一種葉酸-羧甲基殼聚糖修飾pH敏感多柔比星納米脂質體的製作方法

2023-06-10 05:54:31 3

專利名稱：一種葉酸-羧甲基殼聚糖修飾pH敏感多柔比星納米脂質體的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種葉酸-羧甲基殼聚糖修飾PH敏感多柔比星納米脂質體及其製備方法。
背景技術：
多柔比星(Doxorubicin)，又俗稱阿黴素，羥柔紅黴素，是臨床上常用的抗生素類抗腫瘤藥，抗癌譜廣，療效廣，可治療多種腫瘤，但該藥對心臟具有嚴重的毒副作用，尤其是嚴重的心臟損害，骨髓抑制等副反應限制了它在臨床上的應用。多年來，各國科學家一直在尋找著降低其毒副反應的有效方法，如調整給藥方案，研製心臟毒性低的阿黴素類似物，聯合用藥以及改變藥物劑型的方式來減輕其嚴重的心臟毒性。脂質體包裹阿黴素比 Sf I^MlJ^ 50-70% (Budai M, et al. Liposomes as drug carrier systems preparation, classification and therapeutic advantages of liposomes. Acta Pharm Hung. ,2001,71(1) :114-8.)但是脂質體由於其易被巨噬細胞吞噬，在正常組織中的含量依然很高，為了進一步降低阿黴素脂質體的藥物毒性，利用靶向物質或粒子對脂質體表面或內部進行修飾，使得脂質體克服藥物在體內輸送過程中所遇到的各種生理屏障，將藥物送到特定的靶位，提高藥物的靶向性。PH敏感性脂質體就是其中的一種，利用腫瘤組織在局部缺血時，腫瘤間質液會出現異常酸化現象，PH值比正常組織低，利用這一特性科學家採用了不同方法進行了表面修飾，如在脂質體表面嫁接具有PH敏感的生物高分子材料或使用具有PH敏感性的磷脂材料來製備脂質體。羧甲基殼聚糖(CMCT)是殼聚糖經羧甲基化反應後生成的一種水溶性衍生物，其性質穩定，生物相容性和可降解性好，毒性較小。它既含有弱鹼陽離子(-NH3+)基團，又含有弱酸陰離子(-COO—)基團，是一種兩親性聚電解質。由於其具有PH敏感，在不同的pH值條件下，其鏈段的構象不同，利用這一特性，將羧甲基殼聚糖修飾到脂質體表面，使得在不同PH 值下由於構象不同其作用力將脂質體內包裹的藥物釋放，達到PH敏感。仝新勇等(羧甲基殼聚糖修飾對紫杉醇自組裝前體脂質體大鼠體內組織分布的影響.中國天然藥物，2007， 5(1) :45-49)利用這一規律進行了紫杉醇脂質體的修飾並對其藥代分布進行了研究，研究結果表明，在添加羧甲基殼聚糖進行表面修飾後，大鼠的體內配置發生了明顯的變化，肝、 脾、肺、卵巢、子宮等的藥物攝取量明顯增加。納米級藥物載體的靶向形式以被動靶向為主，即利用載體的疏水性(或親水性)、 靜電作用、載體的大小、質量、PH值等理化因素容易被位於肝、脾、肺及骨髓的單核、巨嗜細胞系統攝取，增強抗腫瘤藥物對位於單核吞噬細胞系統的腫瘤的化療效果。為了加強靶向作用，可以設計具有主動靶向作用的納米粒，通過靶向分子與細胞表面特異性受體結合，使藥物能夠準確送到腫瘤細胞中，實現惡性腫瘤的靶向治療。由於葉酸受體在腫瘤細胞外膜的過度表達，已經確知腫瘤細胞與葉酸之間有特殊的密切關係。當葉酸通過側基連接於羧甲基殼聚糖的羧基(葉酸-羧甲基殼聚糖)，其依舊保持正常的受體親和力，因此可以通過受體胞吞作用被內在化。且葉酸受體在多種人類腫瘤細胞的過度表達也為特效藥物對腫瘤的靶向提供了一種有效方式(Sumanta K.，et al. In vitro evaluation of folic acid modified carboxymethyl chitosan nanoparticles loaded with doxorubicin for targeted delivery. J Mater Sci =Mater Med, 2010, 21 :1587—1597.)。葉酸受體介導的細胞攝粒過程，也就是葉酸的選擇性主動靶向作用。先由羧甲基殼聚糖的Ph敏感性將載藥脂質體靶向至患病部位，再經葉酸與細胞表面的特異性受體結合使藥物精確定位，使更多的載藥納米粒進入細胞，增強藥物利用率，同時降低藥物對正常細胞的傷害。

發明內容
本發明的目的是公開一種葉酸-羧甲基殼聚糖修飾PH敏感納米多柔比星脂質體及其製備方法。葉酸-羧甲基殼聚糖修飾PH敏感納米多柔比星脂質體由鹽酸多柔比星、卵磷脂、膽固醇、維生素E、葉酸-羧甲基殼聚糖等作為組分製備而成。本發明葉酸-羧甲基殼聚糖修飾pH敏感納米多柔比星脂質體，由下列質量分數比的組分組成
鹽酸多柔比星3.2-16 份卵磷脂16-80 份膽固醇4-20 份維生素E0.16-0.8 份葉酸-羧甲基殼聚糖1-5份緩衝液800-1000 份
其中，優選的是由下列質量份數比的成分組成
鹽酸多柔比星卵磷脂膽固醇維生素E
葉酸-羧甲基殼聚糖緩衝液
本發明葉酸-羧甲基殼聚糖修飾PH敏感納米多柔比
4-12 份 20-60 份 4-15 份 0.2-0.6 份 1.25-3.75 份 800-1000 份
匿脂質體的製備包括以下步 驟(1)按配方稱取相應的磷脂、膽固醇和維生素E放入適當容器中，然後加入無水乙醇超聲震蕩溶解成溶液，將此溶液轉入旋轉蒸發器中；在40°C水浴旋轉蒸發去除有機溶劑，成膜；加入緩衝溶液(pH = 4. 0)進行洗膜、水化，間隔0.證超聲一次，水化池，製得空白脂質體；(2)將製備的空白脂質體用超聲細胞粉碎機間隙超聲或高壓均質製得納米級的空白脂質體，過0. 22 μ m濾膜得到粒徑均一的空白納米脂質體；
(3)用緩衝溶液(pH = 8.0)調節空白納米脂質體的外水相pH值至6. 8-7. 4後，再加入溶有鹽酸多柔比星的等滲氯化鈉溶液，通過PH梯度法將鹽酸多柔比星載入空白納米脂質體中，在37°C水浴下水合池，製得鹽酸多柔比星脂質體；(4)將葉酸-羧甲基殼聚糖溶液加入到鹽酸多柔比星脂質體中，在37°C水浴下水合0. 5h,製得葉酸-羧甲基殼聚糖修飾pH敏感納米多柔比星脂質體。所述的卵磷脂選自蛋黃卵磷脂、大豆卵磷脂、氫化大豆卵磷脂或氫化蛋黃卵磷脂。所述的羧甲基殼聚糖的羧甲基取代度為0. 6-1. 2，分子量為3000-100000 ；所述的葉酸-羧甲基殼聚糖是由葉酸在N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)與碳二亞胺鹽酸鹽(EDOHCl) 存在的條件下室溫活化池後，再與羧甲基殼聚糖反應生成的。所述的緩衝液選自磷酸鹽緩衝溶液或0. 9%氯化鈉的生理鹽水。所述的細胞粉碎機間歇超聲空白脂質體的優化功率為200-300W，間隙時間5s，超聲時間3s，工作時間為30min ；或採用高壓均質的優化壓力參數為40_90MPa，循環次數為 6-15 次。採用本發明的方法，可以製備小粒徑、性能穩定的葉酸-羧甲基殼聚糖修飾pH敏感納米多柔比星脂質體製劑，葉酸-羧甲基殼聚糖的修飾可以使其具備PH敏感性、腫瘤靶向性，並延長其體內長循環性能。本發明採用無水乙醇作為有機溶劑，排除了文獻中使用的毒性較大的有機溶劑氯仿或甲醇的殘留，減少了環境汙染，降低了生產成本，更適合工業化生產。


圖1為葉酸-羧甲基殼聚糖的傅立葉紅外譜圖。圖2為葉酸-羧甲基殼聚糖修飾多柔比星納米脂質體在不同PH緩衝液中的藥物釋放率圖。
具體實施例方式通過下面實施例說明本發明的具體實施方式
，但本發明的保護範圍，不局限於此。實施例1在無菌條件下取注射用大豆卵磷脂2g，膽固醇0. 5g，維生素E 0. 025g。將上述物料置於適當容器中，加入無水乙醇IOOml超聲震蕩至完全溶解成溶液，將上述溶液轉移至梨形瓶中，在恆溫水浴中減壓旋轉蒸發至形成透明淡黃色薄膜。取PBS(pH = 4.0)緩衝溶液IOOml洗脫，緩緩洗膜。洗膜後用超聲細胞粉碎機在功率為200-300W，間隙時間5s，超聲時間3s，工作時間為30min超聲粉碎，控制粒徑在50nm-200nm之間，用0. 22微米濾膜過濾除菌，用PBS(pH = 8. 0)緩衝溶液調節其外水相至pH = 6. 8，加入用0. 9%的氯化鈉溶液溶解的鹽酸多柔比星0. 2g水合池，加入一定量的葉酸-羧甲基殼聚糖溶液，水合0. 5h得到 PH敏感多柔比星納米脂質體溶液。實施例2在無菌條件下取注射用蛋黃卵磷脂1.6g，膽固醇0.4g，維生素E 0. 020g。將上述物料置於適當容器中，加入無水乙醇80ml超聲震蕩至完全溶解成溶液，將上述溶液轉移至梨形瓶中，在恆溫水浴中減壓旋轉蒸發至形成透明淡黃色薄膜。取PBS(pH = 4.0)緩衝溶液80ml洗脫，緩緩洗膜。洗膜後採用高壓均質在壓力參數為SOMPa時循環10次，用PBS (pH =8. 0)緩衝溶液調節其外水相至pH = 7. 0，加入用0. 9%的氯化鈉溶液溶解的鹽酸多柔比星0. 16g水合池，加入一定量的葉酸-羧甲基殼聚糖溶液，水合0. 5h得到葉酸-羧甲基殼聚糖修飾PH敏感多柔比星納米脂質體溶液。實施例3在無菌條件下取注射用蛋黃卵磷脂0. 4g，膽固醇0. lg，維生素E 0. 005g。將上述物料置於適當容器中，加入無水乙醇20ml超聲震蕩至完全溶解成溶液，將上述溶液轉移至梨形瓶中，在恆溫水浴中減壓旋轉蒸發至形成透明淡黃色薄膜。取PBS(pH = 4.0)緩衝溶液20ml洗脫，緩緩洗膜。洗膜後用超聲細胞粉碎機在功率為200-300W，間隙時間5s，超聲時間3s，工作時間為30min超聲粉碎，控制粒徑在50nm-200nm之間，用0. 22微米濾膜過濾除菌，用PBS (pH = 8. 0)緩衝溶液調節其外水相至pH = 7. 4，加入用0. 9%的氯化鈉溶液溶解的鹽酸多柔比星0. 04g水合池，加入一定量的葉酸-羧甲基殼聚糖溶液，水合0. 5h得到葉酸-羧甲基殼聚糖修飾PH敏感多柔比星納米脂質體溶液。
權利要求
1.一種葉酸-羧甲基殼聚糖修飾PH敏感多柔比星納米脂質體，其特徵在於，是由以下重量百分比的組分組成鹽酸多柔比星3. 2-16份，卵磷脂16-80份，膽固醇4-20份，維生素 E0. 16-0. 8份，葉酸改性的羧甲基殼聚糖(葉酸-羧甲基殼聚糖)1-5份，緩衝液800-1000 份；將卵磷脂、膽固醇和維生素E，分別按比例稱取相應的重量放入適當容器中，然後加入定量無水乙醇超聲震蕩溶解成溶液，將此溶液轉入旋轉蒸發器中，在40°C水浴旋轉蒸發減壓除去有機溶劑後成膜，加入比例量的緩衝溶液(pH = 4. 0)洗膜，水化、間隔0.證超聲一次，水化池，製得空白脂質體，將空白脂質體用超聲細胞粉碎機間歇超聲或高壓均質製得納米脂質體，過0. 22 μ m濾膜後，用緩衝溶液(pH = 8. 0)調節外水相pH值至6. 8-7. 4後加入溶有鹽酸多柔比星的等滲氯化鈉溶液，通過PH梯度法將鹽酸多柔比星載入空白納米脂質體中，在37°C水浴下水合池，將葉酸-羧甲基殼聚糖溶液加入到鹽酸多柔比星納米脂質體中，在37°C水浴下水合0.證，製得pH敏感多柔比星納米脂質體。
2.根據權利要求1所述的一種葉酸-羧甲基殼聚糖修飾pH敏感多柔比星納米脂質體， 其特徵在於，是由以下重量百分比的組分組成鹽酸多柔比星4-12份，卵磷脂20-60份，膽固醇4-15份，維生素E 0. 2-0. 6份，葉酸-羧甲基殼聚糖1. 25-3. 75份，緩衝液800-1000 份。
3.根據權利要求1-2所述的一種葉酸-羧甲基殼聚糖修飾pH敏感多柔比星納米脂質體，其特徵在於，所述的卵磷脂選自蛋黃卵磷脂、大豆卵磷脂、氫化大豆卵磷脂或氫化蛋黃卵磷脂。
4.根據權利要求1-2所述的一種葉酸-羧甲基殼聚糖修飾pH敏感多柔比星納米脂質體，其特徵在於，所述的羧甲基殼聚糖中的羧甲基取代度為0. 6-1. 2，分子量為 3000-100000;所述的葉酸-羧甲基殼聚糖是由葉酸在N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)與碳二亞胺鹽酸鹽(EDOHCl)存在的條件下室溫活化池後，再與羧甲基殼聚糖反應生成的。
5.根據權利要求1中所述的製備葉酸-羧甲基殼聚糖修飾pH敏感納米多柔比星脂質體的方法，其特徵在於所述的緩衝液選自磷酸鹽緩衝溶液或0. 9%的氯化鈉生理鹽水。
6.根據權利要求1中所述的製備葉酸-羧甲基殼聚糖修飾pH敏感納米多柔比星脂質體的方法，其特徵在於將所得空白脂質體使用細胞粉碎機進行粉碎的時候，其功率為 200-300W,間隙時間5s，超聲時間3s，工作時間為30min ；或將所得空白脂質體進行高壓均質，壓力為40-90MPa，循環次數為6_15次。
全文摘要
本發明涉及一種葉酸-羧甲基殼聚糖修飾pH敏感多柔比星納米脂質體及其製備方法。本發明中的脂質體是由多柔比星、磷脂、膽固醇、維生素E、葉酸-羧甲基殼聚糖等組成。所製備的脂質體具有pH敏感性、腫瘤靶向性以及長循環主動靶向給藥功能。
文檔編號A61K47/36GK102225051SQ20111015429
公開日2011年10月26日 申請日期2011年6月9日 優先權日2011年6月9日
發明者徐雲龍, 王麗丹, 趙崇軍, 錢秀珍 申請人:上海微納科技有限公司