細胞凍存液的製作方法
2023-06-10 00:42:56 1
細胞凍存液的製作方法
【專利摘要】本發明提供一種可臨床安全使用的用於凍存人類細胞的細胞凍存液,其包含2-8重量%的人血白蛋白、5-10體積%的二甲基亞碸、3.3-5.1重量%的右旋糖酐-40和2.75-4.25重量%的葡萄糖。
【專利說明】細胞凍存液
發明領域
[0001]本發明涉及細胞治療領域,具體涉及一種可安全用於臨床的細胞凍存液。
[0002]發明背景
[0003]免疫細胞治療已日漸成為腫瘤臨床常規治療的重要輔助手段之一,在臨床上廣泛使用。在免疫細胞製備或臨床應用過程中,一定情況下需要將細胞冷凍保存於液氮,一段時間後再用於繼續培養或臨床直接回輸。實驗室常用的細胞凍存液或市售細胞凍存液中通常需要添加異種血清或異種蛋白,因此在用於免疫細胞治療時存在引入汙染和過敏原的風險。而臨床用於凍存臍帶血幹細胞的細胞凍存液,在凍存免疫細胞時,存在復甦後細胞活性差的缺點。本領域存在對高效的、可安全用於臨床的細胞凍存液,特別是免疫細胞凍存液的需要。
【發明內容】
[0004]本發明提供一種用於凍存人類細胞的細胞凍存液,其包含2-8重量%的人血白蛋白、5-10體積%的二甲基亞碸、3.3-5.1重量%的右旋糖酐-40和2.75-4.25重量%的葡萄糖。
【具體實施方式】
[0005]本發明提供了一種臨床安全性高、成本低、能很好保持凍存細胞活性的細胞凍存液,其用於凍存人類細胞。
[0006]本發明的細胞凍存液的主要活性成分包括右旋糖酐-40 (Dextran-40)、人血白蛋白(HSA)和二甲基亞碸(DMSO)。其中Dextran-40可以維持滲透壓和PH值,提供適宜細胞存活的介質環境。用於配製本發明的細胞凍存液的右旋糖酐-40可以例如是藥用級別的右旋糖酐-40葡萄糖注射液(四川科倫藥業,其中含6% Dextran-40和作為輔料的5%葡萄糖)。人血白蛋白為營養性保護劑。市售的人血白蛋白通常為20%人血白蛋白溶液。DMSO為小分子有機化合物,滲透性保護劑,能夠降低細胞冰點,減少冰晶的形成對細胞的損害。
[0007]在一些實施方案中,本發明的細胞凍存液包含2-8重量%的人血白蛋白、5-10體積%的二甲基亞碸、3.3-5.1重量%的右旋糖酐-40和2.75-4.25重量%的葡萄糖。優選地,本發明的細胞凍存液包含4重量%的人血白蛋白、5體積%的二甲基亞碸、4.5重量%的右旋糖酐-40和3.75重量%的葡萄糖。本發明的細胞凍存液中還包含藥物學可接受的溶劑,包括但不限於注射用水或注射用生理鹽水。在本發明實施例中,使用商品化的右旋糖酐-40葡萄糖注射液(含6% Dextran-40和5%葡萄糖)和20%人血白蛋白溶液可以方便地配製本發明的細胞凍存液,無需額外添加溶劑。
[0008]現有技術中的凍存液,通常需要含有異種血清或蛋白,例如胎牛血清(FBS),其成分複雜並存在引入汙染和過敏原的風險,不適合於臨床使用。本發明的用於凍存人類細胞的細胞凍存液不含非人源的血清或蛋白質,因此具有高臨床安全性。相反,本發明的細胞凍存液使用了人血白蛋白,能夠實現凍存細胞高達約80-95 %的復甦活率。在一實施方案中,使用本發明的細胞凍存液能夠實現淋巴細胞約80-95%的凍存復甦活率。
[0009]本發明的細胞凍存液適用於凍存人類細胞,包括但不限於外周血單個核細胞、淋巴細胞(包括活化淋巴細胞)、臍血幹細胞、外周血造血幹細胞、骨髓造血肝細胞和人來源的細胞系(如H印Gll、A549、SK-BR-3等人體腫瘤細胞系)等。所述細胞可以是直接分離自人體的細胞也可以是經體外擴增的細胞。凍存後復甦的細胞,例如活化淋巴細胞,可以繼續培養擴增或臨床直接回輸進行疾病治療,例如腫瘤治療。
[0010]本發明的細胞凍存液適於凍存較廣濃度範圍的細胞。例如,可以0.5X IO7/ml-2.5XlOVml的濃度凍存細胞。
[0011]本發明的細胞凍存液易於保存並具有較長的貨架期。例如,本發明的細胞凍存液可以在配製後立即使用或在配製後保存至少3個月後再使用,其可以在低溫保存(例如2~8°C )也可以在室溫保存,所述保存條件不會降低本發明細胞凍存液的效果。
[0012]本發明還提供了凍存細胞的方法,其包括:
[0013]a)向細胞加入本發明的細胞凍存液,獲得細胞懸浮液;
[0014]b)將所獲得 的細胞懸浮液程序冷凍,然後移入液氮保存。
[0015]對細胞懸浮液進行程序冷凍的方法為本領域技術人員所熟知,例如,依照廠商說明使用美國Nalgene程序降溫盒進行程序冷凍。
[0016]下面將通過實施例的方式進一步說明本發明,但並不因此將本發明限制在所描述的實施例範圍中。
[0017]實施例
[0018]實施例1、三種不同細胞凍存液的比較
[0019]1.實驗設計
[0020]以實驗室常用細胞凍存液(胎牛血清+DMS0,後文簡稱對照凍存液A ;見司徒振強等《細胞培養》)為對照,比較本發明人開發的細胞凍存液(細胞凍存液C)和臍帶血造血幹細胞常用凍存液(Dextran-40+DMS0,後文簡稱臍血凍存液B ;Rubinstein等,Proc.Nat1.Acad.Sc1.USA,Vol.92,pp.10119-10122,0ctl995)對於經兩次傳代培養的淋巴細胞的冷凍保存性能。
[0021]2.實驗方法
[0022]2.1外周血單個核細胞的分離和接種培養
[0023]採集3個健康供者的外周血,45mL/人,無菌條件下使用Ficoll-Paque PREMIUM密度梯度離心獲得外周血單個核細胞(後文簡稱PBMC),用生理鹽水洗滌細胞三次。最後用5mL無血清細胞培養基(英國IMMUNOTECH NK Ltd,無血清MSF100細胞培養基)重懸細胞沉澱,吹打混勻後進行細胞計數。根據計數結果,用50mL已加入細胞因子(IL-2750-1500U/ml、IL-71-30U/ml以及INF-Y 750_1500U/ml)的無血清細胞培養基重懸I~4X IO7PBMC接種到已包被活化抗體(抗⑶3抗體)的細胞培養瓶中,置於細胞培養箱內進行培養(溫度37°C和 0)2濃度5% )。
[0024]2.2活化並進行兩次細胞傳代
[0025]接種培養3天後,將細胞培養瓶從細胞培養箱內取出,補充50mL已加入細胞因子(IL-2750-1500U/ml、IL-71_30U/ml 以及 INF-Y 750_1500U/ml)的無血清細胞培養基(IMSF100)進行細胞傳代。第一次傳代操作後第二天,將細胞培養瓶從細胞培養箱內取出,再補充IOOmL已加入細胞因子的無血清細胞培養基進行第二次細胞傳代。
[0026]2.3配製凍存液並進行細胞計數
[0027]第二次傳代操作後第二天,按照下表配製三種細胞凍存液:
[0028]表1三種凍存液配方
【權利要求】
1.一種用於凍存人類細胞的細胞凍存液,其包含2-8重量%的人血白蛋白、5-10體積%的二甲基亞碸、3.3-5.1重量%的右旋糖酐-40和2.75-4.25重量%的葡萄糖。
2.權利要求1的細胞凍存液,其包含4重量%的人血白蛋白、5體積%的二甲基亞碸、4.5重量%的右旋糖酐-40和3.75重量%的葡萄糖。
3.權利要求1或2的細胞凍存液,其不含非人源的血清和蛋白質。
4.權利要求1-3任一項的細胞凍存液,其在2-8°C或室溫保存。
5.權利要求1-4任一項的細胞凍存液,所述細胞凍存液具有至少3個月的貨架期。
6.權利要求1-5任一項的細胞凍存液,其中所述人類細胞選自外周血單個核細胞、淋巴細胞、臍血幹細胞、外周血造血幹細胞、骨髓造血肝細胞和人來源的細胞系。
7.凍存人類細胞的方法,其包括: a)向細胞加入權利要求1-6任一項的細胞凍存液,獲得細胞懸浮液; b)將所獲得的細胞懸浮液程序冷凍,然後移入液氮保存。
8.權利要求7的方法,其中所述細胞所述人類細胞選自外周血單個核細胞、淋巴細胞、臍血幹細胞、外周血造血幹細胞、骨髓造血肝細胞和人來源的細胞系。
9.權利要求7或8的方法,其中所述細胞懸浮液中的細胞濃度是0.5 X IO7/ml-2.5 XlOVml ο
【文檔編號】A01N1/02GK103563888SQ201310526658
【公開日】2014年2月12日 申請日期:2013年10月31日 優先權日:2013年10月31日
【發明者】邵誼 申請人:北京永泰免疫應用科技有限公司