疾病所引起的疼痛和手術 後病人的嚴重疼痛，特別是晚期癌症疼痛。但是目前這種以嗎啡為代表的麻醉 性鎮痛藥物存在成癮性強，戒斷症狀嚴重，病人必須不斷增加劑量才能維持鎮 痛效果，而且最終導致對這類藥物失效，同時對神經損傷性疼痛無療效等主要 缺點。
本發明的敬釗鎮痛肽是通過與特異性分布於外周神經元上的河豚毒素不敏
感型鈉離子通道亞型(Navl.8、 Navl.9)以及河豚毒素敏感型鈉離子通道亞型 Navl.7結合，抑制相關的電壓門控鈉離子通道電流而阻斷痛覺神經信號的傳導， 因此具有明顯的鎮痛作用，但沒有明顯的毒副作用。


下面將結合附圖與動物藥理實驗對本發明作進一步的詳細說明。 圖1敬釗鎮痛肽的化學結構。
圖2敬釗鎮痛5太硬l莫外注射對福馬林所致大鼠強直性疼痛的鎮痛作用。 圖3肌肉注射敬釗鎮痛肽對福馬林所致大鼠強直性疼痛的鎮痛作用。 圖4肌肉注射敬釗鎮痛肽對手術後疼痛的鎮痛作用。
具體實施例方式
為了更好的理解和更充分的公開本發明，下面將通過大鼠硬膜外注射與肌 肉注射兩種用藥途徑，採用大鼠福馬林致炎疼痛實驗動物模型與手術後實驗 動物疼痛模型來說明敬釗鎮痛肽的鎮痛作用。
實驗1:硬膜外注射敬釗鎮痛肽對福馬林所致大鼠強直性疼痛的鎮痛作用。
1)實驗用主要原料實驗用敬釗鎮痛肽是從敬釗纓毛蜘蛛粗毒中分離純化 而得到，同時通過HPLC和MALDI-TOF質譜儀鑑定，其純度為98%以上；PE-10 型聚乙烯管為美國Befon-Dickson公司生產；SD實驗大鼠由中南大學湘雅醫學 院動物房提供，體重180-220g之間，肌注生理鹽水與肌注嗎啡均購自湖南師範 大學校醫院。2) 給藥途徑硬膜外注射是目前手術後病人與晚期癌症病人進行鎮痛的常
用給藥方式，該方式具有有效作用集中持久，毒副作用小等優點。
具體操作如下手術前先用鹽酸氯胺酮0.4-0.6ml麻醉大鼠，剪掉兩耳後方
的毛，酒精棉消毒，然後切開大鼠頸後部皮膚，依次分離肌層，暴露出寰枕膜, 用五號針挑開寰枕膜與第一頸椎之間的結膜，但不挑破寰枕膜，然後將早已準
備好的PE-10聚乙烯管插入硬膜外腔，插入深度為7.5 cm，直達腰膨大處，插管 方法與Yaksh等人報導的方法相一致，在管的開口處預先用封口膜纏一小結球 以確定插入深度，縫合小球固定在頸背肌。用火星封暴露在外的PE-10管口以 防感染。手術口塗碘酒消毒。手術後注射20萬單位青黴素鈉消炎。實驗結束後， 注入10 |iL滂胺天蘭染料，解剖後觀察插管位置是否正確。術後動物均單籠飼 養，恢復一周，選擇狀態正常大鼠分為6組，每組IO只，分別是生理鹽水對照 組，嗎啡陽性對照組和4個敬釗鎮痛肽溶液劑量組。
3) 大鼠福馬林致炎疼痛模型的建立在大鼠爪蹠部皮下注射稀釋的福爾 馬林(1%-5%)後，實驗動物會出現舔、咬注射的足爪和抬腿等行為反應，並 呈現兩個反應時相注射後立即產生的早時相(持續5-10min)和注射後15-60 min的遲時相，前者是基於化學刺激直接興奮傷害性感受器，而後者包含組織痛 機理。 ，
4) 藥物劑量設置:被試藥物敬釗鎮痛肽設置四個劑量組，分別為10.0 )Ig/kg、
25.0 ng/kg、 50.0 pg/kg和75.0 fig/kg體重，陽性對照藥物鹽酸嗎啡的劑量組為 25.0 pg/kg體重，陰性對照為生理鹽水，其注入硬脊膜外腔容量同以上測試藥物， 均按1.0)iiL/10g體重(鼠)計算，給藥次數為測定鎮痛前30min給藥。
5) 實驗結果與分析
參照Lewis和Kellgren等的方法，實驗在大鼠插管手術後第五天進行，此 時動物已處於完全清醒的正常狀態，對有運動功能障礙者予以剔除。實驗時室 溫25'C，溼度40-60%。實驗時間9 : 00—18 : 00，隔絕噪音。實驗大鼠在試驗 開始前3天被放置在觀察室(一個20x20x30有機玻璃盒，並提供足夠食物及飲 水)中每天至少30min，使其適應實驗環境，消除恐懼及不安。大鼠實驗前至少 在觀察室內再適應30min，然後經留置的導管向硬膜外腔給藥敬釗鎮痛肽、鹽酸 嗎啡或生理鹽水。給藥30 min後在大鼠後腳掌皮下注射5%福馬林液50 |iiL， 立即進行測試，記錄每個5min內足底皮下注射了福馬林液的大鼠行為表現的 疼痛評分值(S).福馬林的致痛定量是以消耗在不同行為狀態的總時間來衡量的，不同的行為狀態是指動物舔、咬、搖被注射的足或減輕在被注射足上所承
受重量的各種行為表現，測定時間持續60min。疼痛評估曲線見圖2。圖中縱坐 標每一個點代表鼠後肢足底皮下注射福馬林液後，每5 min內大鼠疼痛評分值 (S)。橫坐標每個點代表每5min時間間隔。由圖中可見各組實驗大鼠足底皮 下注射福馬林後，疼痛反應均呈典型二相反應。第一相反應(急痛)在注射 後立即開始，持續約5-10min。接著15-20min，鼠很少有提示傷害性作用的行為。 第二相反應(慢痛)大約在注射福馬林後20-25min開始，持續到測痛結束。
與生理鹽水對照，4個不同劑量的敬釗鎮痛肽對福馬林所致大鼠強直性疼 痛均有明顯鎮痛效應，其鎮痛效應隨敬釗鎮痛肽的劑量遞增呈正相關，用藥後 30 min鎮痛效果最強，鎮痛作用可以持續近60 min。其中，硬膜外注射75.0 pg/kg 敬釗鎮痛肽的作用效果與注射25.0 pg/kg嗎啡的鎮痛效果無顯著性差異。所有實 驗動物用藥後，均未呈現任何明顯的毒副作用症狀，並且全部沒有後遺症。
實驗2:肌肉注射敬釗鎮痛肽對福馬林所致大鼠強直性疼痛的鎮痛作用
1) 實驗用主要原料實驗用敬釗鎮痛肽是從敬釗纓毛蜘蛛粗毒中分離純化 而得到，同時通過HPLC和MALDI-TOF質譜儀鑑定，其純度為98%以上；SD 實驗大鼠由中南大學湘雅醫學院動物房提供，體重180-220g之間，肌注生理鹽
水與肌注嗎啡均購自湖南師範大學校醫院。
2) 肌肉注射給藥途徑首先用75%的酒精對大鼠一側大腿進行消毒處理， 然後從大腿外側距膝蓋骨2/3處由後向前進針，進針角度以30度為宜，刺入肌 肉大約0.5cm即可，注意不要刺入太深，以免刺傷骨頭。
3) 大鼠福馬林致炎疼痛模^的建立在大鼠爪蹠部皮下注射稀釋的福爾 馬林(1°/。-5%)後，實驗動物會出現舔、咬注射的足爪和抬腿等行為反應，並 呈現兩個反應時相注射後立即產生的早時相(持續5-10min)和注射後15-60 min的遲時相，前者是基於化學刺激直接興奮傷害性感受器，而後者包含組織痛 機理。
4) 實驗分組與藥物劑量敬釗鎮痛肽實驗動物數為10隻一組，肌肉注射 敬釗鎮痛肽的劑量為500 pg/kg，空白實驗對照組動物數為10隻，肌肉注射生理 鹽水的劑量為1.0^L/g，陽性實驗對照組動物數為IO只，肌肉注射嗎啡的劑量 為500.0 |ag/kg。
5) 實驗結果與分析
給藥30 min後在大鼠後腳掌皮下注射5。/。福馬林液50 pL，立即進行測 試，記錄每個5min內足底皮下注射了福馬林液的大鼠行為表現的疼痛評分值(S)福馬林的致痛定量是以消耗在不同行為狀態的總時間來衡量的，不同的 行為狀態是指動物舔、咬、搖被注射的足或減輕在被注射足上所承受重量的各
種行為表現，測定時間持續60min。疼痛評估曲線見圖3，圖中縱坐標每一個點 代表鼠後肢足底皮下注射福馬林液後，每5min內大鼠疼痛評分值(S)。橫坐 標每個點代表每5 min時間間隔。實驗顯示，與肌肉注射生理鹽水實驗組相比較， 肌肉注射500 pg/kg的敬釗鎮痛肽具有明顯的鎮痛效果，且在實驗過程中，未發 現有任何明顯的毒副作用，並且全部沒有後遺症。而肌肉注射嗎啡與生理鹽水 組相比較，鎮痛效果不明顯，證明肌肉注射等劑量嗎啡的鎮痛效果比注射敬釗 鎮痛肽的鎮痛作用要弱得多，這與硬膜外給藥途徑的實驗結果是非常吻合的。 實驗3:肌肉注射敬釗鎮痛肽對手術後疼痛的鎮痛作用
1) 實驗用主要原料實驗用敬釗鎮痛肽是從敬釗纓毛蜘蛛粗毒中分離純化
而得到，同時通過HPLC和MALDI-TOF質譜儀鑑定，其純度為98%以上；SD 實驗大鼠由中南大學湘雅醫學院動物房提供，體重180-220g之間，肌注生理鹽
水與肌注嗎啡均購自湖南師範大學校醫院。
2) 肌肉注射給藥途徑首先用75%的酒精對大鼠一側大腿進行消毒處理， 然後從大腿外側距膝蓋骨2/3處由後向前進針，進針角度以30度為宜，刺入肌 肉大約0.5cm即可，注意不要刺入太深，以免剌傷骨頭。
3) 手術後疼痛實驗動物模型參照Yong-Xiang Wang(pain 84(2000): 151-158) 的方法進行。先將大鼠稱重後，用乙醚進行快速麻醉。將左足消毒後切開1.0 cm 長的創口，並確保只切開肌肉，而儘量避開大的血管，手術完畢後縫合2針。 大鼠很快就會甦醒，待手術後1.5小時就可以開始進行疼痛測定實驗。
4) 機械刺激測痛法參照陳軍(Pain,1999,83:67-76)等的方法將大鼠放 在一鐵絲網架上，用有機玻璃(20x20x25 cm)罩住，讓大鼠活動30分鐘直至 安靜，然後用一套(10根)10種不同內徑的Von Frey尼龍絲，它們分別代表 IO種不同的力量，彎曲力量範圍是0.06-34.9g，其中1 10號代表的力量分別為 34.9g、 26.2g、 14.8g、 8.1g、 4.85g、 0.77g、 0.43g、 0.25g、 O.llg、 0.06g。
實驗開始時用Von Frey尼龍絲從鐵絲網下方刺激大鼠手術後足底的不同位
點，每一根Von Frey尼龍絲刺激10次(每次3—4秒)，能讓大鼠產生50%的
縮腿率的那一根絲被認為是它的機械誘發痛域，痛域大於39.4g的被認為是無反應。
5) 實驗分組與藥物劑量敬釗鎮痛肽實驗動物數為10隻一組，肌肉注射 敬釗鎮痛肽的劑量為500.0 Mg/kg，空白實驗對照組動物數為10隻，肌肉注射生 理鹽水的劑量為1.0 mL/kg，陽性實驗對照組動物數為IO只，肌肉注射嗎啡的劑量為500.0嗎/kg。
6)實驗結果與分析
從圖4的實驗結果顯示，比較肌肉注射嗎啡的陽性實驗對照組與注射生理 鹽水的陰性實驗對照組，發現肌肉注射嗎啡能使手術後0.5-2.5 h痛域值積分顯 著下降，統計學顯示具有極顯著差異，說明手術後疼痛的實驗模型是成功的。 其中注射敬釗鎮痛肽的實驗動物在給藥後l-4.5h會產生鎮痛作用，但與注射嗎 啡的實驗動物組相比較發現，敬釗鎮痛肽對手術後疼痛的肌肉注射的鎮痛效果 比嗎啡弱，手術後0.5-1.5小時之間兩者具有顯著性差異，但從作用時間來看， 敬釗鎮痛肽的作用時間要優於嗎啡，持續時間長，而且在肌肉注射敬釗鎮痛肽 的實驗過程中沒有發現任何明顯的毒副作用，並且全部沒有後遺症。
本文中所述的敬釗纓毛蜘蛛毒素提取物一敬釗毒素一V與敬釗鎮痛肽具有 相同的含義。
權利要求
1、一種敬釗纓毛蜘蛛毒素提取物—敬釗毒素—V在製備鎮痛藥物中的應用，所述的敬釗纓毛蜘蛛毒素提取物—敬釗毒素—V的化學結構式為其中Y為酪氨酸，C為半胱氨酸，Q為穀氨酸，K為賴氨酸，W為色氨酸，M為甲硫氨酸，T為蘇氨酸，D為天門冬氨酸，S為絲氨酸，R為精氨酸，A為丙氨酸，E為穀氨酸，G為甘氨酸，L為亮氨酸，I為異亮氨酸，其特徵在於敬釗纓毛蜘蛛毒素提取物—敬釗毒素—V作為單一有效活性組份用於製備鎮痛藥物。
全文摘要
一種敬釗纓毛蜘蛛毒素提取物—敬釗毒素—V在製備鎮痛藥物中的應用，特別是敬釗纓毛蜘蛛毒素提取物—敬釗毒素—V作為單一有效活性組份用於製備鎮痛藥物。由於敬釗鎮痛肽是通過與分布於外周神經元上的河豚毒素不敏感型鈉離子通道亞型(Nav1.8、Nav1.9)以及河豚毒素敏感型鈉離子通道亞型Nav1.7結合，抑制相關的電壓門控鈉離子通道電流而阻斷痛覺神經信號的傳導，因此具有明顯的鎮痛作用，且沒有明顯的毒副作用。可製備治療癌症、愛滋病、術中與術後、風溼與類風溼關節炎、坐骨神經與三叉神經性疼痛等病人的鎮痛藥。
文檔編號A61P29/00GK101428138SQ20081021806
公開日2009年5月13日 申請日期2008年12月4日 優先權日2008年12月4日
發明者嚴陸根, 鵬 劉, 劉中華, 曾雄智, 梁宋平, 冉 王, 曦 陳 申請人:深圳金蜘蛛生物科技有限公司