一種豬胰島細胞凍存液及凍存方法與流程

2023-06-10 00:42:51 1

本發明涉及細胞的凍存領域，屬於生物
技術領域：
，尤其涉及豬胰島細胞的凍存液和凍存方法。
背景技術：
：糖尿病是由於胰島素分泌缺陷或者胰島素功能障礙導致的代謝性疾病。糖尿病容易引起長期代謝紊亂，使全身組織器官尤其使是眼、腎、心血管及神經系統造成功能障礙和衰竭。嚴重者引起失水，電解質紊亂和酸鹼平衡失調等急性併發症酮症酸中毒和高滲昏迷。注射胰島素是目前控制糖尿患者血糖的有效手段，但是外源性胰島素不能達到生理性調節血糖的作用，因此糖尿病併發症難以得到改善，從而大大降低患者的生活質量，最終導致死亡。研究發現明胰島細胞移植可以使糖尿病慢性併發症延緩6年以上，這對於提高糖尿病患者的生活質量非常重要。因此，胰島細胞移植治療糖尿病如同腎移植治療終末期腎功能衰竭一樣，將成為糖尿病的最有效治療手段。近年來隨著胰島細胞移植技術的日趨成熟和臨床應用的發展，豬胰島細胞異種移植有望成為治療糖尿病的有效方法之一。豬胰島的移植的實施過程中的關鍵之一就是獲得足夠量的豬胰島細胞，而豬胰島細胞分離、消化、純化過程是一個十分複雜的、技術性強的過程，往往需要10多頭新生豬才能滿足一個病人的使用。滿足豬胰島細胞移植往往需要大量細胞，臨時提取純化豬胰島細胞顯然無法滿足豬胰島移植的應用和推廣。因此，豬胰島細胞的凍存尤為重要，影響到豬胰島細胞移植的技術的應用和推廣。常規的細胞凍存保存劑為dmso10％+fbs10-20％+細胞培養液(主要有dmem,prim1640等)，它主要是適用於單細胞懸液的凍存保護劑。但胰島細胞不同於普通的細胞，它是由β、α、γ、θ等細胞組成的細胞團，共同發揮調節血糖水平的作用。用常規單細胞懸液的凍存液並不能有效的保護胰島細胞團，凍存的胰島細胞團活率極低，並且無法進行長期保存。因此用於臨床移植的豬胰島細胞團凍存液配方需要改良成適合臨床使用的配方。針對上述問題，本發明提供了一種用於大規模有效地凍存胰島細胞團的凍存液及其凍存方法，避免其受冷凍損傷，以提供臨床應用的胰島細胞團。技術實現要素：有鑑於此，本發明的目的在於針對上述現有技術存在的問題，提供一種豬胰島細胞的凍存液及其凍存方法，為了實現本發明的目的，本發明採用如下技術方案：一種豬胰島細胞凍存液，包括以下質量百分比的組分：基礎培養基20-40％，豬血清為40-50％，dmso為7～9％，其餘為保護因子；所述的保護因子及其濃度分別為過氧化氫酶100～200μg/ml，生育酚10～50μg/ml，海藻糖0.01～0.1mml/l，細胞凋亡抑制劑z-vad-fmk10～30μμ。所述的豬胰島細胞凍存液優選：基礎培養基40％，豬血清為50％，dmso為7～9％，其餘為保護因子；所述的保護因子及其濃度分別為過氧化氫酶100～200μg/ml，生育酚10～50μg/ml，海藻糖0.01～0.1mml/l，細胞凋亡抑制劑z-vad-fmk10～30μμ。所述的豬胰島細胞凍存液，氧化氫酶優選濃度為150μg/ml，生育酚優選濃度為20μg/ml，海藻糖優選濃度為0.05mml/l，細胞凋亡抑制劑z-vad-fmk優選濃度為20μμ。使用所述的豬胰島細胞凍存液的凍存方法，細胞凍存懸液中凍存密度為1×104-1×105ieq/ml。所述的凍存方法：三個降溫經歷的溫度區間及其降溫速度：降至溫度>-25℃，1℃/min的降溫速度；降至-25℃≥溫度≥-40℃，0.25℃/min的降溫速度；降至-40℃＞溫度≥-80℃，5℃/min的降溫速度。當溫度降到-80℃時，將細胞放置到液氮中長期保存。本發明的優勢：胰島細胞是細胞團樣結構，用常規的單細胞凍存保護液凍存胰島細胞團，大部分胰島細胞容易在凍存過程凋亡壞死。本發明凍存液添加了1、過氧化氫酶可以減輕低溫引起的細胞凋亡。2、生育酚減少氧化應激引起的細胞損傷。3、海藻糖是一種非滲透性保護劑，凍存過程中減少胞內結晶，復甦時減輕滲透壓改變引起的細胞腫脹，具有膜穩定的作用，提高復溫後活率。4、細胞凋亡抑制劑z-vad-fmk，純度>95％，具有抑制細胞凋亡的作用。本發明方法在-25℃≥溫度≥-40℃時，降溫速度為0.25℃/min降低降溫速度，讓胰島細胞團內外降溫一致。本發明的凍存液能有效的保護胰島細胞團，凍存的胰島細胞團活率高，並且能進行長期保存。以提供臨床應用的胰島細胞團。附圖說明圖1為實施例中凍存前豬胰島細胞；圖2為實施例中凍存1月後復甦豬胰島細胞形態圖；a為現有常規凍存液及方法；b為改良的凍存液及方法；c為本發明凍存液及方法；圖3為實施例中凍存1月後復甦豬胰島細胞流式細胞凋亡檢測的結果；a為現有常規凍存液及方法；b為改良的凍存液及方法；c為本發明凍存液及方法。具體實施方式：以下結合實施例進一步說明本發明，而不會形成對本發明的限制。實施例1豬胰島細胞的凍存實驗胰島細胞計數：每次於細胞懸液中取出50μl的樣品，鏡下計數dtz陽性細胞團並重複取樣3次，按下列公式計數胰島：胰島產量＝(3次陽性胰島數值之和/3)×[樣本總量(ml)/50μl]。將分離提取的豬胰島細胞分成兩份凍存：第一份豬胰島細胞用普通凍存液(50％血清+10％dmso+40％基礎培養基)重懸，密度為10000ieq/ml；裝入凍存管中，每管約1ml；降溫至-80℃，置入液氮中長期保存。第二份豬胰島細胞用改良的凍存液(50％血清+10％dmso+40％基礎培養基+海藻糖0.05mml/l+生育酚20μg/ml)重懸，密度為10000ieq/ml；裝入凍存管中，每管約1ml；降溫至-80℃，置入液氮中長期保存。第三份豬胰島細胞用本發明的凍存液重懸，密度為10000ieq/ml；裝入凍存管中，每管約1ml，4℃平衡30min，然後放入程序降溫儀中，以溫度>-25℃時，1℃/min的速率降溫，-25℃≥溫度≥-40℃時，0.25℃/min的速率降溫，-40℃＞溫度≥-80℃時，5℃/min的速率降溫，溫度降到-80℃時，放入液氮中長期保存。實施例2凍存1個月豬胰島細胞復甦後活率檢測分別將實施例1所述的普通凍存液、改良凍存液和本發明凍存液凍存的細胞凍存1個月後復甦。復甦後培養一天，胰島細胞計數計算細胞回收率，然後用annexinv–pi染色，通過facscaliburflowcytometer觀察細胞發生凋亡的情況。實驗結果表明常規凍存液組凍存一個月以後大部分豬胰島細胞凋亡了，存活的細胞僅剩下22.07％，改良凍存液組凍存一個月以後存活的豬胰島細胞活率提升到了41.69％，使用本發明的細胞凍存液凍存和凍存方法凍存一個月後的豬胰島細胞的活率大大提升，達到62.62％。表明本發明凍存液和凍存方法更適合豬胰島細胞的凍存。表1凍存1月後復甦胰島細胞活率分組凍存1月後活率常規凍存液組22.07％改良凍存液組41.69％本發明凍存液組62.62％實施例3凍存1個月豬胰島細胞復甦後功能檢測分別將實施例1所述的普通凍存液凍存的豬胰島細胞和本發明凍存液凍存的細胞凍存1個月後復甦。復甦後立即檢測細胞胰島素釋放能力以及培養一天檢測細胞胰島素釋放能力。實驗結果顯示本發明凍存方法組復甦的豬胰島細胞葡萄糖刺激指數2.56＞1.8，表明本發明的凍存液和凍存方法復甦的豬胰島細胞具有功能，而常規方法凍存的豬胰島細胞葡萄糖刺激指數1.24＜1.8不具有功能。說明使用本發明的凍存液和凍存方法能較好的保護豬胰島細胞的功能。表2凍存1月後復甦豬胰島細胞胰島素釋放當前第1頁12