一種gm-csf-tat-cea重組蛋白及其方法和應用的製作方法

2023-06-09 22:03:11

專利名稱：一種gm-csf-tat-cea重組蛋白及其方法和應用的製作方法
—種GM-CSF-TAT-CEA重組蛋白及其方法和應用[技術領域]
本發明涉及一種重組蛋白及其方法和應用，具體為一種GM-CSF-TAT-CEA重組蛋白及其方法和應用。[背景技術]
腫瘤發生發展的根本原因之一是機體的免疫系統不能對其生長進行有效地控制， 對此加以糾正，使機體的免疫系統能有效產生對腫瘤細胞的免疫排斥反應是近百年來人們一直研究的課題。腫瘤疫苗是該方面研究的主要內容，在眾多的腫瘤疫苗中，根據抗原提呈細胞在腫瘤免疫中的重要作用而設計的樹突狀細胞(dendritic cells, DC)瘤苗是目前研究最熱門方向。機體的免疫應答首先由抗原遞呈細胞(antigen presenting cell,APC)捕獲、加工和處理抗原，再將抗原遞呈給T，B淋巴細胞，從而引發一系列的免疫應答。樹突狀細胞(dendritic cell, DC)作為功能最強的APC,能激活靜息型T細胞(naive T cell), 激發初始免疫應答，在體內發揮強大的免疫監視功能。腫瘤患者體內DC功能缺陷，不能有效遞呈腫瘤抗原，導致免疫無能或免疫耐受，使腫瘤得以發生發展。應用DC瘤苗治療腫瘤最引人矚目的研究工作是應用抗原或抗原多肽在體外衝擊致敏(pulsing) DC，然後將之回輸或免疫接種至行瘤宿主，進行腫瘤免疫治療，已證明該療法能顯著地誘導機體產生抗原特異性CTL，產生保護性免疫反應並能治療已建立的荷瘤模型，這些研究為腫瘤的治療提供了新的思路，將DC過繼回輸已在臨床用於腫瘤病人的治療，取得了一定療效，表明該療法具有一定的臨床應用的可行性。
DC的抗原遞呈功能是DC瘤苗抗腫瘤免疫治療的基礎，DC的體外大量誘導擴增是 DC瘤苗抗腫瘤免疫治療的前提，DC瘤苗的體外構建是DC瘤苗的抗腫瘤免疫治療的關鍵。 [發明內容]
針對現階段應用常規方法所誘導的DC細胞具有抗原特異性不高以及過早凋亡等方面的不足。本發明提供了一種GM-CSF -TAT - CEA重組蛋白的製備方法，使誘導的DC細胞在抗原特異性和生存周期上都有了很大程度的提高，為後續的特異性免疫應答提供了很好的基礎條件。本發明為腫瘤免疫治療奠定了良好的基礎。
為實現上述目的，設計一種GM-CSF-TAT-CEA重組蛋白，其胺基酸序列表如SEQ ID NO 1所示。
本發明還涉及一種製備上述重組蛋白的方法，該方法由以下步驟組成
a.將GM-CSF、TAT和CEA通過酶切克隆到質粒pET_15b的克隆位點中構建重組質粒，
b.重組質粒轉化大腸桿菌BL2細胞，進行重組蛋白的表達，
c.重組蛋白轉化體的純化收集通過N1-NTA柱分離純化所述的重組蛋白。
在所述的步驟(a)中的酶切為在GM-CSF的基因序列兩端添加酶切位點Nde I和 Nco I，在TAT的基因序列兩端添加酶切位點Xho I和Nde I，以及在CEA的基因序列兩端添加酶切位點BamH I和Xho I。
本發明的重組蛋白可應用於腫瘤治療藥物。
本發明還包括一種上述重組蛋白製備DC疫苗的方法，將所述重組蛋白刺激誘導健康C57BL/6小鼠經由骨髓製備的DC細胞，製得DC疫苗。
所述的重組蛋白的濃度為25 100ug/ml,優選為25 50ug/ml。
本發明將特異性的腫瘤抗原與DC瘤苗相關因子基因相重組，得到可腫瘤免疫治療所需的特異、高效的重組蛋白。無論從理論上還是實際治療上都有著很大的進步。隨著 DC體外誘導擴增技術的發展及分子生物學技術和基因工程技術應用於DC瘤苗構建方法的發現，使得產量增大、純度提高、製備更容易等優點，更能滿足實驗和臨床研究的需要。DC 瘤苗用於腫瘤免疫治療的實驗和臨床研究更趨成熟，DC瘤苗有望成為腫瘤免疫治療的一種有效方式。故發明了一種腫瘤特異性抗原結合細胞因子等刺激DC細胞製備DC疫苗所需的 GM-CSF-TAT-CEA重組蛋白，並可有效激發體內抗原特異性免疫反應用於腫瘤的預防及治療。
與常規利用腫瘤細胞裂解物誘導DC細胞的方法相比，本發明創新優越之處有以下幾點首先，利用基因工程方法將腫瘤特異性抗原和轉導蛋白以及體外誘導DC細胞的關鍵試劑GM-CSF結合，製備出具有特異性且能延緩DC細胞壽命的融合蛋白，保證了 DC細胞存活時間的延長以及特異性免疫應答的啟動；其次，重組蛋白的成功製備，避免了常規DC 細胞培養中GM-CSF的額外添加，解決了培養周期中GM-CSF不足的缺點，並且共表達GM-CSF 還可促進細胞毒作用；再者增強了腫瘤抗原的特異性，針對性的解決了以CEA為標誌性抗原的腫瘤免疫治療，為腫瘤臨床治療提供了新的依據。[


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圖1是不同疫苗刺激機體ELSPOT檢測IFN-gama斑點數的圖表，
圖2是不同疫苗刺激機體特異性反應ELSPOT檢測IFN-gama斑點數的圖表，
圖3是不同組腫瘤塊體積的圖表，
圖4是不同劑量重組蛋白刺激機體特異反應ELSPOT檢測分析圖表，
圖5是MC-38-cea2細胞毒實驗圖表，
圖6是MC38細胞毒實驗圖表，
圖7圖7是質粒pET-15b的圖譜[具體實施方式
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為了使本發明的目的、技術方案及優點更加清楚明白，對本發明進行進一步詳細說明。本申請中的生產設備都是本領域的常用設備，應當理解，此處所描述的具體實施例僅僅用以解釋本發明，並不用於限定本發明。
實施例1:
本實施例中
人源結腸癌Lovo細胞株特異性抗原CEA來自NCBI，序列號為CAE75559 ；
TAT跨膜肽來自NCBI，序列號為NP_057853，
粒細胞集落刺激生長因子GM-CSF來自NCBI，序列號為AAA52578。
質粒pET_15b圖譜如圖7所示，
a、利用基因合成技術，分別合成人源結腸癌Lovo細胞株特異性抗原CEA的基因序列、TAT跨膜肽的基因序列以及GM-CSF的基因序列。其中，粒細胞集落刺激生長因子 GM-CSF基因序列兩端加酶切位點Nde I和Nco I ；TAT跨膜肽的基因序列兩端加酶切位點 Xho I和Nde I ;在CEA基因序列兩端加酶切位點BamH I和Xho I ;利用基因重組技術將合成的這三段基因序列通過酶切克隆到質粒pET-15b上面構建成重組質粒；再將重組質粒轉染大腸桿菌BL2細胞，並確保細胞密度在2 X IO6進行轉染，37°C培養4天後取出細胞懸液； 利用N1-NTA柱分離純化GM-CSF-TAT-CEA重組蛋白，即可得到GM-CSF-TAT-CEA重組蛋白， 其胺基酸序列為 GM-CSF27-138aa-TAT47-57-CEA605-613，詳細如 SEQ ID NO:1 所示。
其中結腸癌Lovo細胞株和質粒pET_15b為本公司所有；其中CEA、TAT跨膜肽和粒細胞集落刺激生長因子GM-CSF的相關基因序列為第三方合成提供。
b、構建表達人源CEA的小鼠結腸癌細胞株MC-38，即 MC-38_cea2細胞株，並用 DMEM培養基，10%熱滅活的胎牛血清，100U/ml青黴素，100ug/ml鏈黴素，2mmol的L-穀氨醯胺進行培養；
C、選取C57BL/6小鼠，並以IX IO6個細胞數量按照每2天進行腹腔注射，以構建 MC-38-cea2動物模型；
d、取健康C57BL/6小鼠四肢骨骨髓製備成單細胞懸液，去除紅細胞，加入完全培養基、IL-4等細胞因子，體外誘導出小鼠DC細胞，再加入已獲得的GM-CSF-TAT-CEA重組蛋白，37°C、5%C02條件下進行培養誘導、以激活得到DC疫苗。
㈠常規方法與GM-CSF-TAT-CEA重組蛋白誘導DC激發機體免疫反應能力的對比常規方法是指，利用腫瘤細胞株裂解物去誘導DC細胞。
取兩種方法誘導的DC疫苗回輸C57BL/6小鼠，利用酶聯免疫斑點法(ELISPOT)檢測疫苗回輸後T細胞產生IFN-gama的量，以及CD4+和CD8+ T細胞應答產生IFN-gama的量去評估機體產生特異性免疫反應的能力。
由圖1數據顯示，GM-CSF -TAT - CEA重組蛋白誘導機體產生免疫反應的能力要高於常規方法，且兩者之間的差異具有統計學意義(P < O. 05)。
由圖2數據顯示，GM-CSF -TAT - CEA重組蛋白刺激機體產生CEA特異性免疫反應的能力要高於常規方法，且兩者之間的差異具有統計學意義(P < O. 05)。
㈡GM-CSF -TAT - CEA重組蛋白最佳劑量
MC-38-cea2細胞株是由攜帶人源CEA的cDNA經逆轉錄病毒轉染小鼠結腸癌 MC-38細胞株構建而成的。
選取C57BL/6小鼠構建MC-38-cea2結腸癌動物模型，按照空白、生理鹽水、融合蛋白濃度為25ug/ml、50ug/ml、100ug/ml五組分別注射小鼠，每組10隻，每5天測量並計算腫瘤塊體積大小mm3= (a*b2) /2，a、b為腫瘤塊的大小中心軸的直徑。
由圖3數據顯示，GM-CSF-TAT-CEA重組蛋白可明顯抑制腫瘤的生長，抑制效果跟注射劑量相關，並且之間具有統計學意義(P < O. 05)。
利用酶聯免疫斑點法(ELISPOT)檢測按以上五組分別注射小鼠後使T細胞產生 IFN-gama的量。根據圖4顯示的數據表明，低劑量GM-CSF-TAT-CEA重組蛋白就可以誘導機體發生特異性免疫應答。
㈢細胞毒實驗
分別以MC-38_cea2和MC-38細胞作為靶細胞。分別取注射常規蛋白和GM-CSF -TAT - CEA重組蛋白7天後的C57BL/6小鼠脾細胞，經4%多聚甲醛孵育後以作為效應細胞。按照不同效靶比將細胞混合培養，每組做三個平行，5天後利用鉻釋放法檢測特異性細胞毒性。
圖5數據顯示，GM-CSF-TAT-CEA重組蛋白殺傷表達特異性CEA細胞的效果要高於常規法，兩者之間具有統計學意義，且不同效靶比之間的差異性也具有統計學意義(P < O. 05)。
圖6數據顯示表明，常規法和GM-CSF -TAT-CEA重組蛋白均可殺傷結腸癌MC-38細胞，兩者之間無明顯差異性，並且不同效靶比之間也無明顯差異。
權利要求
1.一種GM-CSF -TAT - CEA重組蛋白，其胺基酸序列如SEQ ID NO :1所示。
2.一種製備權利要求1所述重組蛋白的方法，其特徵在於該方法由以下步驟組成a.將GM-CSF、TAT和CEA通過酶切克隆到質粒pET_15b的克隆位點中構建重組質粒，b.重組質粒轉化大腸桿菌BL2細胞，進行重組蛋白的表達，c.重組蛋白轉化體的純化收集。
3.如權利要求2所述的製備重組蛋白的方法，其特徵在於在所述的步驟(a)所述的酶切為在GM-CSF的基因序列兩端添加酶切位點Nde I和Nco I，在TAT的基因序列兩端添加酶切位點Xho I和Nde I，以及在CEA的基因序列兩端添加酶切位點BamH I和Xho I。
4.如權利要求2所述的製備重組蛋白的方法，其特徵在於通過N1-NTA柱分離純化所述的重組蛋白。
5.一種權利要求1所述重組蛋白在製備腫瘤治療藥物中的應用。
6.一種權利要求1所述重組蛋白製備DC疫苗的方法，其特徵在於將所述重組蛋白刺激誘導健康C57BL/6小鼠經由骨髓製備的DC細胞，製得DC疫苗。
7.如權利要求6所述的重組蛋白製備DC疫苗的方法，其特徵在於所述的重組蛋白的濃度為 25 100ug/ml。
8.如權利要求7所述的重組蛋白製備DC疫苗的方法，其特徵在於所述的重組蛋白的濃度為 25 50ug/ml。
全文摘要
本發明涉及一種重組蛋白及其方法和應用，具體為一種GM-CSF-TAT-CEA重組蛋白及其方法和應用，其胺基酸序列表如SEQ ID NO1所示，製備時，將GM-CSF、TAT和CEA通過酶切克隆到質粒pET-15b的克隆位點中構建重組質粒，重組質粒轉化大腸桿菌BL2細胞，進行重組蛋白的表達，最後進行重組蛋白轉化體的純化收集，本發明的重組蛋白可應用於腫瘤治療藥物。本發明將腫瘤特異性抗原和轉導蛋白以及體外誘導DC細胞的關鍵試劑GM-CSF結合，製備出具有特異性且能延緩DC細胞壽命的融合蛋白，保證了DC細胞存活時間的延長以及特異性免疫應答的啟動；避免了常規DC細胞培養中GM-CSF的額外添加，解決了培養周期中GM-CSF不足的缺點，並且共表達GM-CSF還可促進細胞毒作用；為腫瘤臨床治療提供了新的依據。
文檔編號A61K39/00GK102993313SQ201210545700
公開日2013年3月27日 申請日期2012年12月14日 優先權日2012年12月14日
發明者葉永清, 張超, 蘇國新 申請人:上海柯萊遜生物技術有限公司