人FGF21突變體、其製備方法及用途與流程
2023-06-10 04:45:06 2
本發明蛋白質工程領域，具體涉及人成纖維細胞生長因子21(fgf21)突變體，其編碼基因，以及所述突變體的製備方法和使用所述突變體用於治療2型糖尿病、肥胖、異常血脂症、或代謝紊亂的方法。
背景技術：
fgf21屬於成纖維細胞生長因子(fgf)19亞家族的分泌蛋白，所述成纖維細胞生長因子(fgf)亞家族包括fgf19、fgf21、和fgf23(itoh等，2004，trendgenet.20：563-69)。fgf21是一種非典型的fgf，其獨立於肝素，並在葡萄糖、脂類和能量代謝中發揮功能。其通過上調glut1表達，促進脂肪細胞中的葡萄糖攝取，其機制不同於胰島素。在患有糖尿病的齧齒動物、猴子和人中，fgf21降低葡萄糖空腹血清濃度，並降低甘油三酯、胰島素和胰高血糖素的空腹血清濃度。此外，在飲食誘導的肥胖嚙齒類動物模型中，施用fgf21導致累計體重呈劑量依賴性喪失。實驗研究提供了fgf21具有用於治療糖尿病、肥胖、異常血脂症、代謝綜合症的藥物學給藥的支持。
人fgf21易降解，用量大，穩定性及藥效較差，因此需要對野生型fgf21進行改造，提高人fgf21的有效性和穩定性，以減少對患者給藥的劑量。
發明概述
為了解決上述問題，本發明提供了替代性的人fgf21突變體，其編碼基因以及所述突變體的製備方法和用途。
具體而言，本發明一方面提供了一種人fgf21突變體，其在野生型人fgf21蛋白胺基酸序列的基礎上具有以下胺基酸改變：
1)在野生型人fgf21蛋白胺基酸序列的第31位ala和第32位his之間增加一個cys，並且第43位gly、第44位ala中的任意1個或2個位置處的胺基酸突變為cys，
2)野生型人fgf21蛋白胺基酸序列的第171位pro突變為gly；和/或
3)野生型人fgf21蛋白胺基酸序列的第24位至31位的胺基酸片段用5-15個胺基酸，優選6-14個胺基酸，更優選7-13個胺基酸，還優選8-10個胺基酸，最優選8個胺基酸的片段替換。
在優選的實施方案中，用於所述替換的胺基酸片段是任意胺基酸的組合。
在優選的實施方案中，用於所述替換的胺基酸片段為8個胺基酸的片段，用式x1x2x3x4x5x6x7x8表示。
在優選的實施方案中，x1-x8各自獨立地選自任意胺基酸，優選x1是ser或asp，x2是gly或asp，x3是pro或ala，x4是ala或gln，x5是gly或gln，x6是leu或tyr，x7是ser或his，x8是ser或ala。
本發明的方案中，基於fgf21的空間結構，本發明人發現，fgf21c端的第171位的胺基酸p容易暴露在表面易被酶所降解，本發明將其突變為g，從而增加了fgf21穩定性，但不影響fgf21的活性。進一步地，本發明人基於結構發現，fgf21的n端的第24-31的空間結構為一段loop環，loop環的長度在對fgf21的穩定性有顯著影響的情況下仍然保持fgf21的活性。此外，基於fgf21的空間結構，本發明人還發現野生型fgf21的第31位和第32位與第43位和第44位的胺基酸在空間上是靠近的，但是結構不夠穩定。經過深入研究，本發明人出人意料地發現：在不影響第23-32位間loop環的長度的情況下，在第31位和第32位之間插入了一個半胱氨酸cys後，該半胱氨酸通過與第43位或第44位突變的半胱氨酸形成二硫鍵，從而穩定了其結構；另外，突變loop環上的胺基酸，在插入在第31-32位間的cys與第43位或與第44位突變的cys形成二硫鍵並穩定結構的基礎上改變第24-31位loop環的胺基酸組成，能夠充分提高fgf21的活性。
在本發明的方案中，野生型人fgf21蛋白胺基酸序列在31-32位增加的cys和第43位或44位的cys之間形成穩定二硫鍵時，在野生fgf21第23-32位間的胺基酸的長度對於fgf21的穩定性影響效果明顯。因此，在本說明書公開內容的基礎上，本領域技術人員能夠任意選擇所述片段的長度和胺基酸種類來對本發明進行效果可以預期的改變或改進。
在優選的實施方案中，用於所述替代的胺基酸片段是ddaqqtea(其相應的突變體在下文中也稱為fgf21-ag)，編碼該突變體的核酸序列如seqidno：3所示，胺基酸序列如seqidno：4所示。
在另一個優選的實施方案中，用於所述替代的胺基酸片段是sgphglss(其相應的突變體在下文中也稱為fgf21-lg)，編碼該突變體的核酸序列如seqidno：5所示，胺基酸序列如seqidno：6所示。
本發明中「野生型fgf21」是從http：//www.uniprot.org/中搜索fgf21，在得到的結果中選擇物種(organism)為人類(homosapiens)而得到的。人源fgf21在uniprot的編號為(q9nsa1)，我們得到fgf21的蛋白質序列有209個殘基。去除n端28個胺基酸的信號肽，得到的fgf21的序列有181個殘基，即為野生型fgf21序列，其核酸序列為seqidno：2，相應胺基酸序列為seqidno：1。
因此，本發明中所述的「野生型人fgf21蛋白」是指天然存在於人中的成熟fgf21蛋白(下文中也稱為fgf21)，在典型的情況下，其胺基酸序列如seqidno：1所示，或與seqidno：1具有95％以上，優選98％以上，更優選99％以上的同源性的胺基酸序列。
另一方面，本發明提供一種核酸，其編碼以上所述的任一突變體。
本發明還提供一種載體，其包含以上所述的核酸。在優選的實施方案中，所述載體為表達載體，更優選為原核表達載體。
本發明還提供一種宿主細胞，其包含以上所述的載體。
在優選的實施方案中，所述宿主細胞為大腸桿菌(e.coli)細胞。
本發明還提供一種製備人fgf21突變體的方法，所述方法包括將所述人fgf21突變體的編碼基因與所述表達載體可操作性的連接，得到重組表達載體；將重組表達載體轉化宿主細胞；培養重組宿主細胞，誘導重組蛋白表達，收集並純化表達的蛋白。
在優選的實施方案中，所述方法包括將sumo標籤基因(sumo標籤基因n端有6個his標籤)和編碼所述人fgf21突變體的核酸序列依次連接在一起。將該基因與表達載體可操作性的相連接，得到重組表達載體；將重組表達載體轉化宿主細胞，培養重組宿主細胞，誘導重組蛋白表達，收集並純化所表達的蛋白，sumo酶切割，再純化。
所述的宿主細胞為大腸桿菌(e.coli)細胞。
本發明人發現，對於本發明所述的突變體，誘導表達條件為：10-37℃培養細胞到od600達到0.2-1.0時加入終濃度為0.1-1mm的iptg，4-37℃誘導表達2-20h。在更優選的實施方案中，條件為37℃培養細胞到od600達到0.8時加入終濃度為1mm的iptg，25℃誘導表達6h。
本發明的純化方法是將收集到的菌體用裂解緩衝液(20mmtris-hcl100mmnacl，ph8.0)重懸，進行細胞破碎，離心，收集上清液，將上清液與純化填料混合後孵育0.1-10個小時，將混合物轉移到層析柱中，進行蛋白的純化，將純化得到的sumo融合的人fgf21突變體蛋白用sumo酶酶切，酶切條件包括：溫度為0-37℃，緩衝液為20mmtris-hcl100mmnaclph，8.0pbs，tris-hcl，ph值為6.8-8.0，切割0-24小時，利用ni金屬螯合親和層析，得到人fgf21突變體，再利用分子排阻層析對fgf21突變體蛋白進行再純化。
另一方面，本發明提供所述突變體在製備藥物中的用途，所述藥物用於治療2型糖尿病、肥胖、異常血脂症、或代謝症候群。
本發明中所述的「突變」包括胺基酸的置換、缺失、添加。
綜上所述，本發明的突變體具有野生型fgf21沒有的優點。這種優點包括改善的藥理學效力和/或改善的藥物穩定性。本發明的fgf21突變體蛋白具有一種或多種有利的生理學特徵，包括在體內具有更顯著的藥效，具有更強熱穩定性。另外，本發明的fgf21變體對2型糖尿病、肥胖、異常脂血症、或代謝綜合症、或其任意的治療具有潛在的作用。
附圖簡述
圖1.sumo-fgf21突變體表達載體示意圖
圖2.純化後sumo-fgf21-lg核酸電泳圖，m是dl5000dnamarker，1是sumo-fgf21-lg基因的純化產物
圖3.純化後sumo-fgf21-ag核酸電泳圖，m是dl5000dnamarker，1是sumo-fgf21-ag基因的純化產物
圖4.純化後pet22b(de3)sumo-fgf21-lg蛋白的sds-page圖
圖5.純化後fgf21-lg蛋白的sds-page圖，m是蛋白分子量標準，1是fgf21-lg
圖6.純化後fgf21-ag蛋白的sds-page圖，m是蛋白分子量標準，1是fgf21-ag
圖7.fgf21-lg蛋白動物藥效試驗(降低血糖)結果圖。
圖8.fgf21-ag蛋白動物藥效試驗(降低血糖)結果圖。
圖9.fgf21-lg蛋白動物藥效試驗(對體重的影響)結果圖。
圖10.fgf21-ag蛋白動物藥效試驗(對體重的影響)結果圖。
圖11.fgf21-lg蛋白的熱穩定性試驗。
具體實施方式
下面結合具體實施例來進一步描述本發明，本發明的優點和特點將會隨著描述而更為清楚。但這些實施例僅是範例性的，並不對本發明的範圍構成任何限制。本領域技術人員應該理解的是，在不偏離本發明的精神和範圍下可以對本發明技術方案的細節和形式進行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發明的保護範圍內。
實施中實驗主要試劑耗材及儀器：克隆所用引物均為上海生工合成。聚合酶鏈式反應(pcr)中dna聚合酶(primerstar)、限制性內切酶、連接酶、dpni均購於takara公司；dnamarker購於thermo公司；普通dna產物回收試劑盒、瓊脂糖凝膠回收試劑盒購於tiangen公司。e.colidh5α菌株，e.colibl21菌株，pet22b-sumo-fgf21質粒，sumo蛋白酶購置北京索萊寶科技有限公司。tris、咪唑購於上海生工，其他鹽類購於國藥，濃縮管購於millipore。fplc儀器使用的是ge公司的系統，使用的ni-sepharose層析柱和分子排阻層析柱hiload16/60superdex75pg均購於ge公司。bca試劑盒購於thermo。
表1.fgf21分子克隆所使用的引物
a第1-8位為保護鹼基，第9至14位為限制性內切酶位點；
b第1-3位為保護鹼基，第4至9位為限制性內切酶位點。
實施例1：重組fgf21突變體表達載體的構建
以pet22b-sumo-fgf21質粒為模板，第一次突變：利用上遊引物171g-f和下遊引物171g-r進行pcr定點突變。得到fgf21-p171g突變體。第二次突變利用fgf21-p171g突變體為模板，以43c-f為上遊引物和43c-r為下遊引物進行pcr定點突變，得到fgf21-g43c-p171g突變體。第三次突變：利用fgf21-g43c-p171g突變體為模板，以31-32c-f為上遊引物和31-32c-r為下遊引物進行pcr定點突變，得到fgf21-ag突變體。第四次突變：以fgf21-ag為模板，以fgf21-lg-f為上遊引物，以fgf21-lg-r為下遊引物進行突變。得到fgf21-lg突變體。pcr反應條件如下。以上突變過程的pcr反應體系及反應程序如下：
pcr反應體系：2×primestarhs(premix)25μl，上遊引物(10μm)1μl，下遊引物(10μm)1μl，模板μl，ddh2o22μl，總體積50μl。
pcr反應程序：第1步、預變性溫度98℃10mins；第2步、變性溫度98℃10secs；3、退火溫度57℃5secs；第4步、延伸溫度72℃，1min。從第2到4步重複30個循環。
每次突變後的產物用dpni酶在37℃酶切反應1h。將酶切產物進行瓊脂糖凝膠電泳，並利用膠回收試劑盒回收質粒，取1ul質粒放入100ul的感受態細胞中，將細胞放入冰上30分鐘，42℃熱激90秒，加入400ullb培養基，37℃振蕩培養45分鐘後塗平板，37℃倒置過夜培養。挑去單克隆做為模板，利用sumo-f為上遊引物和fgf21-r為下遊引物進行pcr鑑定，其中fgf21-lg的鑑定結果如圖2所示，fgf21-ag的鑑定結構如圖3所示。經初步鑑定成功的fgf21突變體進行基因的測序與結果分析。樣品由生工生物工程(上海)有限公司進行序列測定。採用dnaman軟體進行序列分析。序列測定的結果：突變體fgf21-ag的核酸序列如seqidno.3所示，相應胺基酸序列如seqidno.4所示；突變體fgf21-lg的核酸序列如seqidno.5所示，相應胺基酸序列如seqidno.6所示。其構建載體示意圖見圖1。
將測序成功的含有編碼fgf21突變體的核酸序列的質粒轉化到bl21(de3)菌株中，挑取單克隆菌株進行擴大培養，並將菌株保存在-80℃冰箱中。
實施例2：人重組fgf21突變體的表達
將fgf21突變體菌株按2％的接種量接種於5mllb培養基(含100μg/ml氨苄青黴素)中，37℃、220rpm振蕩培養過夜，取過夜培養菌液按2％接種於每瓶中，每2000ml三角瓶裝500mllb培養基(含100μg/ml氨苄青黴素)。培養到od600為0.8時加入1.0miptg500ul，在25℃誘導表達4個小時。4℃，8000r/min離心10分鐘，棄上清，收集菌體，將菌體放於-80℃凍存。
實施例3：重組人fgf21突變體純化
(1)重組人fgf21突變體初純化
將表達得到的菌體用裂解緩衝液(50mmtris，300mmnacl，ph8.5)重懸，然後進行超聲破碎(30％功率，超2秒，停5秒，總時間45分鐘)，4℃14000rpm離心40分鐘，收集上清液。將上清液加入已經用緩衝液預平衡的ni-sepharose層析柱，4℃旋轉混合30分鐘。將溶液穿出後，用5倍柱體積的緩衝液衝洗以去除未結合的蛋白和雜質，再用5倍柱體積的含30mm咪唑的緩衝液(50mmtris，300mmnacl，ph8.5)將非特異性的雜蛋白洗脫下來，再用5倍柱體積的含300mm咪唑的緩衝液(50mmtris，300mmnacl，ph8.5)將目的蛋白洗脫下來，用sds-page檢測純化結果(結果見圖4)。
(2)重組人fgf21突變體酶切純化
檢測透析後的融合蛋白：以分子摩爾比為0.1％的比例加入sumo酶，在4℃下酶切2h，向酶切後的蛋白溶液加入終濃度為20mm咪唑，然後加入到已經用緩衝液(50mmtris，300mmnacl，ph8.5)預平衡的ni-sepharose層析柱上，4℃旋轉混合30分鐘。收集流穿的溶液，用濃縮管將樣品濃縮到10mg/ml，再經superdex75分子排阻層析柱純化，分子排阻層析緩衝液(20mmpbs，100mmnacl，ph7.2)，得到的蛋白即為fgf21突變體蛋白，實驗中的fgf21及突變體如fgf21-lg和fgf21-ag蛋白都是用上述方法純化。並經12％sds-page電泳檢測，其中fgf21-lg蛋白的sds-page凝膠電泳結果如圖5，fgf21-ag蛋白的sds-page凝膠電泳結果見圖6。
實施例4：fgf21突變體降血糖實驗
使用突變體蛋白進行動物降血糖實驗。將ob/ob小鼠模型分成3組，每組8隻，分別為載體對照組，即注射生理鹽水，fgf21組和fgf21-lg組，實施方式為背部皮下注射，0.1mg/kg/天，連續給藥七天，並且記錄每天給藥前的血糖值，如圖7所示，fgf21-lg(如圖7)組相對於野生型fgf21蛋白而言表現出更強的藥效。同樣，以fgf21-ag進行相同的實驗，實施方式為0.6mg/kg/天，並記錄每天給藥前的血糖值。實驗說明fgf21-ag同樣有很明顯的降血糖作用，結果如圖8所示。
實施例5：fgf21突變體降體重實驗
使用fgf21突變體蛋白進行動物的降體重試驗。將ob/ob小鼠分成4組，分別為載體對照組，即注射生理鹽水，fgf21組和人fgf21-lg組，fgf21-ag組，每組8隻。將純化後的蛋白按照0.6mg/kg/天給藥，連續給藥6天，並且記錄6天後體重變化，實驗證實fgf21-lg(如圖9)和fgf21-ag(如圖10)組相對於野生型fgf21蛋白具有更明顯的減輕體重作用，具有更強的藥效。
實施例6：熱穩定性試驗
使用人fgf21突變蛋白進行實驗，利用圓二色譜(cd)對fgf21及fgf21-lg進行變溫實驗，20-95℃，每5℃作為一個測試點進行測試。測試結果為fgf21的轉化溫度在69℃，而fgf21-lg的轉化溫度在98℃，實驗證明人fgf21-lg相對於野生型fgf21具有更強的熱穩定性(如圖11)。同樣，利用fgf21-ag，得到類似的cd結果。
可見，根據本發明的突變體與野生型相比具有更強的熱穩定性。
sequencelisting
中國科學院合肥物質科學研究院
人fgf21突變體、其製備方法及用途
ib177786
18
patentinversion3.1
1
181
prt
homosapiens
1
hisproileproaspserserproleuleuglnpheglyglyglnval
151015
argglnargtyrleutyrthraspaspalaglnglnthrglualahis
202530
leugluilearggluaspglythrvalglyglyalaalaaspglnser
354045
progluserleuleuglnleulysalaleulysproglyvalilegln
505560
ileleuglyvallysthrserargpheleucysglnargproaspgly
65707580
alaleutyrglyserleuhispheaspproglualacysserphearg
859095
gluleuleuleugluaspglytyrasnvaltyrglnserglualahis
100105110
glyleuproleuhisleuproglyasnlysserprohisargasppro
115120125
alaproargglyproalaargpheleuproleuproglyleupropro
130135140
alaleuprogluproproglyileleualaproglnproproaspval
145150155160
glyserseraspproleusermetvalglyproserglnglyargser
165170175
prosertyralaser
180
2
543
dna
homosapiens
2
caccccatccctgactccagtcctctcctgcaattcgggggccaagtccggcagcggtac60
ctctacacagatgatgcccagcagacagaagcccacctggagatcagggaggatgggacg120
gtggggggcgctgctgaccagagccccgaaagtctcctgcagctgaaagccttgaagccg180
ggagttattcaaatcttgggagtcaagacatccaggttcctgtgccagcggccagatggg240
gccctgtatggatcgctccactttgaccctgaggcctgcagcttccgggagctgcttctt300
gaggacggatacaatgtttaccagtccgaagcccacggcctcccgctgcacctgccaggg360
aacaagtccccacaccgggaccctgcaccccgaggaccagctcgcttcctgccactacca420
ggcctgccccccgcactcccggagccacccggaatcctggccccccagccccccgatgtg480
ggctcctcggaccctctgagcatggtgggaccttcccagggccgaagccccagctacgct540
tcc543
3
546
dna
人工序列
3
caccccatccctgactccagtcctctcctgcaattcgggggccaagtccggcagcggtac60
ctctacacagatgatgcccagcagacagaagcttgccacctggagatcagggaggatggg120
acggtggggtgcgctgctgaccagagccccgaaagtctcctgcagctgaaagccttgaag180
ccgggagttattcaaatcttgggagtcaagacatccaggttcctgtgccagcggccagat240
ggggccctgtatggatcgctccactttgaccctgaggcctgcagcttccgggagctgctt300
cttgaggacggatacaatgtttaccagtccgaagcccacggcctcccgctgcacctgcca360
gggaacaagtccccacaccgggaccctgcaccccgaggaccagctcgcttcctgccacta420
ccaggcctgccccccgcactcccggagccacccggaatcctggccccccagccccccgat480
gtgggctcctcggaccctctgagcatggtgggaggttcccagggccgaagccccagctac540
gcttcc546
4
182
prt
人工序列
4
hisproileproaspserserproleuleuglnpheglyglyglnval
151015
argglnargtyrleutyrthraspaspalaglnglnthrglualacys
202530
hisleugluilearggluaspglythrvalglycysalaalaaspgln
354045
serprogluserleuleuglnleulysalaleulysproglyvalile
505560
glnileleuglyvallysthrserargpheleucysglnargproasp
65707580
glyalaleutyrglyserleuhispheaspproglualacysserphe
859095
arggluleuleuleugluaspglytyrasnvaltyrglnsergluala
100105110
hisglyleuproleuhisleuproglyasnlysserprohisargasp
115120125
proalaproargglyproalaargpheleuproleuproglyleupro
130135140
proalaleuprogluproproglyileleualaproglnproproasp
145150155160
valglyserseraspproleusermetvalglyglyserglnglyarg
165170175
serprosertyralaser
180
5
546
dna
人工序列
5
caccccatccctgactccagtcctctcctgcaattcgggggccaagtccggcagcggtac60
ctctacacatcaggacctcatgggctctcaagttgccacctggagatcagggaggatggg120
acggtggggtgcgctgctgaccagagccccgaaagtctcctgcagctgaaagccttgaag180
ccgggagttattcaaatcttgggagtcaagacatccaggttcctgtgccagcggccagat240
ggggccctgtatggatcgctccactttgaccctgaggcctgcagcttccgggagctgctt300
cttgaggacggatacaatgtttaccagtccgaagcccacggcctcccgctgcacctgcca360
gggaacaagtccccacaccgggaccctgcaccccgaggaccagctcgcttcctgccacta420
ccaggcctgccccccgcactcccggagccacccggaatcctggccccccagccccccgat480
gtgggctcctcggaccctctgagcatggtgggaggttcccagggccgaagccccagctac540
gcttcc546
6
182
prt
人工序列
6
hisproileproaspserserproleuleuglnpheglyglyglnval
151015
argglnargtyrleutyrthrserglyprohisglyleusersercys
202530
hisleugluilearggluaspglythrvalglycysalaalaaspgln
354045
serprogluserleuleuglnleulysalaleulysproglyvalile
505560
glnileleuglyvallysthrserargpheleucysglnargproasp
65707580
glyalaleutyrglyserleuhispheaspproglualacysserphe
859095
arggluleuleuleugluaspglytyrasnvaltyrglnsergluala
100105110
hisglyleuproleuhisleuproglyasnlysserprohisargasp
115120125
proalaproargglyproalaargpheleuproleuproglyleupro
130135140
proalaleuprogluproproglyileleualaproglnproproasp
145150155160
valglyserseraspproleusermetvalglyglyserglnglyarg
165170175
serprosertyralaser
180
7
32
dna
人工序列
7
gggaattccatatgcatcatcatcatcatcac32
8
24
dna
人工序列
8
ccgctcgagtcaggaagcgtagct24
9
38
dna
人工序列
9
cagagaacagattggtggtcaccccatccctgactcca38
10
38
dna
人工序列
10
tggagtcagggatggggtgaccaccaatctgttctctg38
11
27
dna
人工序列
11
catggtgggaggttcccagggccgaag27
12
27
dna
人工序列
12
cttcggccctgggaacctcccaccatg27
13
27
dna
人工序列
13
gggacggtggggtgcgctgctgaccag27
14
27
dna
人工序列
14
ctggtcagcagcgcaccccaccgtccc27
15
28
dna
人工序列
15
cagcagacagaagcttgccacctggaga28
16
28
dna
人工序列
16
tctccaggtggcaagcttctgtctgctg28
17
58
dna
人工序列
17
agcggtacctctacacatcaggacctcatgggctctcaagttgccacctggagatcag58
18
58
dna
人工序列
18
ctgatctccaggtggcaacttgagagcccatgaggtcctgatgtgtagaggtaccgct58