用於使抗體片段結晶的組合物和方法

2023-06-09 21:21:31 1

專利名稱：用於使抗體片段結晶的組合物和方法
技術領域：
本發明涉及用於使Fab抗體片段結晶的組合物和方法，及其用途。具體地，本發明 涉及使抗白細胞介素18(IL-18)抗體Fab片段結晶的方法。
背景技術：
目前在臨床研究2或3期中評估的單克隆抗體超過100種，單克隆抗體(mAb)市 場被視為最有希望的生物藥物市場之一。因為這些藥物不得不以經常超過IOOmg的單次劑 量遞送給患者，所以迫切需要發現滿足穩定性、安全性和患者順應性的合適製劑。高度濃縮的液體mAb製劑具有比較不濃縮的製劑更高的粘度，這可以妨礙其通過 更以患者為本(patient-friendly)的高規格針(high gaugeneedle)的可注射性。此外， mAb分子聚集的趨勢隨著濃度增加而指數增加，從而阻止對安全性和穩定性需求的順應性。 高mAb劑量的遞送因此局限於大體積，這一般不得不經由輸注遞送。然而，這種給藥方式是 成本密集型的並且顯著減少患者順應性。由於這個原因，需要晶形的mAbs用於用作藥品。然而，由於與結晶條件相關的不 可預知性，對於評價這種策略進行了很少嘗試。儘管蛋白質胰島素已成功結晶，但大多數其 他蛋白質趨於形成無序沉澱而不是晶體。測定關於具體蛋白質的結晶條件因此不是無價值 的工作。迄今為止，不存在允許人們可靠預測關於目的蛋白質的成功結晶條件的基本原則。幾種篩選系統是商購可得的(例如，Hampton 1和2，Wizard I和II)，其允許在微 升規模上篩選關於特定蛋白質的潛在合適的結晶條件。然而，使用此種篩選系統獲得的陽 性結果不一定在更大的工業可應用的分批規模上轉化為成功結晶(參見Jen等人O001) Pharm. Res. 18(11) :1483)。Baldock 等人((1996) J. Crystal Growth, 168(1-4) :170-174)報告了關於微批處 理(micrcAatch)和蒸汽擴散用於結晶條件的起始篩選的比較。6種商購可得的蛋白質使 用一組結晶溶液進行篩選。篩選使用常見的蒸汽擴散法和微批處理結晶法的3種變體來執 行。在鑑定的58種結晶條件中，43種(74%)由微批處理得到鑑定，而41種(71%)由蒸 汽擴散得到鑑定。26種條件通過2種方法都得到鑑定，並且如果根本未使用微批處理，那麼 17種( %)將已錯過。這些數據顯示在起始結晶篩選中最常用的蒸汽擴散技術不保證陽 性結果。因此，不同蛋白質的結晶無法使用限定方法或算法成功執行。當然，在過去 20-30年中已存在技術進步。例如，A. McPherson提供了關於用於使大分子結晶的戰術、 策略、試劑和設備的廣泛細節。然而，他沒有提供確保任何給定大分子都可以真正地通 過技術人員以合理成功預期結晶的方法。例如，McPherson陳述「無論什麼程序，在改 進且最佳化系統參數(溶劑和溶質兩者)方面必須不遺餘力，以支持且促進分子之間的 特定鍵合相互作用且在它們一形成就使其穩定。這個問題的後一方面一般依賴於待結 晶的具體蛋白質或核酸的特定化學和物理性質」。(McPherson (1999) CrystalIization of BioIogicalMacromolecules.Cold Spring Harbor, New York, Cold Spring HarborLaboratory I^ress，第159頁)。蛋白質結晶領域技術人員廣泛公認的是，不存在獲
5得新目的蛋白質、應用特定過程步驟、且因此獲得所需晶體的算法。由於分子的柔性，抗體特別難以結晶。然而，免疫球蛋白晶體的例子的確存在， 例如本斯-瓊斯(Bence Jones)蛋白質，其是異常Ig輕鏈二聚體的晶體(J0neS(1848) Philosophical Transactions of the RoyalSociety, London,138 :55-62)。 此夕卜，Ig 重鏈寡聚體(von Bonsdorf 等人(1938). Folia Haematologia 59 :184-208)和正常結 構的人免疫球蛋白0條重鏈與2條輕鏈連接)的晶體也已得到描述(Putnam(1955) Science 122 :275-7 ；Terry 等人(1968)Nature 220(164) :239-41 ；Huber 等人(1976) Nature 264(5585) :415-20 ；Rajan 等人(1983)Mol. Immuno 120 (7) :787-99 ；Harris 等人 (1992)Nature 360(6402) :369_72，Nisonoff 等人(1968) Cold Spring Harbor Symposia on Quant. Biol. 32 :89-93 ;Connell 等人(1973)Canad. J. Biochem. 51 (8) :1137-41 ；Mills 等人(1983) Annals of Int. Med 99(5) :601-4 ；和 Jentoft 等人(1982) Biochem. 21(2) 289-2940例如，Margolin和同事報告治療用單克隆抗體司徒曼布(Herceptin )可 以進行結晶(Shenoy，等人2002)，並且結晶司徒曼布懸浮液在小鼠腫瘤模型中在治療 上有效，因此證實通過結晶司徒曼布保留生物活性(Yang等人(2003)Proc. Natl. Acad. Scil00(12) :6934-6939)。然而，形成均質抗體晶體製劑的可預測和可靠方法仍未得到描 述。W0-A-02/072636公開了整個、完整的抗體利妥希瑪、英夫單抗和司徒曼布的結晶。 大多數結晶實驗用具有不明確毒性的化學製品來執行，所述化學製品例如咪唑、2-環己 基-乙磺酸酯(CHEQ、甲基戊二醇、硫酸銅和2-嗎啉基-乙磺酸酯(MEQ。在那個申請中 的許多例子使用晶種以起始結晶。W0-A-2004/009776公開了抗人TNF α抗體D2E7或一般地阿達木單抗 (Adalimumab )的晶體，目前在商品名稱HUMIRA 下出售。該申請公開了使用坐滴 (sitting drop)蒸汽擴散技術在微升規模上的結晶實驗，其涉及使等量微小體積(Iyl) 的不同結晶緩衝液和D2E7 F(ab)' 2或Fab片段混合。EP-A-O 260 610公開了一系列鼠類抗hTNF α單克隆抗體，即中和抗體ΑΜ-195，也 指定為ΜΑΚ195，如由雜交瘤細胞系產生的，作為ECACC 87050801保藏。該抗體的F(ab' )2 片段也在名稱阿非莫單抗TM(Afelim0mabTM)下已知。美國專利申請系列號60/963,964描述了用於製備批量鼠類抗TNFa抗體 F(ab' )2 片段(例如，MAK-195，Abbott Laboratories)的結晶條件。美國專利申請系列號11/977，677描述了關於人抗TNFa抗體(例如，Humira, Abbott Laboratories)的結晶條件。美國專利申請系列號60/920，608描述了關於人抗IL-12抗體(例如，ABT-874, Abbott Laboratories)的結晶條件。美國專利申請系列號09/780，035和10/988，360描述了與白細胞介素18結合的 抗體(ABT-325，Abbott Laboratories)，其在治療多種炎性疾病中有用。然而，目前，不存 在提供用於產生抗IL-18抗體或抗IL-ISFab片段晶體的可用技術教導。因此存在關於提 供抗IL-18抗體或抗IL-ISFab片段晶體的合適結晶條件的需要。發明概述令人驚訝地，上述問題通過本發明得以解決，本發明提供了結晶方法和由此產生
6的晶體、及其用途。在一個方面，本發明提供了製備抗體Fab片段的晶體的方法，該方法包括步驟(a) 獲得Fab片段；(b)使Fab片段與儲庫溶液(reservoirsolution)混合，以製備結晶混合物， 所述儲庫溶液包括(i)聚乙二醇(PEG)和(ii)緩衝液；和(c)將結晶混合物置於表面上 直至晶體形成。在一個實施方案中，PEG是在結晶混合物中約5至20%的濃度的PEG400、 PEG4000或PEG6000。在一個實施方案中，緩衝液是在約4至約11的pH下的HEPES、CAPS、 Tris、二甲胂酸鹽、MES、檸檬酸鹽、bis-tris、磷酸鹽、CHES, MOPS、咪唑、乙酸鹽、N- 二 [羥 乙基]甘氨酸或檸檬酸鹽。在一個實施方案中，HEPES緩衝液在約pH7. 5下。在另一個實施 方案中，CAPS緩衝液在約ρΗΙΟ. 5下。在另外一個實施方案中，Tris緩衝液在約pH8. 5下。在一個實施方案中，儲庫選自矽化處理的載玻片和坐滴盤。在一個實施方案中，該方法在約0°C至約25°C，例如約4°C或約18°C下執行。根據本發明的方法，將結晶混合物置於表面上約1至7天以形成晶體。在本發明的另一個實施方案中，儲庫溶液進一步包括約2至約40%，優選約5%濃 度的2，4-甲基戊二醇。在本發明的另一個實施方案中，儲庫溶液進一步包括約100至約500mM濃度的磺 基甜菜鹼201。在本發明的另一個實施方案中，儲庫溶液進一步包括約50至約500mM濃度，優選 約 200mM 的 MgCl2。本發明的方法在使Fab片段結晶中有用，例如人或非人Fab，例如小鼠Fab，例如與 人或非人IL-18結合的抗體的Fab片段。在一個實施方案中，IL-18是其中所有半胱氨酸 殘基都突變成丙氨酸殘基的突變IL-18。在另一個方面，本發明提供了例如與人或非人IL-18結合的Fab片段的分離的晶 體。在另一個方面，本發明提供了包括與人或非人IL-18結合的Fab片段的分離的共晶 (co-crystal)。Fab片段是人或非人的，例如抗體例如125-2H的小鼠Fab片段，或抗體例如 ABT-325的人Fab片段。在一個實施方案中，IL-18是其中所有半胱氨酸殘基都突變成丙氨 酸殘基的突變IL-18。在一個實施方案中，ABT_325Fab片段的分離的晶體包括輕鏈序列SEQ ID NO :1和 重鏈序列SEQ ID NO :2。在一個實施方案中，ABT-325Fab片段與選自SEQ ID NO 3和SEQ ID NO 4的IL-18胺基酸序列結合。在另一個實施方案中，ABT-325Fab片段與具有選自Asp59-Asp76(SEQ ID NO 7) 和Glul64-Leul69(SEQ ID NO 8)的胺基酸序列的至少一種IL-18肽，或其具有一種或多種 胺基酸取代的類似物結合，其中IL-18的類似物與抗體ABT-325結合。在另一個實施方案 中，本發明提供了包括單克隆抗體125-2H的Fab片段的分離的晶體，其中125-2H Fab片段 包括SEQ ID NO 9的輕鏈序列和SEQ ID NO 10的重鏈序列。在另一個實施方案中，125-2H Fab片段與具有選自Lys 176_Argl83 (SEQ ID NO: 5)和Argl40-Lysl48(SEQ ID NO :6)的胺基酸序列的至少一種IL-18肽，或其具有一種或 多種胺基酸取代的類似物結合，其中類似物與抗體125-2H結合。在另一個實施方案中，本 發明提供了用於產生包括與人IL-18結合的125-2H Fab片段的共晶的方法和組合物。在另一個方面，本發明提供了包括本發明的分離的晶體的藥物組合物。
附圖簡述本發明的前述和其他目的、特徵和優點以及本發明自身根據優選實施方案的下述 描述將得到更全面理解，所述優選實施方案連同附圖一起閱讀，其中

圖1.在IOX放大率下的ABT-325晶體。圖2.在IOX放大率下的125-2H晶體。圖3.在IOX放大率下的125-2H/IL-18共晶。圖4. IL-18嵌合體幫助限定結合表位。(a)人IL-18和4種人(N末端)/鼠類(C 末端)嵌合體。(b)鼠類IL-18和4種鼠類(N末端)/人(C末端)嵌合體。人序列顯示為 白框，鼠類序列是黑色的。對於每種嵌合體指出了殘基範圍、在胱天蛋白酶-ι切割後的第 一個成熟IL-18殘基(藍色三角)和附加表位。ND 未測試。發明詳述「使得抗體晶體能夠形成的條件」意指在不攪動條件下導致晶體形成的任何溶液 條件。這意指提供包含抗體分子和至少一種結晶試劑的溶液，所述結晶試劑的濃度足以在 給定條件例如混合物的PH和溫度下起始晶體形成。「微小規模結晶法」意指其中結晶混合物的體積在0. 1 μ L禾Π 10 μ L之間的任何結 晶法，尤其是使得蒸汽擴散在結晶過程中能夠開始生效的任何方法。例如，基於蒸汽擴散的 方法包括步驟加入微升範圍的小體積抗體溶液與包含結晶試劑的儲庫緩衝液，將混合物 的小滴置於與儲庫緩衝液的等分試樣鄰近的密閉容器中，允許小滴和儲庫之間通過蒸汽擴 散的溶劑交換，在這個過程中小滴中的溶劑含量改變，並且如果達到合適的結晶條件，那麼 可以觀察到結晶。「結晶試劑」是支持、增強或促進抗體的晶體形成的試劑。「結晶溶液」包含溶解形式的結晶試劑。優選地，結晶溶液是水系統，即其液體組成 成分佔優勢地由水組成。例如，80至IOOwt.-%、或95至100wt-%、或98至IOOwt.可 以是水。當用於通過蒸汽擴散技術的微小規模結晶時，術語「儲庫溶液」也指「結晶溶液」。「結晶混合物」包含抗體或其片段的水溶液和結晶溶液或儲庫溶液。「晶體」是物質例如蛋白質的一種固態形式，其不同於第二種固體形式，即非晶形 狀態，其基本上作為無定形的異質固體存在。晶體具有規則的三維結構，一般稱為晶格。抗 體晶體包括抗體分子的規則三維陣列。(參見Giege等人，Crystallization of Nucleic Acids and Proteins, a Practical Approach,第 2 版，第 1-16 頁，Oxford University Press, NewYork(1999))。「整個」或「完整」抗體是在體外和/或體內能夠識別其抗原且與其抗原結合的功 能抗體，所述抗原例如IL-18。抗體可以起始和抗體與其抗原結合相關的患者的後續免疫系 統反應，特別是直接細胞毒性、依賴補體的細胞毒性(CDC)和依賴抗體的細胞毒性(ADCC)。 抗體分子一般具有由彼此共價結合的2條等同重鏈(MW各約50kDa)和各自與重鏈之一共 價結合的2條等同輕鏈(MW各約25kDa)組成的結構。4條鏈以標準「Y」基序排列。每條 重鏈由重鏈可變區(本文縮寫為HCVR或VH)和重鏈恆定區組成。重鏈恆定區由3個結構 域——CHU CH2和CH3組成。每條輕鏈由輕鏈可變區(本文縮寫為LCVR或VL)和輕鏈恆 定區組成。輕鏈恆定區由1個結構域CL組成。VH和VL區可以進一步再分成稱為互補性，點綴著稱為構架區(FR)的更保守區域。每個VH和VL—般由3個 CDRs和4個FRs組成，從氨基末端到羧基末端以下述順序排列FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、 ⑶R3、FR4。完整抗體分子具有2個抗原結合部位，即是「二價的」。2個抗原結合部位對於 1種IL-18抗原特異，即抗體是「單特異性的」。上述結構在不同物種中可以改變。「單克隆抗體」是衍生自B淋巴細胞(B細胞)的單個克隆並且識別相同抗原決定 簇的抗體。整個單克隆抗體是具有上述標準分子結構的那些，其包括2條完整重鏈和2條 完整輕鏈。單克隆抗體這樣常規生產使抗體產生性B細胞與無限增殖骨髓瘤細胞融合，以 產生B細胞雜交瘤，其在細胞培養中持續產生單克隆抗體。其他生產方法是可用的，如例如 使用噬菌體展示技術、酵母展示技術或RNA展示技術在細菌、酵母、昆蟲、真核生物或哺乳 動物細胞培養中表達單克隆抗體；或在基因修飾動物例如牛、山羊、豬、兔、雞或轉基因小鼠 中體內產生，所述基因修飾動物或轉基因小鼠已進行修飾以包含且表達完整人B細胞基因 組；或在基因修飾植物例如菸草和玉米中產生。來自所有此種來源的抗體或片段可以根據 本發明進行結晶。待根據本發明結晶的單克隆抗體包括「嵌合」抗體，其中重和/或輕鏈的部分與衍 生自特定物種或屬於特定抗體類別或亞類的抗體中的相應序列等同或同源，而一條或多條 鏈的其餘部分與衍生自另一個物種或屬於另一個抗體類別或亞類的抗體中的相應序列等 同或同源。小鼠/人嵌合體的例子包含鼠類抗體的可變抗原結合部分和衍生自人抗體的恆 定部分。非人(例如鼠類)抗體的「人源化」形式也由本發明包括。這些是包含衍生自非 人免疫球蛋白的最低限度序列的嵌合抗體。對於大部分，人源化抗體是人免疫球蛋白，其中 來自人免疫球蛋白的互補性決定區(CDR)或高變環(HVL)的殘基由具有所需功能性的來自 非人物種(例如小鼠、大鼠、兔或非人靈長類動物)的CDR或HVL的殘基替換。人免疫球蛋 白的構架區(FR)殘基可以由相應非人殘基替換，以改善抗原結合親和力。此外，人源化抗 體可以包括在相應人或非人抗體部分中都未發現的殘基。這些修飾可能是必需的，以進一 步改善抗體功效。「人抗體」或「全人抗體」是具有這樣的胺基酸序列的抗體，所述胺基酸序列與由人 產生的抗體或重組產生的那種對應。如本文所使用的，術語「人抗體」意欲包括具有衍生自 人種系免疫球蛋白序列的可變和恆定區的抗體。本發明的人抗體可以包括不由人種系免疫 球蛋白序列編碼的胺基酸殘基(例如，在體外通過隨機或位點專一誘變或在體內通過體細 胞突變引入的突變)，例如，在CDRs且特別是CDR3中。然而，如本文所使用的，術語「人抗 體」不意欲包括其中衍生自另一個哺乳動物物種例如小鼠的種系的CDR序列已嫁接到人構 架序列上的抗體。如本文所使用的，術語「重組人抗體」意欲包括通過重組方法製備、表達、產生或 分離的所有人抗體，例如使用轉染到宿主細胞內的重組表達載體表達的抗體，從重組、組合 人抗體文庫中分離的抗體，從對於人免疫球蛋白基因是轉基因的動物(例如小鼠)中分離 的抗體(參見例如，Taylor等人(1992) Nucl. Acids Res. 20 :6觀7_6295)，或通過任何其他 方法製備、表達、產生或分離的抗體，所述任何其他方法涉及人免疫球蛋白基因序列與其他 DNA序列的剪接。此種重組人抗體具有衍生自人種系免疫球蛋白序列的可變和恆定區。然 而，在特定實施方案中，對此種重組人抗體實施體外誘變(或當使用對於人Ig序列轉基因
9的動物時，體內體細胞誘變)，並且因此重組抗體的VH和VL區的胺基酸序列是這樣的序列， 儘管其衍生自人種系VH和VL序列且與其相關，但可能在體內不天然存在於人抗體種系譜 (repertoire)內。如本文所使用的，「中和抗體」(或「中和IL-18活性的抗體」)意指其與IL-18的 結合導致IL-18生物活性的抑制的抗體。「親和力成熟的」抗體是在一個或多個高變區中具有一種或多種改變的抗體，這 導致與親本抗體相比較，抗體對於抗原的親和力中的改善。親和力成熟的抗體對於靶抗原 具有納摩爾或甚至皮摩爾的親和力值。親和力成熟的抗體通過本領域已知的程序產生。 Marks等人(1992)Bio/technology 10 :779-783描述了通過VH和VL結構域改組的親和 力成熟。CDR和/或構架殘基的隨機誘變在Barbas等人(1994)Proc. Nat. Acad. Sci USA 91 :3809-3813 ；Scier 等人(1995) Gene 169 :147-155 ；Yelton 等人(1995) J. Immunol. 155 1994-2004 Jackson 等人(1995) J. Immunol. 154(7) :3310-9 ；和 Hawkins 等人(1992) J. Mol Biol. 226 :889-896 中描述。如本文所使用的，「分離的抗體」意指基本上不含具有不同抗原特異性的其他抗 體的抗體(例如，特異性結合IL-18的分離的抗體基本上不含特異性結合除IL-18外的抗 原的抗體)。然而，特異性結合IL-18的分離的抗體可以與其他抗原例如來自其他物種的 IL-18分子具有交叉反應性。此外，分離的抗體可以基本上不含其他細胞材料和/或化學制
P
ΡΠ O如根據本發明結晶的特定「親本」抗體的「功能等價物」是這樣的，其顯示相同抗 原特異性，但在胺基酸水平或糖基化水平上與「親本」抗體的分子組成不同。然而，差異可 以僅僅是這樣的，從而使得結晶條件不偏離如本文所公開的參數範圍。抗體晶體的「被囊化(encapsulation) 」指其中晶體通過至少一層包衣材料個別包 被的製劑。在優選實施方案中，此種包被的晶體可以具有持續溶解速率。抗體晶體的「包埋」指其中可以是被囊化或未被囊化的晶體以分散方式摻入固體、 液體或半固體載體內的製劑。此種包埋的結晶抗體分子可以以受控的持續方式從載體中釋 放或溶解。「聚烷撐多元醇類型的結晶試劑」在下文更詳細地定義。如根據本發明使用的，「聚烷撐多元醇」是直鏈或支鏈特別是直鏈聚C2-C6烷撐多 元醇。聚醚由至少一種類型的多功能脂族醇形成，所述脂族醇攜帶2至6、2至4且特別是2 或3個優選地鄰位羥基，並且具有2至6，特別是2、3或4個碳原子，優選形成線性碳主鏈。 非限制性例子是1，2-乙二醇(乙二醇)、1，2-丙二醇、1，3-丙二醇、以及1，3-正丁二醇和 1，4_正丁二醇。特別優選的二醇是乙二醇。術語「聚烷撐多元醇」也包括其衍生物。非限制性例子是烷基酯和醚，特別是單烷 基醚和二烷基醚。「烷基」特別定義為直鏈或支鏈C1-C6烷基殘基，特別是甲基，乙基，正或異 丙基，正、異、仲或者(Oder)叔丁基，正或異戊基；和正己基。如根據本發明使用的，聚烷撐多元醇特別是聚烷撐二醇通過廣泛範圍的分子量進 一步表徵。分子量範圍陳述為數目或重量平均分子量，一般為約400至約10，000g/mol，如 例如約 1，000 至約 8，000g/mol、或約 2，000 至約 6，000g/mol、約 3，000 至約 6，000g/mol 或 約 3，200 至約 6，000g/mol，如例如約 3，350 至約 6，000g/mol、約 3，350 至約 5000g/mol、或約 3，800 至約 4，200g/mol，特別是約 4，000g/mol。特別優選的聚烷撐多元醇是聚乙二醇(PEGs)和聚丙二醇(PPGs)和相應無規或 嵌段共聚物。合適多元醇的具體例子是PEG 400, PEG2,000 ；PEG 3, 000 ；PEG 3, 350 ；PEG 4，000 ；PEG 5，000 ；和 PEG 6，000。結晶混合物中的聚烷撐多元醇濃度特別是PEG濃度是約5至約30% (w/v)，如例 如約7至約15% (w/v)、或約9至約16% (w/v)、或約9至約14% (w/v)、或約9至約12% (w/v)。優選地，具有約4，000的平均分子量的PEG以在結晶混合物中在一步過程中約9至 約12% (w/v)或在多步過程中約10至約16% (w/v)的濃度使用。本發明的聚烷撐多元醇可以由一種單一類型的多元醇或至少2種不同多元醇的 混合物組成，其可以是無規聚合的或可以作為嵌段共聚物存在。白細胞介素-18(IL_18)白細胞介素(IL)-IS是促炎細胞因子，其參與先天和獲得性免疫的調節(Okamura 等人(1995) Nature 378 :88 ；Nakanishi 等人 Q001)Annu. Rev. Immunol. 19 :423)。IL-18 單 獨或與IL-12協同作用，以擴大促炎和細胞毒性介質例如幹擾素(IFN)-Y的誘導。例如，在 IL-18敲除小鼠中，儘管存在IL-12，但IFN- γ和細胞毒性T細胞的水平減少。IL-18活性的 抑制在幾種自身免疫疾病動物模型中是有利的，例如膠原誘發的關節炎(Plater-Zyberk， 等人(2001) J Clin. Invest. 108 1825)和結腸炎(Siegmund 等人(2001)Am. J. Physiol. Regul. Integr· Comp. Physiol. 281 :R1264)。此外，IL-18 表達通過人自身免疫疾病中 現有的慢性炎症狀態急劇增加，所述人自身免疫疾病例如類風溼性關節炎(Yamamura 等人 QOODArthritis Rheum 44 :275)、多發性硬化(Losy 等人 Q001)Acta Neurol. Scand. 104 :171 ；Karni 等人 Q002) J. Neuroimmunol. 125 :134)和 Crohn 氏病(Ludwiczek 等人(2005)Eur. Cytokine Netw. 16 :27)。這些觀察暗示IL-18的阻斷可能是有用的人治 療方式(Bombardieri 等人 Q007)Expert Opin. Biol. Ther. 7 :31)。儘管與IL-I細胞因子家族的功能分歧，但IL-18與IL-I共享許多相似性。首 先，人IL-18作為生物學上無活性的M-kDa前體合成。如同IL-I β，IL-18在胱天蛋白 酶-1(和可能地其他蛋白酶)切割後被激活且分泌，所述切割產生成熟的18-kDa多肽。 儘管與IL-I β的低序列同源性(17%)，但IL-18的三維結構緊密類似IL-I β β-三葉 草摺疊，如由近期IL-18NMR結構測定顯示的(Kato等人(2003)Nat. Struct. Biol. 10 966)。IL-I和IL-18受體也是同源的JL-18與單獨的IL_18Ra鏈或異二聚的IL_18Ra / β受體複合物結合。IL-18以 20ηΜ的親和力與IL-ISRa結合，但發信號僅在高親和 力(0. 2nM) IL-18Ra /IL-18/IL-18Rβ 三元複合物形成後發生(Yoshimoto 等人(1998) J Immunol. 161 :3400 ；Azam 等人 Q003) J. Immunol. 171 :6574)。表面突變分析已鑑定了關於 IL-18與IL-18Ra結合的2個位點，這類似於在IL_1 β/IL-1R α 二元複合物中觀察到的那 些(Vigers等人(1997) Nature 386 190)，以及對於與IL-18R β結合重要的1個位點(Kato 等人(2003) Nat. Struct. Biol. 10 :966)。在近期研究中，有效的(0. 5nM) IL-18中和鼠類單克隆抗體(mAb) 125-2H抑制 IL-18與單獨的IL-ISRa結合，但不抑制與異二聚的IL-18R α / β受體複合物結合，儘管致 使與IL-18的三元複合物無功能(Wu等人(2003) J Immunol. 170 :5571)。關於125-2H的 罕見性質的結構基礎仍不明了 ；該作者提示IL-ISRa中的構象變化在IL-ISRa/β受體形
11成後發生，從而改變與125-2H的相互作用(Wu等人(2003) J Immunol. 170 :5571)。方法和組合物在一個方面，本發明提供了關於人和非人抗體Fab片段例如抗IL-ISFab片段的晶 體和結晶條件。在一個實施方案中，本發明提供了全人mAb，ABT-325的Fab片段的晶體， 所述ABT-325結合獨特的IL-18表位，如通過生物化學研究證實的，由雜交瘤細胞系產生。 ABT-325正進入臨床試驗用於多種自身免疫疾病適應症。在另一個實施方案中，本發明提供了包括由雜交瘤細胞系產生的小鼠抗IL-18抗 體125-2H Fab片段的晶體。在另一個實施方案中，本發明提供了包括與抗IL-18 125-2H Fab片段結合的人IL-18的晶體。在另一個方面，本發明提供了在使得Fab片段晶體能夠形成的條件下，通過提供 包括Fab片段和儲庫溶液的含水結晶混合物，用於製備抗體Fab片段晶體的方法，所述儲庫 溶液包括至少一種結晶試劑。通過將溶液形式或作為固體的結晶試劑加入包括Fab片段的 儲庫溶液或結晶溶液中，獲得結晶混合物。在一個實施方案中，Fab片段是IgG抗體例如IgGl、IgG2、IgG3或IgG4抗體的片 段。抗體片段可以是多克隆抗體Fab片段或單克隆抗體Fab片段，例如嵌合或非嵌合抗體、 人源化抗體、雙重特異性抗體、雙重可變結構域抗體、非糖基化抗體、人抗體、非人例如小鼠 抗體。在具體實施方案中，待結晶的抗體Fab片段是任選進一步加工以用於改善抗原結合 的非嵌合的人抗體Fab片段，或其片段。在另一個方面，本發明提供了用於使抗IL-ISFab片段結晶的結晶方法，其通過下 述實現提供包括在儲庫溶液中的Fab片段(例如，以溶解形式)的含水結晶混合物，所述 儲庫溶液包括至少一種聚烷撐或聚亞乙基多元醇例如聚烷撐或聚乙二醇作為結晶試劑；並 且使含水結晶混合物溫育直至形成Fab片段的晶體；其中聚烷撐或聚乙二醇(a)在一個 步驟中或(b)在超過一個步驟中提供，其中在步驟中形成的抗體晶體在下一個步驟前不取 出ο在本發明的ABT-325結晶法的一個實施方案中，含水結晶混合物的pH為約pH 8. 5 至約12. 0，特別是約9至約11. 5、或約9. 5至約11. 0、或約10. 0至約10. 5，例如約7. 5。在本發明的125-2H結晶法的一個實施方案中，含水結晶混合物的pH為約pH 5. 5 至約9，特別是約6至約8. 5、或約6. 5至約8、或約7. 0至約7. 5，例如約7. 5。在本發明的125-2H/IL-18複合物結晶法的一個實施方案中，含水結晶混合物的 pH為約pH 4. 0至約11、約pH 6. 5至約10. 5，特別是約7至約10、或約7. 5至約9. 5、或約 8至約8. 5，例如約8. 5。儲庫溶液和結晶溶液都可以是但不必須是緩衝的。原始儲庫溶液中的結晶試劑 濃度和緩衝劑體積摩爾濃度通常高於在結晶混合物中，因為當加入蛋白質溶液時它被稀 釋。在一個實施方案中，含水結晶混合物可以包含至少一種緩衝劑。緩衝劑可以例如包括 乙酸鹽和或檸檬酸鹽組分，或其鹼金屬鹽，如例如鈉或鉀鹽，特別地，乙酸鈉和/或檸檬酸 鈉。鹽通過加入酸特別是乙酸或檸檬酸而調整至所需pH。在一個實施方案中，緩衝劑例如 是 HEPES、MES、N-二 [羥乙基]甘氨酸、CAPS 或 Tris。在結晶法的一個實施方案中，含水結晶混合物中的緩衝劑濃度是約0至約0. 5M、 或約0. 05至約0. 400M,如例如約0. 075至約0. 300M、或約0. 200M。
12
在一個實施方案中，PEG在含水結晶混合物中具有約400至約20，000g/mol的平 均分子量。例如，PEG在結晶混合物中以約2至約50(w/v)總體積的終濃度存在，約5至約 40%、約10至約30%、約15至約20%，例如約5或約15%。在另一個實施方案中，滿足下述另外結晶條件中的至少一種(1)溫育執行約1小 時至約30天、或約1/2天至約20天或約1天至約10天，例如約1天至約5天、或約2天 至約3天；⑵溫育在約0°C和約+25°C之間，例如約4°C或約18°C下執行；和(3)結晶混 合物包括以下述濃度的Fab片段約0. 5至約200mg/ml、或約1至約150mg/ml或約2至約 100mg/ml，例如約3. 0至約50mg/ml，特別是約5. 0至約10mg/ml。蛋白質濃度可以根據用 於蛋白質測定的標準程序進行測定，例如通過測量在合適波長如例如^Onm下的光密度。在另一個實施方案中，本發明的方法包括使產生的晶體乾燥的步驟。合適的乾燥 法包括蒸發乾燥、噴霧乾燥、凍幹、真空乾燥、流化床乾燥、噴霧冷凍乾燥、近臨界乾燥、超臨 界乾燥和氮氣乾燥。在進一步的實施方案中，本發明的結晶法進一步包括例如通過離心、滲濾、超濾或 其他常用緩衝液更換技術，使結晶母液與不同液體或緩衝液、或其混合物交換的步驟，所述 不同液體或緩衝液例如包含至少一種聚烷撐多元醇的液體或緩衝液，所述聚烷撐多元醇不 同於用於結晶的那種，且具有約300至約8，000道爾頓的分子量。在優選實施方案中，這樣形成ABT_325Fab晶體通過溫育與2 μ L儲庫溶液混合 的在冰上解凍的2 μ L ( 20mg/mL)，所述儲庫溶液由25-30 %聚乙二醇(PEG) 400、1 OOmM CAPS, pH 10. 5組成，並且在4°C下在儲庫上懸浮。杆狀晶體在1天內出現。使用纖維環直 接從其母液中收穫ABT-325 Fab的晶體。隨後通過投入液氮內使晶體急驟冷卻並且貯藏於 液氮冰箱中。在另一個優選實施方案中，這樣形成125- Fab晶體通過溫育與2 μ L儲庫溶液 混合的在冰上解凍的2 μ L 125-2Η Fab原液( 13mg/mL)，所述儲庫溶液由10%聚乙二醇 (PEG) 6000UOOmM HEPES，pH 7. 5,5% 2,4-甲基戊二醇組成，並且在4°C下在儲庫(矽化處 理的玻璃蓋玻片)上懸浮。杆狀晶體在1天內出現。分別在母液+20%丙二醇或25%丙三 醇中收穫125-2H Fab的晶體。隨後通過投入液氮內使晶體急驟冷卻並且貯藏於液氮冰箱 中。在另一個優選實施方案中，這樣形成IL-18/125-2H Fab共晶通過溫育與1. 8μ L 儲庫溶液和0. 3 μ L 300mM磺基甜菜鹼201混合的在冰上解凍的1. 5 μ L IL-18/125-2H Fab 複合物原液( 20mg/mL)，所述儲庫溶液由 30% PEG 4000、IOOmM Tris, pH 8. 5,0. 2M MgCl2)組成。混合物在18°C下在儲庫(矽化處理的玻璃蓋玻片)上懸浮。杆狀晶體在1周 內出現。分別在母液+20%丙二醇或25%丙三醇中收穫IL-18/125-2H Fab複合物的晶體。 隨後通過投入液氮內使晶體急聚冷卻並且貯藏於液氮冰箱中。在另一個方面，本發明提供了例如抗IL-ISFab片段的晶體、和抗IL-18/IL-18復 合物的共晶，如通過本文限定的任何方法製備的。在一個實施方案中，晶體具有針的形狀。例如，本發明的晶體的特徵可以在於針狀 形態，具有約2至約500 μ m或約100至約300 μ m的最大長度(1)和約1至約100的長度 /直徑(1/d)比。此種針狀晶體的高度大致是直徑的尺寸。在另一個方面，本發明提供了包括下述的藥物組合物(a)根據本文限定的方法製備的抗體或抗體片段的晶體；和(b)穩定維持抗體晶體的至少一種藥學賦形劑；其中組 合物作為固體、半固體或液體製劑提供。在另一個實施方案中，本發明提供了包括下述的藥 物組合物(a)根據本文限定的方法製備的抗體的晶體；和(b)至少一種藥學賦形劑，其中 賦形劑包埋或包封晶體。在另一個實施方案中，抗體以超過約lmg/ml的濃度存在。在具體實施方案中，抗 體以超過約200mg/ml的濃度存在，例如約200至約600mg/ml、或約300至約500mg/ml。在 另一個實施方案中，藥物組合物是包括約0. 1至約9. 9% (w/w)抗體晶體的固體。在一個實施方案中，賦形劑包括至少一種聚合的生物可降解或非生物可降解的載 體和/或至少一種油或脂質載體，包括其組合、摻合物和共聚物。示例性聚合載體包括選自下述的至少一種聚合物聚(丙烯酸)、聚(氰基丙烯酸 酯)、聚(胺基酸)、聚(酐)、聚(酯肽)、聚(酯)、聚(乳酸)、乳酸-乙醇酸共聚物或PLGA、 聚(β-羥基丁酸酯)(poly(i3-hydrOXybutryate))、聚(己酸內酯)、聚(二氧雜環己酮)、 聚(乙二醇)、聚(羥丙基)甲基丙烯醯胺、聚(有機)磷腈、聚(原酸酯)、聚(乙烯醇)、 聚(乙烯吡咯烷酮)、馬來酐烷基乙烯基醚共聚物、普朗尼克多元醇(pluronic polyols)、 清蛋白、藻酸鹽、纖維素和纖維素衍生物、膠原、纖維蛋白、明膠、透明質酸、寡糖、糖胺聚糖 (glycaminoglycans)和硫酸化多糖。液體載體包括脂肪酸和脂肪酸的鹽，脂肪族醇，脂肪族胺，脂肪酸的甘油單酯、甘 油二酯和甘油三酯，磷脂，糖脂，固醇和蠟及相關類似物質。蠟進一步分成天然和合成產物。 天然材料包括得自植物、動物或礦物來源的蠟，例如蜂蠟、巴西棕櫚蠟或褐煤蠟。氯化萘和 烯屬聚合物是合成蠟產物的例子。油(或油狀液體)載體包括油(或油狀液體)，例如油質杏仁油、玉米油、棉子油、 油酸乙酯、肉豆蔻酸異丙酯、棕櫚酸異丙酯、礦物油、輕質礦物油、辛基十二醇、橄欖油、花生 油、桃仁油、芝麻油、大豆油、角鯊烷、液體甘油三酯、液體蠟和高級醇。在另一個方面，本發明提供了包括可通過本發明的方法獲得的抗體或抗體片段晶 體的可注射液體組合物，其中抗體或抗體片段以約10至約400mg/ml、或約50至約300mg/ ml，例如約200mg/ml的濃度存在。在另一個方面，本發明提供了包括可通過本發明的方法獲得的抗體或抗體片段晶 體的晶體漿組合物，其中抗體或抗體片段以超過約100mg/ml的濃度存在，例如約150至約 600mg/ml、或約 200 至約 400mg/ml。在另一個方面，本發明提供了用於治療哺乳動物的方法，其包括給哺乳動物施用 有效量的可通過本發明的方法獲得的抗體晶體或組合物的步驟。用於施用晶體及其組合物 的方法可以包括但不限於通過腸胃外途徑、通過經口途徑、通過吸入、通過注射或其組合施用。在具體實施方案中，本發明提供了治療受試者中的IL-18相關病症的方法，其包 括給受試者施用治療有效量的抗體晶體。在另一個方面，本發明提供了本發明的抗IL-18抗體晶體用於製備用於治療 IL-18相關疾病的藥物組合物的用途。本發明還提供了如上文定義的IL-18抗體片段晶體用於在醫學中使用。在本發明的優選實施方案中，抗體蛋白質溶液和結晶溶液以約1 1的比組合。
14因此，在原始結晶溶液中緩衝試劑/結晶試劑的體積摩爾濃度是結晶混合物中的那種的約 2倍。除非另有說明，否則本發明的結晶法可應用於任何抗體片段，例如Fab片段。抗體 可以是多克隆抗體，或優選地單克隆抗體。抗體可以是嵌合抗體、人源化抗體、人抗體、非人 抗體如例如小鼠抗體，各自以糖基化或非糖基化形式。抗體是例如雙重特異性抗體(dsAb) 或雙重可變結構域抗體(DVDAb)。除非另有說明，否則本發明的結晶法利用本領域眾所周知的技術設備、化學製品 和方法。然而，如上所述，本發明基於令人驚訝的發現特定結晶條件的選擇，特別是特定結 晶試劑的選擇，任選與特定PH條件和/或相應試劑(緩衝劑、抗體、結晶試劑)的濃度範圍 進一步組合，首次允許製備Fab片段的能再現的穩定晶體，這可以進一步加工以形成優良 的高度有利的藥物組合物的活性成分。用於執行結晶法的原材料通常包括待結晶抗體的濃縮溶液。蛋白質濃度可以例如 為約lmg/ml至約200mg/ml。溶液可以包含使溶解的抗體穩定的添加劑。在一個實施方案 中，預先去除添加劑是適當的。這可以通過執行本文描述的緩衝液更換步驟來達到。優選地，用於執行本發明的結晶法的原材料包含在水溶液中的抗體，具有調整至 約5.0至約12.0的pH。pH可以藉助於合適的緩衝液進行調整，所述緩衝液以約1至約 500mM，特別是約IOOmM終濃度存在。溶液可以包含基於溶液的總重量例如約0. 01至約15、 或約0. 1至約5、或約0. 1至約2wt.比例的添加劑，例如鹽、糖、糖醇和表面活性劑，以進 一步使溶液穩定。賦形劑應優選選自在藥物製備中常規應用的生理學上可接受的化合物。 作為非限制性例子，可以提及鹽例如NaCl ；表面活性劑例如聚山梨醇酯80 (Tween 80)和聚 山梨醇酯20(Tween 20)；糖例如蔗糖和海藻糖；冷凍保護劑例如乙二醇、甘油、丙二醇和蔗 糖；糖醇例如甘露糖醇和山梨糖醇；和緩衝試劑例如基於磷酸鹽的緩衝系統，例如如上定 義的磷酸氫鈉和鉀緩衝液、乙酸鹽緩衝液、磷酸鹽緩衝液、檸檬酸鹽緩衝液、HEPES緩衝液、 CAPS緩衝液、TRIS緩衝液、MES緩衝液、N- 二 [羥乙基]甘氨酸緩衝液、馬來酸鹽緩衝液或 琥珀酸鹽緩衝液、和組氨酸緩衝液；和胺基酸例如組氨酸、精氨酸和甘氨酸。緩衝液更換可以藉助於常規方法來執行，例如通過透析、滲濾或超濾。若需要，則將使溶液達到標準化結晶條件。特別地，溫度將調整至約4°C至約 37°C。若需要或有利，則溫度無需保持恆定，例如溫度可以改變，並且在結晶過程中可以應 用提供所需形狀的晶體的溫度概況。任選地以與抗體溶液相同的方式預先調節的，包含合適濃度的結晶試劑的結晶溶 液隨後加入抗體溶液中，以形成結晶混合物。根據進一步實施方案，本發明的結晶法也可以這樣執行，從而使得在步驟a)中獲 得的結晶混合物可以補充有合適量的預先存在的抗體晶體，如例如抗IL-18抗體結合片段 晶體，作為晶種以起始或加強結晶。結晶溶液的添加可以連續或不連續執行，任選在輕輕攪動下以促進2種液體的混 合。優選地，在其中蛋白質溶液在攪動下提供並且結晶溶液(或以其固體形式的試劑)以 受控方式加入的條件下執行添加。通過應用如上定義的聚烷撐多元醇，特別是聚烷撐二醇，且優選聚乙二醇(PEG)， 或如上定義的至少2種不同聚烷撐多元醇的混合物作為結晶試劑，起始抗體晶體的形成。結晶混合物包含這樣濃度的試劑，所述濃度足以提供聚烷撐多元醇在結晶混合物中約5至 約30% (w/v)的終濃度。也可以應用如上文已描述的聚烷撐多元醇的濃度梯度。優選地，結晶溶液另外包含酸性緩衝液，即不同於抗體溶液的那種，其濃度適合於 允許結晶混合物的PH調整為約4至約6。在已完成給結晶溶液添加結晶試劑後，混合物可以進一步溫育約1小時至約1年， 以獲得最高得率的抗體晶體。若合適，則混合物可以例如進行攪動、輕輕攪拌、滾動或以本 領域已知的方式移動。如果需要另外控制晶體大小，那麼基於在受控條件(如上文已解釋 的)下的攪動的大小控制結晶法可以補充到本發明的分批結晶法內。所獲得的晶體可以通過已知方法例如過濾或離心進行分離，如例如通過在約200 至約20，OOOrpm、優選約500至約2，OOOrpm下在約4°C的室溫下離心。剩餘母液可以棄去， 或例如通過添加另外的結晶試劑進一步加工。若需要，則分離的晶體可以進行洗滌且隨後乾燥，或母液可以用適合於其中懸浮 抗體的貯藏和最終使用的不同溶劑系統取代。根據本發明形成的抗體晶體在其形狀方面可以不同，如上文已描述的。對於治療 施用，晶體的大小將依賴於施用途徑而改變，例如對於皮下施用，晶體的大小可以大於用於 靜脈內施用。晶體的形狀可以通過將特定的另外添加劑加入結晶混合物中加以改變，如先 前已對於蛋白質晶體以及低分子量有機和無機分子晶體描述的。若需要，則可以驗證晶體事實上是抗體的晶體。抗體的晶體可以用顯微鏡術就雙 折射進行分析。一般而言，除非具有立方體內部對稱性，晶體將使偏振光的偏振面旋轉。在 另外一種方法中，晶體可以進行分離、洗滌、再溶解且通過SDS-PAGE進行分析，並且任選 地，用檢測抗體進行染色。任選地，再溶解的抗體也可以利用標準測定就與其抗原的結合進 行測試。根據本發明獲得的晶體也可以彼此交聯。此種交聯可以增強晶體的穩定性。用於 使晶體交聯的方法在例如美國專利號5，849，296中描述。晶體可以使用雙功能試劑例如戊 二醛進行交聯。一旦交聯，晶體就可以進行凍幹且貯藏，以用於例如在診斷或治療應用中使用。在一些情況下，可能希望使晶體乾燥。藉助於惰性氣體如氮氣、真空烘箱乾燥、凍 幹、蒸發、盤式乾燥、流化床乾燥、噴霧乾燥、真空乾燥或輥筒乾燥，可以使晶體乾燥。合適方 法是本領域眾所周知的。根據本發明形成的晶體可以維持在原始結晶混合物中，或它們可以進行洗滌且與 其他物質例如惰性載體或成分組合，以形成包括本發明晶體的組合物或製劑。此種組合物 或製劑可以例如用於治療和診斷應用中。在優選實施方案中，使合適載體或成分與本發明的晶體組合，從而使得製劑的晶 體由賦形劑包埋或包封。合適載體可以得自下述非限制性組聚(丙烯酸)，聚(氰基丙烯 酸酯)，聚(胺基酸)，聚(酐)，聚(酯肽)，聚(酯)，聚(乳酸)，乳酸-乙醇酸共聚物或 PLGA，聚(β-羥基丁酸酯)，聚(己酸內酯)，聚(二氧雜環己酮)，聚(乙二醇)，聚(羥 丙基)甲基丙烯醯胺，聚(有機)磷腈，聚(原酸酯)，聚(乙烯醇)，聚(乙烯吡咯烷酮)， 馬來酐烷基乙烯基醚共聚物，普朗尼克多元醇，清蛋白，藻酸鹽，纖維素和纖維素衍生物，膠 原，纖維蛋白，明膠，透明質酸，寡糖，糖胺聚糖，硫酸化多糖，其摻合物和共聚物，SAIB，脂肪
16酸和脂肪酸的鹽，脂肪族醇，脂肪族胺，脂肪酸的甘油單酯、甘油二酯和甘油三酯，磷脂，糖 脂，固醇和蠟及相關類似物質。蠟進一步分成天然或合成產物。天然材料包括得自植物、動 物或礦物來源的蠟，例如蜂蠟、巴西棕櫚蠟或褐煤蠟。氯化萘和烯屬聚合物是合成蠟產物的 例子。在另一個方面，本發明提供了包括與至少一種載體和/或賦形劑組合的抗體結晶 的組合物和製劑。製劑可以是固體、半固體或液體。本發明的製劑以適合於貯藏和/或使用的形式進行製備，其通過使具有所需純度 的抗體與生理學上可接受的添加劑以懸浮液的形式混合來實現，所述添加劑例如載體、賦 形劑和 / 或穩定劑(參見例如,Remington' s Pharmaceutical Sciences，第 16 版，Osol， Α.編輯(1980))，或是凍幹的或以另一種方式進行乾燥的。任選地，也可以摻入進一步的活 性成分例如不同抗體、生物分子、或化學或酶促合成的低分子量分子。可接受的添加劑是在所採用的劑量和濃度下對於接受者無毒的。它的非限制性例 子包括-酸化劑，例如乙酸、檸檬酸、延胡索酸、鹽酸、蘋果酸、硝酸、磷酸、稀磷酸、硫酸和 酒石酸；-氣溶膠推進劑，例如丁烷、二氯二氟甲烷、二氯四氟乙烷、異丁烷、丙烷和三氯氟 甲烷；-空氣排代，例如二氧化碳和氮；-醇變性劑，例如甲基異丁基酮和蔗糖蔗糖八乙酸酯；-鹼化劑，例如氨溶液、碳酸銨、二乙醇胺、二異丙醇胺、氫氧化鉀、碳酸氫鈉、硼酸 鈉、碳酸鈉、氫氧化鈉和三乙醇胺(trolamine)；-消泡劑，例如聚二甲基矽氧烷和西甲矽油(simethicone)；-抗微生物防腐劑，例如苯扎氯銨、苯扎氯銨溶液、氯化苄乙氧銨(benzelthonium chloride)、苯甲酸、苯甲醇、對羥基苯甲酸丁酯、西吡氯銨、三氯叔丁醇、氯甲酚、甲酚、脫氫 乙酸、對羥基苯甲酸乙酯、對羥基苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸甲酯鈉、苯酚、苯乙醇、乙酸苯 汞、硝酸苯汞、苯甲酸鉀、山梨酸鉀、對羥基苯甲酸丙酯、對羥基苯甲酸丙酯鈉、苯甲酸鈉、脫 氫乙酸鈉、丙酸鈉、山梨酸、硫柳汞和麝香草酚；-抗氧化劑，例如抗壞血酸、棕櫚酸抗壞血酸酯、丁基化羥基苯甲醚、丁化羥基甲 苯、次磷酸、一硫代甘油、掊酸丙酯、甲醛合次硫酸氫鈉、偏亞硫酸氫鈉、硫代硫酸鈉、二氧化 硫、生育酚和生育酚賦形劑；-緩衝試劑，例如乙酸、碳酸銨、磷酸銨、硼酸、檸檬酸、乳酸、磷酸、檸檬酸鉀、偏 磷酸鉀、一鹼價磷酸鉀、乙酸鈉、檸檬酸鈉、乳酸鈉溶液、磷酸氫二鈉、一鹼價磷酸鈉和組氨 酸；-螯合劑例如依地酸二鈉、乙二胺四乙酸和鹽、和依地酸；-包衣試劑，例如羧甲基纖維素鈉、乙酸纖維素、纖維素乙酸鄰苯二甲酸酯、乙基 纖維素、明膠、藥用釉料、羥丙基纖維素、羥丙基甲基纖維素、羥丙基甲基纖維素鄰苯二甲酸 酯、甲基丙烯酸共聚物、甲基纖維素、聚乙二醇、普外撲、紫膠、蔗糖、二氧化鈦、巴西棕櫚蠟、 微晶蠟、玉米醇溶蛋白、聚胺基酸、其他聚合物例如PLGA等和SAIB ；-著色劑，例如氧化鐵；
-絡合劑，例如乙二胺四乙酸和鹽(EDTA)、依地酸、2，5-二羥基苯甲酸乙醇醯胺 (ethanolamide)和羥喹啉硫酸鹽；-乾燥劑，例如氯化鈣、硫酸鈣和二氧化矽；-乳化劑和/或加溶劑，例如阿拉伯膠、膽固醇、二乙醇胺(添加劑)、單硬脂酸甘 油酯、羊毛脂醇、卵磷脂、甘油單酯和甘油二酯、單乙醇胺(添加劑)、油酸(添加劑)、油醇 (穩定劑)、泊洛沙姆、聚氧乙烯50硬脂酸酯、聚氧乙烯(p0ly0Xyl)35蓖麻(caster)油、聚 氧乙烯40氫化蓖麻油、聚氧乙烯10油醚、聚氧乙烯20十六烷基十八烷基醚、聚氧乙烯40 硬脂酸酯、聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯40、聚山梨醇酯60、聚山梨醇酯80、丙二醇二乙酸酯、 丙二醇單硬脂酸酯、十二烷基硫酸鈉、硬脂酸鈉、失水山梨糖醇單月桂酸酯、失水山梨糖醇 (soritan)單油酸酯、失水山梨糖醇單棕櫚酸酯、失水山梨糖醇單硬脂酸酯、硬脂酸、三乙醇 胺和乳化蠟；-助濾劑，例如粉狀纖維素和精製硅藻土；-食用香料和香料，例如茴香腦、苯甲醛、乙基香蘭素、薄荷醇、水楊酸甲酯、穀氨酸 一鈉、橙花油、薄荷、薄荷油、歐薄荷醑、玫瑰油、濃玫瑰水、麝香草酚、吐魯香脂酊、香子蘭、 香子蘭酊和香蘭素；-助流劑和/或防結塊劑，例如矽酸鈣、矽酸鎂、膠態二氧化矽和滑石；-溼潤劑，例如丙三醇、己二醇、丙二醇和山梨糖醇；-軟膏基質，例如羊毛脂、無水羊毛脂、親水軟膏、白軟膏、黃軟膏、聚乙二醇軟膏、 礦脂、親水礦脂、白礦脂、玫瑰水軟膏和角鯊烷；-增塑劑，例如蓖麻油、羊毛脂、礦物油、礦脂、苯甲基苯甲基(benyl)甲酸酯、三氯 叔丁醇、鄰苯二甲酸(pthalate) 二乙酯、山梨糖醇、二乙醯甘油單酯、鄰苯二甲酸二乙酯、
丙三醇、甘油、單和二乙醯甘油單酯、聚乙二醇、丙二醇、甘油三乙酸酯、檸檬酸三乙酯和乙-多肽，例如低分子量(小於約10個殘基)；-蛋白質，例如血清清蛋白、明膠和免疫球蛋白；-聚合物膜，例如乙酸纖維素膜；-溶劑，例如丙酮、醇、稀醇、戊烯水合物、苯甲酸苄酯、丁醇、四氯化碳、氯仿、玉米 油、棉子油、乙酸乙酯、丙三醇、己二醇、異丙醇、甲醇、二氯甲烷、甲基異丁基酮、礦物油、花 生油、聚乙二醇、碳酸異丙烯酯、丙二醇、芝麻油、注射用水、無菌注射用水、無菌衝洗用水、 淨化水、液體甘油三酯、液體蠟和高級醇；-吸著劑，例如粉狀纖維素、木炭、精製硅藻土、二氧化碳吸著劑、氫氧化鋇石灰和 鹼石灰；-硬化劑，例如氫化蓖麻油、十八醇十六醇混合物、十六醇、十六烷基酯蠟、硬脂、石 蠟、聚乙烯賦形劑、十八烷醇、乳化蠟、白蠟和黃蠟；-栓劑基質，例如可可脂、硬脂和聚乙二醇；-懸浮劑和/或增粘劑，例如阿拉伯膠、瓊脂、藻酸、單硬脂酸鋁、皂土、精製皂土、 稠液皂土、卡波姆934p、羧甲基纖維素鈣、羧甲基纖維素鈉、羧甲基纖維素鈉12、角叉菜聚 糖、微晶和羧甲基纖維素鈉纖維素、糊精、明膠、瓜耳膠、羥乙基纖維素、羥丙基纖維素、羥丙 基甲基纖維素、矽酸鋁鎂、甲基纖維素、果膠、聚環氧乙烷、聚乙烯醇、聚烯吡酮、藻酸丙二酯、二氧化矽、膠態二氧化矽、藻酸鈉和黃蓍膠、黃原膠；-甜味劑，例如阿斯巴甜、葡聚糖結合劑、葡萄糖、賦形劑葡萄糖、果糖、甘露糖醇、 糖精、糖精鈣、糖精鈉、山梨糖醇、山梨糖醇溶液、蔗糖、可壓縮糖、糖果店的糖和糖漿；-片劑粘合劑，例如阿拉伯膠、藻酸、羧甲基纖維素鈉、微晶纖維素、糊精、乙基纖維 素、明膠、液體葡萄糖、瓜耳膠、羥丙基甲基纖維素、甲基纖維素、聚環氧乙烷、聚烯吡酮、預 膠凝澱粉和糖漿；-片劑和/或膠囊稀釋劑，例如碳酸鈣、二代磷酸鈣、三代磷酸鈣、硫酸鈣、微晶纖 維素、粉狀纖維素、葡聚糖結合劑、糊精、葡萄糖賦形劑、果糖、高嶺土、乳糖、甘露糖醇、山梨 糖醇、澱粉、預膠凝澱粉、蔗糖、可壓縮糖和糖果店的糖；-片劑崩解劑，例如藻酸、微晶纖維素、交聯甲羧纖維素鈉、聚乙烯聚吡咯烷酮 (corspovidone)、波拉克林鉀(polacrilin potassium)、羥基乙酸澱粉鈉、澱粉和預膠凝澱 粉。-片劑和/或膠囊潤滑劑，例如硬脂酸鈣、山嵛酸甘油酯、硬脂酸鎂、輕質礦物油、 聚乙二醇、硬脂醯延胡索酸鈉、硬脂酸、精製硬脂酸、滑石、氫化植物油和硬脂酸鋅；-張力試劑，例如葡萄糖、丙三醇、甘露糖醇、氯化鉀、氯化鈉；-媒介物，例如調味和/或增甜芳香酏劑、複合苯甲醛酏、等醇酏、薄荷水、山梨糖 醇溶液、糖漿和吐魯香脂糖漿；-媒介物，例如油質杏仁油、玉米油、棉子油、油酸乙酯、肉豆蔻酸異丙酯、棕櫚酸 異丙酯、礦物油、輕質礦物油、肉豆蔻醇、辛基十二醇、橄欖油、花生油、桃仁油、芝麻油、大豆 油、角鯊烷；固體載體糖球；無菌制菌注射用水、制菌氯化鈉注射液、液體甘油三酯、液體蠟 和高級醇。-防水劑，例如環甲基矽酮、聚二甲基矽氧烷和西甲矽油；和-溼潤劑和/或加溶劑，例如苯扎氯銨、氯化苄乙氧銨、西吡氯銨、多庫酯鈉、壬基 酚聚氧乙烯(9)醚、壬基酚聚氧乙烯(10)醚、辛基酚聚氧乙烯(9)醚、泊洛沙姆、聚氧乙烯 35蓖麻油、聚氧乙烯40氫化蓖麻油、聚氧乙烯50硬脂酸酯、聚氧乙烯10油醚、聚氧乙烯20 十六烷基十八烷基醚、聚氧乙烯40硬脂酸酯、聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯40、聚山梨醇酯 60、聚山梨醇酯80、十二烷基硫酸鈉、失水山梨糖醇單月桂酸酯(monolaureate)、失水山梨 糖醇單油酸酯、失水山梨糖醇單棕櫚酸酯、失水山梨糖醇單硬脂酸酯和泰洛沙泊。晶體可以與聚合載體組合以提供穩定性和/或持續釋放。此種聚合物包括生物相 容和生物可降解的聚合物。聚合載體可以是單一聚合物類型或它可以由聚合物類型的混合 物組成。聚合載體的非限制性例子已在上文提供。優選成分或賦形劑的例子包括-胺基酸例如甘氨酸、精氨酸、天冬氨酸、穀氨酸、賴氨酸、天冬醯胺、穀氨醯胺、脯 氨酸和組氨酸的鹽；-單糖，例如葡萄糖、果糖、半乳糖、甘露糖、阿拉伯糖、木糖和核糖；-二糖，例如乳糖、海藻糖、麥芽糖和蔗糖；-多糖，例如麥芽糖糊精、葡聚糖、澱粉和糖原；-糖醇，例如甘露糖醇、木糖醇、拉克替醇(Iactitol)和山梨糖醇；
-葡糖醛酸和半乳糖醛酸；
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-環糊精，例如甲基環糊精、羥丙基-(3-環糊精)；-無機鹽，例如氯化鈉、氯化鉀、氯化鎂、鈉和鉀的磷酸鹽、硼酸碳酸銨和磷酸銨；-有機鹽，例如乙酸鹽、檸檬酸鹽、抗壞血酸鹽和乳酸鹽；-乳化劑或加溶劑，例如阿拉伯膠、二乙醇胺、單硬脂酸甘油酯、卵磷脂、單乙醇胺、 油酸、油醇、泊洛沙姆、聚山梨醇酯、十二烷基硫酸鈉、硬脂酸、失水山梨糖醇單月桂酸酯、失 水山梨糖醇單硬脂酸酯、及其他失水山梨糖醇衍生物、聚氧乙烯(polyoxyl)衍生物、蠟、聚 氧乙烯衍生物、失水山梨糖醇衍生物；和-增粘試劑，例如瓊脂、藻酸及其鹽、瓜耳膠、果膠、聚乙烯醇、聚環氧乙烷、纖維素 及其衍生物碳酸異丙烯酯、聚乙二醇、己二醇和泰洛沙泊。本文描述的製劑還包括有效量的結晶抗體。特別地，本發明的製劑可以包括「治療 有效量」或「預防有效量」的本發明的抗體晶體。「治療有效量」指在所需劑量和時間段有效 達到所需治療結果的量。抗體晶體的「治療有效量」可以根據下述因素而改變，所述因素例 如疾病狀態，個體的年齡、性別和重量，和抗體在個體中引發所需應答的能力。治療有效量 也是其中抗體的任何毒性或有害作用被治療有利效應超過的量。「預防有效量」指在所需劑 量和時間段有效達到所需預防結果的量。一般地，因為預防劑量在疾病前或在疾病的較早 階段時在受試者中使用，所以預防有效量將小於治療有效量。合適劑量可以使用標準方法容易地確定。抗體適當地一次或在一系列治療期間 施用於患者。依賴於上述因素，約1 μ g/kg至約50mg/kg，如例如約0. 1至約20mg/kg抗體 是用於施用於患者的初始候選劑量，無論例如是通過一次或多次分開施用還是通過連續輸 注。一般的每日或每周劑量可以為約ι μ g/kg至約20mg/kg或更多，依賴於狀況，重複治療 直至出現疾病症狀的所需抑制。然而，其他劑量方案也可以是有用的。在一些情況下，當再 溶解時，製劑包括至少約lg/L或更大的抗體濃度。在其他實施方案中，當再溶解時，抗體濃 度是至少約lg/L至約100g/L。抗體的晶體或包括此種晶體的製劑可以單獨或作為藥物製劑的部分進行施用。本 發明的晶體可以通過經口、腸胃外、肺、鼻、耳、肛門、皮、眼、靜脈內、肌內、動脈內、腹膜內、 黏膜、舌下、皮下、經皮、局部或顱內途徑施用，或例如施用到口腔內。施用技術的具體例子 包括肺吸入、損傷內應用、針注射、乾粉吸入、皮膚電穿孔、氣溶膠遞送和無針注射技術，包 括無針皮下施用。IL-18相關病症可以選自下述疾病列表表1:IL_18相關疾病
20
獲得性免疫缺陷病症候群_
獲得性免疫缺陷相關病_
獲得性惡性貧血_
急、'I"生冠月永鄉宗合徵(Acute coronary syndromes) 急性和慢性疼痛(不同形式的疼痛)
急性特發性多神經炎_
與器官移植相關的急性免疫性疾病 與器官移植相關的急性或慢性免疫性疾病 急性炎性脫髓鞘多發性神經根性神經病
急性缺血_
急性肝病_
急性風溼熱_
急性橫貫性脊髓炎_
Addison 氏病_
成人(急性)呼吸窘迫症候群_
成人Still氏病_
酒精性肝硬化_
酒精誘導的肝損傷_
變應性疾病_
變態反應_
禿頂_
斑殼_
阿爾茨海默氏病_
過敏反應_
強直性脊柱炎_
強直性脊柱炎相關的肺病_
抗磷脂抗體症候群_
再生障礙性貧血_
動脈硬化_
關節病
2權利要求
1.一種製備抗體Fab片段的晶體的方法，所述方法包括步驟(a)獲得Fab片段；(b)使所述Fab片段與包括聚乙二醇和緩衝液的儲庫溶液混合，以製備結晶混合物；和(c)將所述結晶混合物置於表面上直至晶體形成。
2.權利要求1的方法，其中所述聚乙二醇選自聚乙二醇6000、聚乙二醇400和聚乙二 醇4000、聚乙二醇8000、聚乙二醇MME 5000和聚乙二醇20，000)。
3.權利要求1的方法，其中所述聚乙二醇為約5至約40%的濃度。
4.權利要求1的方法，其中所述緩衝液選自HEPES、CAPS、Tris、二甲胂酸鹽、MES、檸檬 酸鹽、bis-tris、磷酸鹽、CHES、M0PS、咪唑、乙酸鹽、N-二 [羥乙基]甘氨酸和檸檬酸鹽。
5.權利要求1的方法，其中所述緩衝液在約pH6. 5至約pH 11. 0下。
6.權利要求4的方法，其中所述HEPES緩衝液在約pH7.5下。
7.權利要求4的方法，其中所述CAPS緩衝液在約ρΗΙΟ.5下。
8.權利要求4的方法，其中所述Tris緩衝液在約pH8.5下。
9.權利要求1的方法，其中所述儲庫選自矽化處理的載玻片和坐滴孔。
10.權利要求1的方法，其中所述方法在約0°C至約25°C下執行。
11.權利要求1的方法，其中所述方法在約4°C下執行。
12.權利要求1的方法，其中所述方法在約18°C下執行。
13.權利要求1的方法，其中將結晶混合物置於表面上約1至7天以形成晶體。
14.權利要求1的方法，其中所述儲庫溶液進一步包括2，4-甲基戊二醇。
15.權利要求13的方法，其中所述2，4-甲基戊二醇為約2至約10%的濃度。
16.權利要求1的方法，其中所述Fab片段與IL-18結合。
17.權利要求1的方法，其進一步包括約50至約500mM濃度的MgCl2。
18.權利要求1的方法，其進一步包括約100至約500mM濃度的磺基甜菜鹼201。
19.權利要求1的方法，其中所述Fab片段是人Fab片段。
20.權利要求1的方法，其中所述Fab片段是非人Fab片段。
21.權利要求1的方法，其中所述Fab片段是小鼠Fab片段。
22.權利要求1的方法，其中所述Fab片段結合非人IL-18。
23.權利要求1的方法，其中所述Fab片段結合人IL-18。
24.權利要求1的方法，其中所述IL-18是其中所有半胱氨酸殘基都突變成丙氨酸的突 變 IL-18。
25.權利要求1的方法，其中所述Fab片段包括輕鏈序列SEQIDNO 1和重鏈序列SEQ ID NO :2。
26.權利要求1的方法，其中所述Fab片段結合包括SEQID No :9的胺基酸序列的蛋 白質。
27.權利要求1的方法，其中所述Fab片段包括輕鏈序列SEQIDNO 3和重鏈序列SEQ ID NO :4。
28.權利要求1的方法，其中所述Fab片段結合包括SEQID No 10的胺基酸序列的蛋 白質。
29.一種分離的晶體，其包括與IL-18結合的Fab片段。
30.權利要求四的分離的晶體，其中所述Fab片段是人Fab片段。
31.權利要求四的分離的晶體，其中所述Fab片段是非人Fab片段。
32.權利要求四的分離的晶體，其中所述Fab片段是小鼠Fab片段。
33.權利要求四的分離的晶體，其中所述IL-18是人IL-18。
34.權利要求四的分離的晶體，其中所述IL-18是非人IL-18。
35.權利要求四的分離的晶體，其中所述Fab片段包括輕鏈序列SEQID N0:1和重鏈 序列 SEQ ID NO :2。
36.權利要求四的分離的晶體，其中所述Fab片段結合包括SEQIDNo :9的胺基酸序 列的蛋白質。
37.權利要求四的分離的晶體，其中所述Fab片段包括輕鏈序列SEQID N0:3和重鏈 序列 SEQ ID NO :4。
38.權利要求四的分離的晶體，其中所述Fab片段結合包括SEQIDNo 10的胺基酸序 列的蛋白質。
39.一種分離的共晶，其包括與IL-18結合的Fab片段。
40.權利要求39的分離的共晶，其中所述Fab片段是人Fab片段。
41.權利要求39的分離的共晶，其中所述Fab片段是非人Fab片段。
42.權利要求41的分離的共晶，其中所述Fab片段是小鼠Fab片段。
43.權利要求39的分離的共晶，其中所述IL-18是人IL-18。
44.權利要求39的分離的共晶，其中所述IL-18是非人IL-18。
45.權利要求39的分離的共晶，其中所述Fab片段是單克隆抗體125-2H的Fab片段。
46.權利要求39的分離的晶體，其中所述Fab片段包括輕鏈序列SEQID N0:3和重鏈 序列 SEQ ID NO :4。
47.權利要求39的分離的晶體，其中所述Fab片段結合包括SEQIDNo 10的胺基酸序 列的蛋白質。
48.一種分離的晶體，其包括單克隆抗體ABT-325的Fab片段。
49.權利要求48的分離的晶體，其中所述ABT-325Fab片段包括輕鏈序列SEQID NO: 1和重鏈序歹Ij SEQ ID NO :2ο
50.權利要求四或48的分離的晶體，其中所述Fab片段與具有選自Asp59-Asp76(SEQ ID NO 7)和Glul64-Leul69(SEQ ID NO 8)的胺基酸序列的至少一種IL-18肽，或其具有 一種或多種胺基酸取代的類似物結合，其中所述類似物與抗體ABT-325結合。
51.一種分離的晶體，其包括單克隆抗體125-2H的Fab片段。
52.權利要求52的分離的晶體，其中所述125-2HFab片段包括輕鏈序列SEQ ID NO 3和重鏈序歹Ij SEQ ID NO :4。
53.權利要求52的分離的晶體，其中所述Fab片段與具有選自Lysl76-Argl83(SEQID NO 5)和Argl40-Lysl48(SEQ ID NO 6)的胺基酸序列的至少一種IL-18肽，或其具有一種 或多種胺基酸取代的類似物結合，其中所述類似物與抗體125-2H結合。
54.一種藥物組合物，其包括權利要求四或48的分離的晶體。
55.一種用於治療受試者的疾病或病症的方法，其通過給所述受試者施用權利要求56 的晶體，從而使得達到治療。
56.權利要求58的方法，其中所述疾病選自表1中列出的疾病。
全文摘要
本發明提供了用於使抗體及其片段結晶的方法，以及由此產生的晶體。更具體而言，本發明提供了使抗體的人和非人Fab片段結晶的方法，單獨或作為與其靶配體的共晶。例如，提供了包括抗體125-2H的鼠類Fab片段或抗體ABT-325的人Fab片段的晶體，以及與IL-18結合的鼠類Fab片段的共晶，所述抗體125-2H和ABT-325與IL-18結合。ABT-325和125-2H在組合位點特徵和構造方面顯著不同，從而解釋了其在不同表位處同時結合IL-18的能力。
文檔編號A61K39/395GK102065892SQ200980111073
公開日2011年5月18日 申請日期2009年1月29日 優先權日2008年1月30日
發明者C·吳, D·W·博爾哈尼, M·A·阿吉裡亞迪, T·加於爾, T·向 申請人:雅培製藥有限公司