一種適用於從人尿中大規模富集白蛋白的方法

2023-06-09 17:32:11 2

專利名稱：一種適用於從人尿中大規模富集白蛋白的方法
技術領域：
本發明涉及從人尿液中富集人血白蛋白的方法。
背景技術：
人血白蛋白(Human serum albumin, HSA)正常存在於人血漿中，具有十分重要的生理功能。從人血漿提取的人血白蛋白對於搶救治療休克、燒傷、創傷是不可替代的藥物， 在戰傷、工傷事故以及外科手術等場所被大量應用；在臨床上人血白蛋白還被用於慢性腎 炎、肝炎、肝硬化和晚期惡性腫瘤、營養不良水腫症、低白蛋白血症等病症的治療；人血白蛋 白還用作賦形劑和穩定劑、生產疫苗的免疫佐劑、無血清細胞培養基的組分等；也被用作藥 物載體，賦予藥物更好的理化特性。白蛋白也是常用而又昂貴的生物試劑，在大量生物活性 檢測實驗中，緩衝液常加入白蛋白，用以穩定活性蛋白質。在人血白蛋白應用範圍的不斷擴大的背景下，製備人血白蛋白的血源日趨緊張， 血漿缺口越來越大。擴展人血白蛋白的來源成為醫藥界普遍關注並努力解決的問題。目 前，人血白蛋白的基因工程取得了較大的進展，已在大腸桿菌、枯草桿菌、酵母、植物和轉基 因動物等系統中進行了重組白蛋白的表達，Delta的重組白蛋白(Recombumin )已經上市， 用作疫苗、生物技術藥物等蛋白藥物的賦形劑，但還遠不能滿足市場需要。研究證明，人尿液中的白蛋白與人血白蛋白的分子結構和生物學性質相同，是同 一物質(Poortmars, J. etal.，Biochemica et Biophysica Acta，43 (1966)，380—389)。盡 管尿液中白蛋白濃度很低，只有約10_20mg/L，但巨量的尿液來源，使其中的白蛋白含量也 成為一個巨量。醫藥界從人尿液中提取蛋白質的做法由來已久，最有代表性的尿蛋白產品是尿 激酶。提取尿激酶等尿蛋白的傳統方法是，在男性成人排尿處設置容器收集尿液，運輸到 加工點或生物化學製藥機構集中進行後續處理。因為人尿中白蛋白濃度很低，僅及血漿 的1/2000-4000，即便在人口密度較高的城市的公共廁所收集尿液，其收集與運輸成本也很 高，而且在收集、運輸過程中很難避免尿液拋灑，對城市衛生造成損害。

發明內容
本發明要解決的技術問題是，提供一種從人尿液中富集、純化白蛋白的方法，該方 法適合大面積、大規模使用，收集與處理成本較低，符合城市衛生化要求，能得到質量達到 藥典要求的高純度白蛋白製品。本發明目的是按以下技術方案實現的採用陰離子交換劑製作過濾裝置，稱尿液過濾裝置，將其置放於尿鬥或小便池內， 用以承接尿液從過濾裝置流過。尿液過濾裝置的形狀、大小與尿鬥或小便池相適應，保證如 廁人所排尿液全部或大部流經過濾裝置。定時回收尿液過濾裝置，對其中的陰離子交換劑 作集中解吸、過濾處理，收集白蛋白，並對陰離子交換劑作再生處理備作再用。離子交換劑亦稱離子吸附劑。可以使用任何一種陰離子交換劑充填於尿液過濾裝置，包括各種樹脂和凝膠為載體的陰離子交換劑，交換基團包括伯胺、仲胺、叔胺、季胺基的 陰離子基團。其中優選大孔型陰離子樹脂，再優選配基為季胺基-N+(CH3)3的強鹼性陰離子 交換樹脂。在將陰離子交換劑充填於尿液過濾裝置之前應先對其進行再生處理用鹼再生， 水衝至中性。尿液過濾裝置的一種結構形式是，以通透性良好的濾布包裹陰離子交換劑製作尿 液過濾墊，置放於尿鬥或小便池內，用以承接尿液從過濾墊流過。尿液過濾墊的形狀、大小 與尿鬥或小便池相適應。尿液過濾裝置的另種結構形式是管柱形尿液過濾裝置。它以硬質材料製作管筒， 管腔內充填陰離子交換劑，管筒的上下口以濾布或濾膜封閉，或是製作為網狀結構；管壁可 以是緻密的，也可以是液體通透結構。如此管柱形尿液過濾裝置置放於尿鬥內，或安裝在小 便池尿液出口處，用以承接尿液從管柱內流過。管柱形尿液過濾裝置的形狀、大小與尿鬥或小便池出口相適應。用以製作尿液過濾裝置的濾布應通透性良好，保證尿液快速透過，同時又不使離 子交換劑從袋中漏出。適宜的濾布為篩號300目以下，50目以上孔徑的濾布，優選篩號50 目-100目孔徑的濾布。尿液過濾裝置所承接的尿液可以是男性所排出的尿液原液，也可以是被水稀釋後 的尿液。尿液過濾裝置每次在尿鬥或小便池中留置並作置換的時間周期，根據尿液過濾墊 中陰離子交換劑裝料的多少、所承接的尿液流過量多少以及環境溫度等因素酌情而定，一 般在城市公共廁所放置8-48小時回收是適宜的。其中，以一晝夜為優選周期時間。按本發明方法，尿液原液或被水稀釋的尿液流過作為陰離子交換劑的樹脂，白蛋 白被吸附在樹脂上，實現尿液中白蛋白的富集。尿液過濾裝置經過對吸附劑作再生處理後 可以多次反覆使用。就運輸和後加工而言，相當於將尿液濃縮了 100倍，大大降低了收集和 處理成本，提高了工作效率，而且不產生對環境的不利影響。發明人分別使用多種陰離子交換劑對不同稀釋度尿液進行白蛋白吸附實驗，表 明，本發明方法對尿液原液和稀釋倍數低於20倍的尿液都可以得到良好的尿液白蛋白吸 附，吸附率可達到70%以上。每公斤樹脂吸附的人尿白蛋白通過解吸、硫酸銨沉澱等步驟所 能製備的白蛋白粗製品約1.5克，白蛋白含量大於60%。經過後續的層析純化與病毒滅活 過程，可得到約0. 6克純度達到96%以上的白蛋白，各種指標均可達到中國藥典要求，可在 多種領域作為人血漿來源白蛋白的替代品應用。雖然尿液白蛋白濃度僅及血漿的1/2000-4000，約10_20mg/L，但尿液來源較血漿 廣泛得多。如果每天收集1000噸尿液，其中的白蛋白含量約10-15公斤。按40%收率計 算，可年產2噸白蛋白製品，為替代人血漿來源白蛋白展示了良好前景。
具體實施例方式以下通過實施例對本發明作進一步說明。實施例1製作尿液過濾墊尿液過濾墊由起包裹作用的布袋和布袋內填充的陰離子交換樹脂構成。其製作 方法為，取通透性良好，又能牢靠包裹吸附劑顆粒的濾布縫製布袋。濾布適宜的篩號為300目以下，50目以上孔徑，優選篩號50目-100目孔徑。過濾墊的形狀和大小與尿鬥或便池的底部相適應，可以為方形、圓形、多邊形等形狀；用於尿鬥使用的過濾墊其邊長或直徑在10-40cm為宜；用於小便池使用的過濾墊又可以分為兩種類型一是平鋪於小便池的底部，其大小應能全面覆蓋小便池底；另種類型是裝置於小便池尿液流出口處，能填塞並覆蓋尿液流出口，使尿液在流出小便池前流經過濾墊。 取大孔型陰離子交換樹脂，例如配基為〔-N+ (CH3) 3〕的丙烯酸樹脂、配基為-N(CH3) 30H的苯乙烯-二乙烯苯共聚體等，經過2% NaOH處理，水衝至中性，裝入濾布袋中，製成尿液過濾墊。過濾墊中陰離子交換樹脂的裝料量根據安置過濾墊處一置換周期內尿液流量多少決定。該處單位時間尿液流量由測量或估算獲得。優選的陰離子交換樹脂裝量為每24小時尿液流量100L-200L使用1公斤樹脂。實施例2製作管柱形尿液過濾裝置選用壁厚1mm左右的塑料管，以白色為優；管的截面為圓形、矩形或多邊形；管的周徑與尿鬥或小便池出口相適應；管壁的高度根據置放場所選擇放置在尿鬥的過濾管柱優選圓柱型，高度宜2-lOcm;安裝在小便池出水口處的過濾管柱，其具體尺寸根據出水口的形狀、大小和深度確定，管壁高度宜3cm 30cm。尿液過濾管柱上下口以濾布或濾膜封閉，濾布篩號優選50目；管腔內充填陰離子交換樹脂。陰離子交換樹脂的用料和預處理同實施例1。實施例3測試尿液過濾墊富集白蛋白效果使用按實施例1方法製作的尿液過濾墊，過濾墊大小為20CmX30Cm，製作過濾墊的濾布孔徑為50目；陰離子交換樹脂使用配基為〔-N+(CH3)3)的大孔型陰離子交換樹脂丙烯酸樹脂2公斤，經過2% NaOH處理，水衝至中性，裝入濾布袋中，製成尿液過濾墊，放置在尿鬥中。以傾倒方式，將備好的男性尿液原液200L，以大體均勻的流速，在30分鐘倒入尿鬥中，尿液流經尿液過濾墊。之後，從過濾墊取出樹脂，用自來水衝洗後，裝入層析柱，再用含IMNaCl的醋酸緩衝液(50mM，pH4. 5)進行解吸；收集洗脫峰5200ml，測定尿液、殘尿、解吸液的白蛋白含量和總蛋白量，白蛋白測定應用Raybio尿微量白蛋白測定試劑盒進行，總 蛋白含量應用Lowry法測定。結果尿液中白蛋白含量為13mg/L，殘尿中約2mg/L，洗脫溶液中白蛋白380mg/L，得到1.97克白蛋白，收率約76%。實施例4以孔徑為80目的濾布縫製30cmX 30cm大小濾袋，取用配基為-N(CH3) 30H的大孔型陰離子交換樹脂苯乙烯-二乙烯苯共聚體2公斤，經過2% NaOH處理，水衝至中性，裝入濾布袋中，製成尿液過濾墊。將尿液過濾墊放置尿鬥中，24小時後置換過濾墊，收集樹脂，按照實施例3所述方法解吸。洗脫溶液中含白蛋白0. 91克，收率約35 %。實施例5以孔徑為150目的濾布縫製30CmX30Cm大小濾袋，取用同時具有伯胺、仲胺、叔胺、季胺配基的弱鹼性環氧樹脂2公斤，經過2% NaOH處理，水衝至中性，裝入濾布袋中，製成尿液過濾墊。
將尿液過濾墊放置尿鬥中，24小時後置換過濾墊，收集樹脂，按照實施例3所述方法解吸。洗脫溶液中含白蛋白0.61克，收率約24%。實施例6取用大孔型陰離子交換樹脂丙烯酸樹脂2公斤，其配基為-N+ (CH3) 3，經過2% NaOH 處理，水衝至中性，裝入孔徑為100目，直徑20cm的圓形濾布袋中，製成過濾墊，置放於衛生 間的尿鬥中，24小時後收集樹脂，按照實施例3所述方法解吸，洗脫溶液中含白蛋白1.62 克，收率約63%。實施例7尿液收集處為大型廁所的三個小便池。據測算，每個小便池一晝夜尿液流量約 1500L。選取孔徑為60目的濾布縫製大小為30cmX30cm的濾布袋15個；取配基為 〔-N+(CH3) 3〕的大孔型陰離子交換樹脂丙烯酸樹脂30公斤，經過2% NaOH處理，水衝至中性， 分別裝入濾布袋中，每個濾布袋裝填2kg，製成15個尿液過濾墊。按照相當於「每24小時 流過約150L尿液/1公斤樹脂」比例，每個小便池置放5個尿液過濾墊，特別覆蓋小便池出 水口附近。24小時後收集樹脂，用水衝洗，再用含IMNaCl的醋酸緩衝液(50mM，pH4. 5)進行 解吸，將洗脫液(解吸)超濾濃縮60倍，加硫酸銨粉末至飽和，靜置2小時，加硅藻土過濾 收集沉澱，得到白蛋白粗製品200克，其中白蛋白含量為29克，總蛋白含量為40克。其中， 白蛋白測定利用尿微量白蛋白測定試劑盒進行，總蛋白含量利用凱氏定氮法測定。實施例8對按實施例4-7方法製取的白蛋白粗製品後續純化步驟將白蛋白粗製品溶解，過濾，經過Phenyl疏水層析
,收集上樣和衝洗峰，超濾 後用SP-S印harose FF吸附[50mM醋酸緩衝(pH3. 8)]，再用0. 5MNaCl溶液(50mM醋酸緩 衝，pH 5.0)，進行洗脫，收集蛋白峰，60°C加熱10小時處理，DEAE陰離子層析(平衡液 50mMPBS，pH 6. 0)，低鹽衝洗後收集洗脫峰，洗脫液為平衡液加0. 5MNaCl。超濾濃縮，過 0. 22 μ m的濾膜除菌，冷凍乾燥，得到15克白蛋白凍乾粉。對該凍乾粉分析=SDS-PAGE為單一條帶，等電聚焦測定其等電點約4. 8，兩項均與人血白蛋白對照品一致。其它指標符合中國藥典指標。
權利要求
一種從人尿中富集白蛋白的方法，特別適合於大規模使用，其特徵在於，採用陰離子交換劑製作尿液過濾裝置，將其置放於尿鬥或小便池內，用以承接尿液從過濾裝置流過；尿液過濾裝置的形狀、大小與尿鬥或小便池相適應；定時回收尿液過濾裝置，對其中的陰離子交換劑作集中解吸，收集含白蛋白的組份，並對陰離子交換劑作再生處理備作再用。
2.根據權利要求1所述的富集白蛋白的方法，其特徵在於，尿液過濾裝置內所充填的 陰離子交換劑為以樹脂或凝膠為載體的任何一種陰離子交換劑。
3.根據權利要求2所述的富集白蛋白的方法，其特徵在於，所述陰離子交換劑的交換 基團為伯胺基、仲胺基、叔胺基、季胺基中任何一種陰離子基團。
4.根據權利要求3所述的富集白蛋白的方法，其特徵在於，所述陰離子交換劑的配基 為季胺基-N+(CH3)3基團。
5.根據權利要求2所述的富集白蛋白的方法，其特徵在於，所述陰離子交換樹脂為大 孔型樹脂。
6.根據權利要求1 5任一權利要求所述的富集白蛋白的方法，其特徵在於，尿液過濾 裝置是以通透性良好的濾布包裹陰離子交換劑製作尿液過濾墊，置放於尿鬥或小便池內， 尿液過濾墊的形狀、大小與尿鬥或小便池相適應。
7.根據權利要求1 5任一權利要求所述的富集白蛋白的方法，其特徵在於，尿液過濾 裝置為管柱形，是以硬質材料製作管筒，管壁是緻密的或是液體通透的，管腔內充填陰離子 交換劑，管筒的上下口以濾布或濾膜封閉，置放於尿鬥內或安裝在小便池尿液出口處，其形 狀、大小與尿鬥或小便池出口相適應。
8.根據權利要求8所述的富集白蛋白的方法，其特徵在於，用以製作尿液過濾墊的濾 布為篩號300目以下，50目以上孔徑的濾布。
9.根據權利要求1所述的富集白蛋白的方法，其特徵在於，尿液過濾裝置墊所承接的 尿液為男性所排尿液。
10.根據權利要求14所述的富集白蛋白的方法，其特徵在於，尿液過濾裝置所承接的 尿液是尿液原液或經水稀釋的尿液。
全文摘要
本發明涉及一種從人尿中富集白蛋白的方法，特別適合於大規模使用，它是採用陰離子交換劑製作尿液過濾裝置，將其置放於尿鬥或小便池內，用以承接尿液從過濾裝置流過；尿液過濾裝置的形狀、大小與尿鬥或小便池相適應；定時回收尿液過濾裝置，對其中的陰離子交換劑作集中解吸，收集含白蛋白的組份，並對陰離子交換劑作再生處理備作再用。經後續的純化處理，可製得各種指標均達到藥典要求的白蛋白，在多種領域作為人血漿來源白蛋白的替代品應用。
文檔編號C07K14/76GK101798344SQ20101010630
公開日2010年8月11日 申請日期2010年2月5日 優先權日2010年2月5日
發明者俞恆, 傅和亮, 傅和祥, 苗丕渠 申請人:揚州艾迪生物科技有限公司;揚州維普生物科技有限公司