流式微球檢測人心肌鈣蛋白t的方法

2023-06-09 10:10:46

專利名稱：流式微球檢測人心肌鈣蛋白t的方法
技術領域：
本發明屬於生物物質的分析方法，具體來說，屬於流式細胞分析中的流式微球分 析技術方法。
背景技術：
心肌肌鈣蛋白是目前診斷心肌損傷、壞死時特異度最高和敏感性較高的生物標誌 物，在急性冠脈症候群(ACS)的危險分層中也有重要的應用價值，是檢測心肌損傷和壞死 的「金標準」。目前，檢測人心肌鈣蛋白T的方法主要有1.免疫金標法，能進行快速定性 或半定量；2.電化學發光法，靈敏(最低檢測限10pg/mL)、精密，但試劑成本高，需價值昂 貴的電化學發光儀；3.免疫比濁法，實用、方便、快速、成本低，但是影響因素較多，如抗原 或者抗體過量，可以出現可溶性複合物，造成誤差，標本中血脂含量影響濁度，造成假性增 高，不利於檢驗方法的統一和比對；其它方法，如放免、酶免等，實用性差。目前臨床上檢測 人心肌鈣蛋白T方法眾多，也有一些專利技術方案，例如200720140932. 1號「人肌紅蛋白/ 肌酸激酶同工酶/心肌鈣蛋白I診斷試紙」、200720140929. X號「心肌鈣蛋白I顏色顆粒診 斷試紙」、200780010683. 7號「在有症狀的患者中鑑別急性和慢性心肌壞死的工具和方法」、 200810036418. 2號「肌鈣蛋白I血清快速檢測試劑盒(膠體金法)」等，但都存在著標準化 問題。流式細胞分析是以高能量雷射照射高速流動狀態下被螢光色素染色的單細胞或 微粒，測量其產生的散射光和發射螢光的強度，從而對細胞(或微粒)的物理、生化、免疫、 遺傳、分子生物學性狀及功能定性或定量檢測的一種現代細胞分析技術。流式微球分析技 術是使用單克隆抗體包被聚苯乙烯微球，捕獲檢測物，再加入螢光檢測抗體，具有敏感性 高，特異性強，最低檢測限可以達到10pg/ml。

發明內容
本發明的目的在於提供流式微球檢測人心肌鈣蛋白T的方法，實現在流式細胞儀 檢測微球上的螢光強度來間接檢測標本中人心肌鈣蛋白T的含量。發明人提供的流式微球檢測人心肌鈣蛋白T的方法包括3個步驟，即先進行微球 激活，再單克隆抗體偶聯，最後進行人心肌鈣蛋白T的檢測；具體做法是激活微球後，製備 羧基化微球偶聯鼠抗人心肌鈣蛋白T的單克隆抗體，然後捕獲標本中的人心肌鈣蛋白T， 再加入羊抗人肌鈣蛋白τ的多抗和FITC(異硫氰酸螢光素)標記的驢抗羊的免疫球蛋白 G(IgG)，FITC的強度與微球捕獲的人心肌鈣蛋白T的分子數成線性相關。因此，通過在流 式細胞儀上檢測微球上FITC的螢光強度，即可間接檢測標本中人心肌鈣蛋白T的含量。本發明的方法可將單抗偶聯微球、羊抗人心肌鈣蛋白T的多克隆抗體、異硫氰酸 螢光素標記的驢抗羊的IgG製成商品試劑盒，隨時可對人心肌鈣蛋白T進行檢測。本方法 簡便易行，能夠快捷地檢測人心肌鈣蛋白T，為診斷疾病提供依據。適用於各類醫院，尤其適 用於治療心血管病症的醫院。
具體實施例方式按照以下步驟檢測人心肌鈣蛋白T 第一步微球激活①取100 μ L微球原液(約1. 25 X IO6個微球)放入1. 5mL離心管裡，漩渦振蕩器 震蕩微球30s，用超聲波清洗器清洗微球30s。轉速14000r/min (離心半徑IOcm)下離心 4min，小心棄上清； ②加入100 μ L的微球洗滌緩衝液[ρΗ 7. 4的磷酸鹽緩衝液(PBS)配製的5%土 溫-20]，漩渦震蕩10s，超聲波清洗10s，轉速14000r/min (離心半徑IOcm)下離心4min，小 心棄上清；③重懸微球於80 μ L激活緩衝液(0. ImoVLNaH2PO4, ρΗ = 6. 2)，漩渦震蕩30s，超 聲波清洗30s ；④用激活緩衝液配置新鮮的50mg/mL的EDC(1_乙基_3-(3_ 二甲氨基丙基)碳二 亞胺鹽)和50mg/mL的Sul fo-NHS (硫化N-羥基琥珀醯亞胺)，然後在激活的微球裡分別 各加入10 μ L，室溫避光搖震20min ；⑤加入150 μ L PBS，高速漩渦震蕩10s，轉速14000r/mi η (離心半徑IOcm)下離 心4min，小心棄上清；⑥重懸激活微球於100 μ L PBS中，漩渦震蕩30s，超聲波清洗15s。第二步單克隆抗體偶聯①加入10 μ g的鼠抗人心肌鈣蛋白T單克隆抗體到激活的微球裡，用PBS調節最 終體積至500 μ L，室溫避光搖震2h ；②轉速14000r/min (離心半徑IOcm)下離心4min，小心棄上清；③加入500 μ L PBS，轉速14000r/min (離心半徑IOcm)下離心4min，小心棄上清；④重懸微球於250 μ L封閉儲存緩衝液(PBS配製的1 %苯磺醯胺和0. 05% NaN3)， 漩渦震蕩15s，室溫避光搖震30min ；⑤轉速14000r/min (離心半徑IOcm)下離心4min，小心棄上清；⑥加入500 μ L封閉儲存緩衝液(PBS配製的苯磺醯胺和0.05% NaN3)，轉速 14000r/min (離心半徑IOcm)下離心6min，小心棄上清；⑦重懸於200 μ L封閉儲存緩衝液，用血細胞計數板計算微球的濃度，4°C下避光 保存備用。此單抗偶聯微球可批量生產，在低溫(4°C左右)避光可長期保存。第三步人心肌鈣蛋白T的檢測①取約10000個包被好的微球，加入50 μ L標本，再分別加入50 μ L羊抗人心肌鈣 蛋白T的多克隆抗體和50 μ L FITC(異硫氰酸螢光素)標記的驢抗羊的IgG，避光室溫搖震 反應30min ；②轉速14000r/min (離心半徑IOcm)下離心4min，小心棄上清；③加入200 μ L緩衝液(PBS配製的％苯磺醯胺)，漩渦震蕩重懸，轉速14000r/ min (離心半徑IOcm)下離心4min,小心棄上清；④再加入200 μ L緩衝液(PBS配製的％苯磺醯胺)，漩渦重懸，上流式細胞儀檢測，觀測微球上FITC的螢光強度，即可間接檢測標 本中人心肌鈣蛋白T的含量。
權利要求
1.流式微球檢測人心肌鈣蛋白T的方法，其特徵包括3個步驟，即先進行微球激活，再 單克隆抗體偶聯，最後進行人心肌鈣蛋白T的檢測；具體做法是先激活微球，接著製備羧 基化微球偶聯鼠抗人心肌鈣蛋白T的單克隆抗體，然後捕獲標本中的人心肌鈣蛋白T，再加 入羊抗人肌鈣蛋白T的多抗和異硫氰酸螢光素標記的驢抗羊的免疫球蛋白G ；通過在流式 細胞儀上檢測微球上FITC的螢光強度，即可間接檢測標本中人心肌鈣蛋白T的含量。
全文摘要
流式微球檢測人心肌鈣蛋白T的方法，該方法包括3個步驟，即先進行微球激活，再單克隆抗體偶聯，最後進行人心肌鈣蛋白T的檢測；具體做法是先激活微球，接著製備羧基化微球偶聯鼠抗人心肌鈣蛋白T的單克隆抗體，然後捕獲標本中的人心肌鈣蛋白T，再加入羊抗人肌鈣蛋白T的多抗和異硫氰酸螢光素標記的驢抗羊的免疫球蛋白G；通過在流式細胞儀上檢測微球上FITC的螢光強度，即可間接檢測標本中人心肌鈣蛋白T的含量。本方法可將單抗偶聯微球、羊抗人心肌鈣蛋白T的多克隆抗體、異硫氰酸螢光素標記的驢抗羊的IgG製成商品試劑盒，隨時可對人心肌鈣蛋白T進行檢測。方法簡便易行，能快捷地檢測人心肌鈣蛋白T，為診斷疾病提供依據。
文檔編號G01N33/577GK102128934SQ201010041810
公開日2011年7月20日 申請日期2010年1月13日 優先權日2010年1月13日
發明者許健, 鄭金鼎, 黃山 申請人:貴州省臨床檢驗中心