從禾葉山麥冬中分離製備禾葉山麥冬皂苷a的方法
2023-06-09 17:05:36
專利名稱：從禾葉山麥冬中分離製備禾葉山麥冬皂苷a的方法
技術領域：
本發明屬於輕工技術領域，涉及禾葉山麥冬活性成分的提取分離和製備，特別是 從禾葉山麥冬中分離製備禾葉山麥冬皂苷A的方法。
背景技術：
禾葉山麥冬的塊根做山麥冬入藥，屬於民間地方用藥；其藥用功能能清心潤肺， 養胃生津，除煩，止血；用於急、慢性支氣管炎，肺熱咳嗽，吐血，咯血，熱病煩渴，口腔潰瘍 等。進一步的藥理研究證實留體皂苷類成分是能代表山麥冬活性的一類成分，國內外研究 表明很多留體皂苷具有防治心血管疾病、抗腫瘤，提高免疫等活性。從禾葉山麥冬中提取皂 苷，至今未有相關文獻報導。
發明內容
本發明要解決的技術問題是提供一種工藝簡潔、成本低廉的從禾葉山麥冬中分離 製備禾葉山麥冬皂苷A的方法。為了解決上述技術問題，本發明提供一種從禾葉山麥冬中分離製備禾葉山麥冬皂 苷A的方法，包括以下步驟1)、將禾葉山麥冬塊狀根粉碎後作為原料，採用乙醇回流浸提，所得浸提液濃縮後
得浸膏；2)、將浸膏用正丁醇萃取，浸膏與正丁醇的體積比為1 1，得皂苷萃取液；將皂苷 萃取液真空濃縮後，得正丁醇相萃取物；3)、將正丁醇相萃取物採用DlOl型大孔樹脂分離，分別用水以及質量濃度分別為 25%、50%、75%和95%的乙醇溶液洗脫不同極性的組分，得到初步純化的皂苷洗脫液；4)、將75%乙醇溶液所得的皂苷洗脫液真空濃縮至糊狀，再冷凍乾燥，得皂苷粗提 物；5)、採用逆流色譜方法分離純化皂苷粗提物，得皂苷組分；6)、皂苷組分進行真空濃縮，直至固形物濃度達到60%以上，再採用冷凍乾燥，得 粉末狀的禾葉山麥冬皂苷A。作為本發明的從禾葉山麥冬中分離製備禾葉山麥冬皂苷A的方法的改進步驟5) 的逆流色譜方法為採用逆流色譜儀為分離設備，由體積比為1 3 4 3 1 3的正 丁醇、水、正己烷和甲醇組成溶劑系統，溶劑系統上相作固定相，下相作流動相；將固定相注 入逆流色譜儀的色譜柱，以流動相作為溶劑溶解步驟4)所得的皂苷粗提物作為逆流色譜 樣品溶液；開啟逆流色譜儀和流動相輸液泵，將樣品溶液和流動相輸入逆流色譜分離柱，用 紫外-可見檢測器檢測逆流色譜流出液，根據所得的色譜圖收集皂苷組分。作為本發明的從禾葉山麥冬中分離製備禾葉山麥冬皂苷A的方法的進一步改進 步驟1)中的浸提為乙醇與原料的液料體積比為5 10ml/lg，浸提時間為2. 5 3. 5小 時；浸提次數為2 3次。
作為本發明的從禾葉山麥冬中分離製備禾葉山麥冬皂苷A的方法的進一步改進 步驟2)、步驟4)和步驟6)的真空濃縮均為真空度低於0. 09Mpa，溫度為60 70°C。作為本發明的從禾葉山麥冬中分離製備禾葉山麥冬皂苷A的方法的進一步改進 步驟4)和步驟6)的冷凍乾燥均為真空度低於50Pa，溫度-38°C _35°C。作為本發明的從禾葉山麥冬中分離製備禾葉山麥冬皂苷A的方法的進一步改進 逆流色譜儀為高速逆流色譜儀(HSCCC)。在本發明的方法中，採用逆流色譜方法分離純化皂苷粗提物，溶劑系統由常溫常 壓下處於液態的正丁醇、水、正己烷和甲醇溶液組成；並且取用該溶劑系統的部分下相來溶 解皂苷粗提物從而製備皂苷組分。本發明所得的禾葉山麥冬皂苷A特徵和性能如下白色粉末，mp255 256 °C，微溶於甲醇，易溶於吡啶等，Liebermann-Burchard 反應陽性(墨綠色)，molish反應呈陽性(界面出現紫色環)。分子量為1002，分子式為 C49H78O21，結構式如下 禾葉山麥冬皂苷A的質譜及核磁譜圖分別如圖2 圖9所示，具體為MS譜如圖2 所示；1H-NMR譜如圖3所示；13C-NMR譜如圖4所示，DEPT 90圖如圖5所示，DEPT 135圖如 圖6所示，1H-1H COSY譜如圖7所示，HSQC譜如圖8所示，HMBC譜如圖9所示。採用MTT法對禾葉山麥冬皂苷A進行體外腫瘤細胞增殖抑制試驗。具體為取對 數生長期腫瘤細胞，調整細胞懸液濃度，每孔100 μ 1細胞懸液接種於96孔細胞培養板中， 接種24h後給藥(100 μ 1/孔)，分別設細胞對照組以及4個濃度受試藥物組。繼續培養72h 後每孔加入100 μ 1 MTT(lmg/ml,以DMEM培養液溶解)，37°C孵育4h，棄去各孔內液體後加 入150 μ 1酸化異丙醇(含0. 04mol/L HCl)，避光放置30min，DG3022A型酶聯免疫檢測儀測 定570nm處吸光度，計算受試藥物對腫瘤細胞的增殖抑制率，以孫瑞元教授編寫的NDST計 算機程序計算受試藥物對腫瘤細胞增殖(72h)的半數抑制濃度(IC5tl)。不同濃度受試物禾葉山麥冬皂苷A對人宮頸癌Hela細胞及人肝癌SMMC-7721細 胞的體外增殖抑制率見表1、2，受試物禾葉山麥冬皂苷A作用細胞72h的半數抑制濃度 (IC50)見表 3。
表1受試物禾葉山麥冬皂苷A對Hela細胞生長的抑制作用 表2受試物禾葉 山麥冬皂苷A對SMMC-7721細胞生長的抑制作用 表3受試物禾葉山麥冬皂苷A抑制Hela和SMMC-7721細胞生長的IC5tl (72h)值 結果表明受試物禾葉山麥冬皂苷A對人宮頸癌Hela細胞及人肝癌SMMC-7721細 胞均具有較好的體外增殖抑制作用，IC50分別為26. 1 士4. 4μ g/ml和76. 4士20. 6μ g/ml。上述禾葉山麥冬皂苷A實際使用時，其用法和用量如下注射，5 15mg禾葉山麥 冬皂苷A/kg (體重)。本發明的優點是使用基於液_液分配的逆流色譜技術，分離重現性好，是一種經 濟、高效的從禾葉山麥冬中分離製備高純度禾葉山麥冬皂苷A的方法。
下面結合附圖對本發明的具體實施方式
作進一步詳細說明。圖1為本發明的工藝流程圖；圖2為禾葉山麥冬皂苷A的MS譜；圖3為禾葉山麥冬皂苷A的1H-NMR譜；圖4為禾葉山麥冬皂苷A的13C-WR譜；圖5為禾葉山麥冬皂苷A的DEPT 90圖；圖6為禾葉山麥冬皂苷A的DEPT 135圖；圖7為禾葉山麥冬皂苷A的1H-1H COSY譜；圖8為禾葉山麥冬皂苷A的HSQC譜；圖9為禾葉山麥冬皂苷A的HMBC譜；圖10是實施例1的HSCCC分離圖譜；圖11為實施例1分離所得的禾葉山麥冬皂苷A的HPLC圖譜；圖12為實施例2的HSCCC分離圖譜；圖13為實施例2分離所得的禾葉山麥冬皂苷A的HPLC圖譜；圖14為實施例3的HSCCC分離圖譜；
圖15為實施例3分離所得的禾葉山麥冬皂苷A的HPLC圖譜。
具體實施例方式實施例1、一種從禾葉山麥冬中分離製備禾葉山麥冬皂苷A的方法，依次進行以下 步驟1)、將禾葉山麥冬塊狀根粉碎後作為原料，以乙醇作為浸提溶劑，浸提3次，每次 的浸提條件如下乙醇與原料的液料體積比為8ml/lg，於80°C浸提3小時；合併3次所得浸提液，於50°C濃縮後得浸膏。2)、將浸膏用正丁醇萃取，浸膏與正丁醇的體積比為1 1，得皂苷提取液；將該皂 苷提取液真空濃縮(真空度低於0. 09Mpa，溫度為60 70°C )後，得正丁醇相萃取物。3)、將正丁醇相萃取物採用DlOl型大孔樹脂分離在正丁醇相萃取物中加以適量 去離子水(Ig正丁醇相萃取物加入IOml的去離子水)，超聲使其溶解完全，倒入活化好的 DlOl型大孔樹脂柱中，打開玻璃柱底端的旋塞，使溶液緩慢流出，這樣有利於樹脂對樣品的 充分吸附。第一次上樣時下端流出的溶液顏色較深，說明樣品沒有吸附完全，反覆上樣3 4次，使樣品被充分吸附。首先用大量的去離子水洗至無糖，然後依次用質量濃度分別為 25%、50%、75%和95%的乙醇溶液洗脫，控制流速為2BV/h，每次洗脫至流出液沒有顏色。 75%的乙醇洗脫液洗脫得到的是初步純化的皂苷洗脫液。4)、將初步純化的皂苷洗脫液真空濃縮(真空度低於0.09Mpa，溫度為60 70°C) 至糊狀，再冷凍乾燥(真空度低於50Pa，溫度-36°C)，得皂苷粗提物。經HPLC檢測，皂苷粗 提物中禾葉山麥冬皂苷A約佔30%。5)、採用逆流色譜方法分離純化皂苷粗提物，依次進行以下步驟採用逆流色譜儀為分離設備，該逆流色譜儀選用HSCCC-D1200高速逆流色譜儀。溶劑系統由正丁醇水正己烷甲醇=2:4:3: 2(體積比)組成；即量取 正丁醇500ml、水IOOOml、正己烷750ml，甲醇500ml，置於3000ml分液漏鬥，充分搖勻，靜置 分層後，將上下兩相分別裝入試劑瓶。以該溶劑系統的上相作為固定相，下相作為流動相。取1200ml上相以40ml/min的流速注入高速逆流色譜的色譜柱。稱取步驟4)所 得的皂苷粗提物10. Og溶於150ml下相中製備逆流色譜樣品溶液。開啟逆流色譜儀至900 轉/min，然後以2. Oml/min的流速輸入逆流色譜樣品溶液，待進樣結束後，再以5. Oml/min 的流速輸入流動相(剩餘的下相)以洗脫柱內的組分，用紫外可見檢測器在210nm下檢測 逆流色譜流出液，根據檢測器採集的色譜圖(如圖10所示)收集禾葉山麥冬皂苷A組分。 艮口，在360 430min時間段收集的是禾葉山麥冬皂苷A組分。6)、禾葉山麥冬皂苷A組分進行真空濃縮(真空度低於0.09Mpa，溫度為60 700C )，直至固形物濃度達到60%以上，再採用冷凍乾燥(真空度低於50Pa，溫度_36°C )， 得 2. 325g粉末狀的禾葉山麥冬皂苷A，經HPLC檢測，其純度達91%以上。該禾葉山麥冬皂苷A的HPLC圖譜如圖11所示。
實施例2、一種從禾葉山麥冬中分離製備禾葉山麥冬皂苷A的方法，依次進行以下 步驟1) 4)，同實施例1。
5)、採用逆流色譜方法分離純化皂苷粗提物，依次進行以下步驟採用逆流色譜儀為分離設備，該逆流色譜儀選用HSCCC-D1200高速逆流色譜儀。溶劑系統由正丁醇水正己烷甲醇=3:4:3: 1(體積比)組成；即量取 正丁醇750ml、水IOOOml、正己烷750ml，甲醇250ml，置於3000ml分液漏鬥，充分搖勻，靜置 分層後，將上下兩相分別裝入試劑瓶。取1200ml上相以40ml/min的流速注入高速逆流色譜的色譜柱。稱取皂苷粗提物 10. Og溶於150ml下相中製備逆流色譜樣品溶液，開啟逆流色譜儀至900轉/min，然後以 2. Oml/min的流速輸入樣品溶液，待進樣結束後，再以10. Oml/min的流速輸入流動相(剩餘 的下相)以洗脫柱內的組分，用紫外可見檢測器在210nm下檢測逆流色譜流出液，根據檢測 器採集的色譜圖(如圖12所示)收集禾葉山麥冬皂苷A組分。S卩，在200 240min時間 段收集的是禾葉山麥冬皂苷A組分。 6)、同實施例1，最終得2. 576g粉末狀的禾葉山麥冬皂苷A，經HPLC法檢測，其純 度達87%以上。該禾葉山麥冬皂苷A的HPLC圖譜如圖13所示。實施例3、一種從禾葉山麥冬中分離製備禾葉山麥冬皂苷A的方法，依次進行以下 步驟1) 4)，同實施例1。5)、採用逆流色譜方法分離純化皂苷粗提物，依次進行以下步驟採用逆流色譜儀為分離設備，該逆流色譜儀選用HSCCC-D400高速逆流色譜儀。溶劑系統由正丁醇水正己烷甲醇=2:4:3: 2. 5 (體積比)組成；量取 正丁醇400ml、水800ml、正己烷600ml，甲醇500ml，置於3000ml分液漏鬥，充分搖勻，靜置 分層後，將上下兩相分別裝入試劑瓶。取400ml上相以20ml/min的流速注入高速逆流色譜的色譜柱。稱取皂苷粗提 物2. Og溶於50ml下相中製備逆流色譜樣品溶液，開啟逆流色譜儀至800轉/min，然後以 1. Oml/min的流速輸入樣品溶液，待進樣結束後，再以2. Oml/min的流速輸入流動相(剩餘 的下相)以洗脫柱內的組分，用紫外可見檢測器在210nm下檢測逆流色譜流出液，根據檢測 器採集的色譜圖(如圖14所示)收集禾葉山麥冬皂苷A組分。S卩，在270 330min時間 段收集的是禾葉山麥冬皂苷A組分。6)、同實施例1，最終得495mg粉末狀的禾葉山麥冬皂苷A，經HPLC法檢測，其純度 達92%以上。該禾葉山麥冬皂苷A的HPLC圖譜如圖15所示。最後，還需要注意的是，以上列舉的僅是本發明的若干個具體實施例。顯然，本發 明不限於以上實施例，還可以有許多變形。本領域的普通技術人員能從本發明公開的內容 直接導出或聯想到的所有變形，均應認為是本發明的保護範圍。
權利要求
一種禾葉山麥冬皂苷A，其特徵是結構式如下FSA00000178758100011.tif
2.一種從禾葉山麥冬中分離製備禾葉山麥冬皂苷A的方法，其特徵是包括以下步驟1)、將禾葉山麥冬塊狀根粉碎後作為原料，採用乙醇回流浸提，所得浸提液濃縮後得浸膏；2)、將所述浸膏用正丁醇萃取，浸膏與正丁醇的體積比為1 1，得皂苷萃取液；將所述 皂苷萃取液真空濃縮後，得正丁醇相萃取物；3)、將正丁醇相萃取物採用DlOl型大孔樹脂分離，分別用水以及質量濃度分別為 25%、50%、75%和95%的乙醇溶液洗脫不同極性的組分，得到初步純化的皂苷洗脫液；4)、將75%乙醇溶液所得的皂苷洗脫液真空濃縮至糊狀，再冷凍乾燥，得皂苷粗提物；5)、採用逆流色譜方法分離純化皂苷粗提物，得皂苷組分；6)、皂苷組分進行真空濃縮，直至固形物濃度達到60%以上，再採用冷凍乾燥，得粉末 狀的禾葉山麥冬皂苷A。
3.根據權利要求2所述的從禾葉山麥冬中分離製備禾葉山麥冬皂苷A的方法，其 特徵是所述步驟5)的逆流色譜方法為採用逆流色譜儀為分離設備，由體積比為1 3:4:3: 1 3的正丁醇、水、正己烷和甲醇組成溶劑系統，所述溶劑系統上相作固定相， 下相作流動相；將所述固定相注入逆流色譜儀的色譜柱，以流動相作為溶劑溶解步驟4)所 得的皂苷粗提物為逆流色譜樣品溶液；開啟逆流色譜儀和流動相輸液泵，將樣品溶液和流 動相輸入逆流色譜分離柱，用紫外-可見檢測器檢測逆流色譜流出液，根據所得的色譜圖 收集皂苷組分。
4.根據權利要求3所述的從禾葉山麥冬中分離製備禾葉山麥冬皂苷A的方法，其特徵 是所述步驟1)中的浸提為乙醇與原料的液料體積比為5 10ml/lg，浸提時間為2. 5 3. 5小時；浸提次數為2 3次。
5.根據權利要求4所述的從禾葉山麥冬中分離製備禾葉山麥冬皂苷A的方法，其特 徵是所述步驟2)、步驟4)和步驟6)的真空濃縮均為真空度低於`0.09Mpa，溫度為60 70 "C。
6.根據權利要求5所述的從禾葉山麥冬中分離製備禾葉山麥冬皂苷A的方法，其特徵 是所述步驟4)和步驟6)的冷凍乾燥均為真空度低於50Pa，溫度-38°C _35°C。
7.根據權利要求6所述的從禾葉山麥冬中分離製備禾葉山麥冬皂苷A的方法，其特徵 是所述逆流色譜儀為高速逆流色譜儀HSCCC。
全文摘要
本發明公開了一種禾葉山麥冬皂苷A；還公開了其製備方法，包括以下步驟1)將禾葉山麥冬塊狀根粉碎後作為原料，採用乙醇回流浸提；2)將所得的浸膏用正丁醇萃取，然後真空濃縮；3)將所得的正丁醇相萃取物採用D101型大孔樹脂分離，分別用水以及不同質量濃度的乙醇溶液洗脫不同極性的組分；4)將75％乙醇溶液所得的皂苷洗脫液真空濃縮、冷凍乾燥；5)採用逆流色譜方法分離純化皂苷粗提物；6)皂苷組分進行真空濃縮，再冷凍乾燥，得禾葉山麥冬皂苷A。禾葉山麥冬皂苷A對人宮頸癌Hela細胞及人肝癌SMMC-7721細胞均具有較好的體外增殖抑制作用。
文檔編號A61K31/7048GK101863953SQ201010212790
公開日2010年10月20日 申請日期2010年6月30日 優先權日2010年6月30日
發明者沈蓮清, 王偉, 王奎武 申請人:浙江工商大學