一種新型細胞凍存液的製作方法

2023-06-10 00:42:41

本發明屬於生物技術應用領域，具體地，涉及一種新型細胞凍存液。

背景技術：

細胞培養是生物與健康相關研究領域的一項重要技術。隨著生命科學的迅速發展，目前細胞培養已成為細胞生物學、分子生物學、遺傳學和免疫學等學科研究的重要基礎。為了深入探討細胞的生長活動規律、有關疾病的病理和藥物的藥理（毒理）機制，開發具有不同針對性的細胞培養方法具有重要意義。

細胞凍存技術是細胞生物學技術中一個非常重要的手段，也是細胞培養中的重要技術。人們在細胞生物學及其相關學科的研究中，越來越多的運用組織細胞培養增殖技術，將有研究意義或有應用前景的活體細胞，採用低溫度進行長期保存數月、數年、數十年甚至數百年，一旦需要，可隨時對所保存的細胞進行復甦，恢復其完整的形態結構與生物學特性，供生命科學研究實驗。

本發明所述的新型細胞凍存液安全性、穩定性好，細胞復甦後存活率高，可以適用於人源以及非人源的多種細胞的培養。

技術實現要素：

發明目的：本發明提供了一種新型細胞凍存液，用於多種人源以及非人源細胞的培養。

技術方案：本發明提供了一種新型細胞凍存液，以重量組分計，包括以下組分：二甲基亞碸5-15份、羥乙基澱粉2-5份、殼聚糖5-10份、穀胱甘肽2-5份、維生素c1-4份、右旋糖酐0.3-4份、丙二醇0.5-2份、n-(苯甲基)-2-(4-嘧啶氨基)-4-噻唑甲醯胺0.1-1份和基礎培養基80-90份。本發明所述的新型細胞凍存液組分合理，營養豐富，其中，右旋糖酐為滲透性保護液，而n-(苯甲基)-2-(4-嘧啶氨基)-4-噻唑甲醯胺則抑制細胞活動和基因表達，維生素c的抗氧化性好，在保證休眠細胞的營養的同時還可以顯著減少對細胞的損傷，提高凍存細胞的存活率，並且在增殖方面也保持很好的狀態。

進一步的，上述的新型細胞凍存液，所述基礎培養基以重量組分計，包括以下組分：葡萄糖82-88份、碳酸氫鈉12-25份、丙酮酸鈉10-16份、絲膠蛋白5-9份、氯化鉀35-45份、無水硫酸鎂6-10份、氯化鈉70-78份、無水磷酸二氫鈉10-14份、葉酸0.3-0.5份、肌醇0.8-1.2份、煙醯胺0.3-0.6份、無水氯化鈣25-35份、硝酸鐵0.2-0.4份、丁二酸6-8份、丁二酸鈉12-16份、d-泛酸鈣0.3-0.6份、酒石酸膽鹼0.6-0.8份、核黃素0.1-0.3份、鹽酸硫胺0.2-0.4份、鹽酸吡哆辛0.3-0.5份、n-異丙基丙烯醯胺0.2-0.4份、亞麻酸1-2份、乙醇胺0.6-0.8份、芳香酸酯0.3-0.8份、酚紅鈉1-1.3份和去離子水100份。基礎培養基組分合理，營養豐富，可以提高細胞凍存時的營養物質，保證凍存細胞的活性。

進一步的，上述的新型細胞凍存液，所述基礎培養基還包括3-8份胺基酸，所述胺基酸以重量組分計，由以下組分組成：l-鹽酸精氨酸5-10份、l-鹽酸胱氨酸3-8份、l-絲氨酸3-6份、甘氨酸1-5份、l-鹽酸組氨酸4-6份、l-異亮氨酸8-20份、l-亮氨酸7-18份、l-鹽酸賴氨酸10-20份、l-甲硫氨酸1-6份、l-苯丙氨酸2-8份、l-蘇氨酸5-15份、l-色氨酸1-3份、l-酪氨酸5-9份和l-纈氨酸8-12份。

進一步的，上述的新型細胞凍存液，所述基礎培養基還包括2-5份輔助因子，所述輔助因子以重量組分計，由以下組分組成：重組人鹼性成纖維細胞生長因子2-10份、白介素23-8份、白介素43-6份、白介素141-5份、ifn-γ3-6份和神經白細胞素1-4份。

進一步的，上述的新型細胞凍存液，所述基礎培養基還包括體積比10-30%的胎牛血清。可以根據需要，進一步增加胎牛血清，提高凍存細胞的存活率，保持細胞活性。

進一步的，上述的新型細胞凍存液，所述基礎培養基以重量組分計，還包括0.006份青黴素和0.01份的鏈黴素。可以有效防止凍存細胞被汙染。

進一步的，上述的新型細胞凍存液，所述青黴素選自10000u/ml，所述鏈黴素選自10000μg/ml。青黴素和鏈黴素活性好，效果佳。

有益效果：本發明所述的新型細胞凍存液，其組分合理，營養豐富，在保證休眠細胞的營養的同時還可以顯著減少對細胞的損傷，提高凍存細胞的存活率，並且在增殖方面也保持很好的狀態。

附圖說明

圖1為實施例1-4細胞存活率的測定圖。

具體實施方式

下面將通過幾個具體實施例，進一步闡明本發明，這些實施例只是為了說明問題，並不是一種限制。

實施例1

一種新型細胞凍存液，以重量組分計，包括以下組分：二甲基亞碸5份、羥乙基澱粉2份、殼聚糖5份、穀胱甘肽2份、維生素c1份、右旋糖酐0.3份、丙二醇0.5份、n-(苯甲基)-2-(4-嘧啶氨基)-4-噻唑甲醯胺0.1份和基礎培養基80份。

其中，所述基礎培養基以重量組分計，包括以下組分：葡萄糖82份、碳酸氫鈉12份、丙酮酸鈉10份、絲膠蛋白5份、氯化鉀35份、無水硫酸鎂6份、氯化鈉70份、無水磷酸二氫鈉10份、葉酸0.3份、肌醇0.8份、煙醯胺0.3份、無水氯化鈣25份、硝酸鐵0.2份、丁二酸6份、丁二酸鈉12份、d-泛酸鈣0.3份、酒石酸膽鹼0.6份、核黃素0.1份、鹽酸硫胺0.2份、鹽酸吡哆辛0.3份、n-異丙基丙烯醯胺0.2份、亞麻酸1份、乙醇胺0.6份、芳香酸酯0.3份、酚紅鈉1份和去離子水100份。

另，所述基礎培養基還包括3份胺基酸，所述胺基酸以重量組分計，由以下組分組成：l-鹽酸精氨酸5份、l-鹽酸胱氨酸3份、l-絲氨酸3份、甘氨酸1份、l-鹽酸組氨酸4份、l-異亮氨酸8份、l-亮氨酸7份、l-鹽酸賴氨酸10份、l-甲硫氨酸1份、l-苯丙氨酸2份、l-蘇氨酸5份、l-色氨酸1份、l-酪氨酸5份和l-纈氨酸8份。

再，所述基礎培養基還包括2份輔助因子，所述輔助因子以重量組分計，由以下組分組成：重組人鹼性成纖維細胞生長因子2份、白介素23份、白介素43份、白介素141份、ifn-γ3份和神經白細胞素1份。

進一步的，所述基礎培養基還包括體積比10%的胎牛血清。此外，所述基礎培養基以重量組分計，還包括0.006份青黴素和0.01份的鏈黴素。並且，所述青黴素選自10000u/ml，所述鏈黴素選自10000μg/ml。

將上述細胞凍存液，應用於人源性肝癌細胞a549的凍存。

實施例2

一種新型細胞凍存液，以重量組分計，包括以下組分：二甲基亞碸15份、羥乙基澱粉5份、殼聚糖10份、穀胱甘肽5份、維生素c4份、右旋糖酐4份、丙二醇2份、n-(苯甲基)-2-(4-嘧啶氨基)-4-噻唑甲醯胺1份和基礎培養基90份。

其中，所述基礎培養基以重量組分計，包括以下組分：葡萄糖88份、碳酸氫鈉25份、丙酮酸鈉16份、絲膠蛋白9份、氯化鉀45份、無水硫酸鎂10份、氯化鈉78份、無水磷酸二氫鈉14份、葉酸0.5份、肌醇1.2份、煙醯胺0.6份、無水氯化鈣35份、硝酸鐵0.4份、丁二酸8份、丁二酸鈉16份、d-泛酸鈣0.6份、酒石酸膽鹼0.8份、核黃素0.3份、鹽酸硫胺0.4份、鹽酸吡哆辛0.5份、n-異丙基丙烯醯胺0.4份、亞麻酸2份、乙醇胺0.8份、芳香酸酯0.8份、酚紅鈉1.3份和去離子水100份。

另，所述基礎培養基還包括8份胺基酸，所述胺基酸以重量組分計，由以下組分組成：l-鹽酸精氨酸10份、l-鹽酸胱氨酸8份、l-絲氨酸6份、甘氨酸5份、l-鹽酸組氨酸6份、l-異亮氨酸20份、l-亮氨酸18份、l-鹽酸賴氨酸20份、l-甲硫氨酸6份、l-苯丙氨酸8份、l-蘇氨酸15份、l-色氨酸3份、l-酪氨酸9份和l-纈氨酸12份。

再，所述基礎培養基還包括5份輔助因子，所述輔助因子以重量組分計，由以下組分組成：重組人鹼性成纖維細胞生長因子8份、白介素28份、白介素44份、白介素145份、ifn-γ6份和神經白細胞素4份。

進一步的，所述基礎培養基還包括體積比30%的胎牛血清。此外，所述基礎培養基以重量組分計，還包括0.006份青黴素和0.01份的鏈黴素。並且，所述青黴素選自10000u/ml，所述鏈黴素選自10000μg/ml。

將上述細胞凍存液，應用於小鼠來源的黑色素瘤細胞b16的凍存。

實施例3

一種新型細胞凍存液，以重量組分計，包括以下組分：二甲基亞碸10份、羥乙基澱粉3份、殼聚糖6份、穀胱甘肽3份、維生素c2份、右旋糖酐3份、丙二醇1份、n-(苯甲基)-2-(4-嘧啶氨基)-4-噻唑甲醯胺0.8份和基礎培養基85份。

其中，所述基礎培養基以重量組分計，包括以下組分：葡萄糖86份、碳酸氫鈉18份、丙酮酸鈉12份、絲膠蛋白6份、氯化鉀40份、無水硫酸鎂8份、氯化鈉75份、無水磷酸二氫鈉12份、葉酸0.4份、肌醇1份、煙醯胺0.5份、無水氯化鈣30份、硝酸鐵0.3份、丁二酸7份、丁二酸鈉14份、d-泛酸鈣0.5份、酒石酸膽鹼0.7份、核黃素0.2份、鹽酸硫胺0.3份、鹽酸吡哆辛0.4份、n-異丙基丙烯醯胺0.3份、亞麻酸1.6份、乙醇胺0.7份、芳香酸酯0.5份、酚紅鈉1.2份和去離子水100份。

另，所述基礎培養基還包括5份胺基酸，所述胺基酸以重量組分計，由以下組分組成：l-鹽酸精氨酸8份、l-鹽酸胱氨酸6份、l-絲氨酸5份、甘氨酸3份、l-鹽酸組氨酸5份、l-異亮氨酸12份、l-亮氨酸10份、l-鹽酸賴氨酸15份、l-甲硫氨酸3份、l-苯丙氨酸4份、l-蘇氨酸9份、l-色氨酸2份、l-酪氨酸6份和l-纈氨酸9份。

再，所述基礎培養基還包括3份輔助因子，所述輔助因子以重量組分計，由以下組分組成：重組人鹼性成纖維細胞生長因子6份、白介素25份、白介素44份、白介素145份、ifn-γ5份和神經白細胞素3份。

進一步的，所述基礎培養基還包括體積比15%的胎牛血清。此外，所述基礎培養基以重量組分計，還包括0.006份青黴素和0.01份的鏈黴素。並且，所述青黴素選自10000u/ml，所述鏈黴素選自10000μg/ml。

將上述細胞凍存液，應用於猴腎細胞marc145的凍存。

實施例4

一種新型細胞凍存液，以重量組分計，包括以下組分：二甲基亞碸15份、羥乙基澱粉2份、殼聚糖6份、穀胱甘肽3份、維生素c1份、右旋糖酐4份、丙二醇1份、n-(苯甲基)-2-(4-嘧啶氨基)-4-噻唑甲醯胺0.8份和基礎培養基90份。

其中，所述基礎培養基以重量組分計，包括以下組分：葡萄糖82份、碳酸氫鈉25份、丙酮酸鈉12份、絲膠蛋白6份、氯化鉀45份、無水硫酸鎂6份、氯化鈉72份、無水磷酸二氫鈉14份、葉酸0.3份、肌醇1份、煙醯胺0.3份、無水氯化鈣35份、硝酸鐵0.3份、丁二酸6份、丁二酸鈉12份、d-泛酸鈣0.6份、酒石酸膽鹼0.7份、核黃素0.2份、鹽酸硫胺0.3份、鹽酸吡哆辛0.4份、n-異丙基丙烯醯胺0.4份、亞麻酸2份、乙醇胺0.6份、芳香酸酯0.3份、酚紅鈉1.3份和去離子水100份。

另，所述基礎培養基還包括4份胺基酸，所述胺基酸以重量組分計，由以下組分組成：l-鹽酸精氨酸5份、l-鹽酸胱氨酸8份、l-絲氨酸6份、甘氨酸3份、l-鹽酸組氨酸5份、l-異亮氨酸12份、l-亮氨酸18份、l-鹽酸賴氨酸10份、l-甲硫氨酸5份、l-苯丙氨酸4份、l-蘇氨酸10份、l-色氨酸3份、l-酪氨酸5份和l-纈氨酸8份。

再，所述基礎培養基還包括3份輔助因子，所述輔助因子以重量組分計，由以下組分組成：重組人鹼性成纖維細胞生長因子2份、白介素28份、白介素43份、白介素144份、ifn-γ5份和神經白細胞素2份。

進一步的，所述基礎培養基還包括體積比30%的胎牛血清。此外，所述基礎培養基以重量組分計，還包括0.006份青黴素和0.01份的鏈黴素。並且，所述青黴素選自10000u/ml，所述鏈黴素選自10000μg/ml。

將上述細胞凍存液，應用於大鼠的永生化肝星形細胞hsc-t6的凍存。

將實施例1-4凍存的細胞分別取凍存後3個月、6個月、9個月、12個月、18個月以及24個月的凍存細胞進行復甦，並對細胞存活率進行測定，細胞存活率均在85%以上。

以上所述僅是發明的幾個實施方式，應當指出，對於本技術領域的普通技術人員來說，在不脫離發明原理的前提下，還可以做出若干改進，這些改進也應視為本發明的保護範圍。