2-(α-羥基戊基)苯甲酸鉀預防和/或治療老年痴呆的用途的製作方法

2023-06-09 15:25:11

專利名稱：：2-(α-羥基戊基)苯甲酸鉀預防和/或治療老年痴呆的用途的製作方法
技術領域：
：本發明涉及2-(a-羥基戊基)苯甲酸鉀鹽在製備用於預防、緩解和/或治療老年痴呆疾病或症狀的藥物中的應用。所述的老年痴呆選自早老性痴呆、血管性痴呆或二者兼有的混合型；所述的老年痴呆疾病或症狀選自記憶力減退、認知功能低下、思維遲鈍或空間定向障礙。本發明還涉及一種用於預防、緩解和/或治療老年痴呆疾病或症狀的藥物組合物，其含有預防或治療有效量的2-(a-羥基戊基)苯甲酸鉀鹽，以及任選的藥學可接受的載體和/或輔料。所述藥物組合物可呈選自如下的劑型溶液、懸液、乳劑、丸劑、膠囊、粉末、控制釋放或持續釋放製劑。本發明另外涉及一種預防、緩解和/或治療老年痴呆疾病或症狀的方法，包括向需要的患者施用治療有效量的2-(a-羥基戊基)苯甲酸鉀鹽或含有其的藥物組合物。通過選自包括但不限於腸胃外、經口、局部、皮內、肌肉內、腹膜內、皮下、鼻內的途徑向患者施用。
背景技術：
：老年痴呆分為早老性痴呆(阿爾茨海默病，Alzheimer'sdisease,AD)和血管性痴呆(vasculardementia,VD)兩類及二者兼有的混合型。AD是一種與年齡高度相關的以進行性認知障礙和記憶力損害為主的中樞神經系統退行性疾病。臨床表現主要為記憶力(特別是近記憶力)減退、認知功能低下、思維遲鈍和空間定向障礙。最具特徵的兩大病理變化是腦組織細胞外澱粉樣肽沉積和神經元內纖維纏結(neurofibrillarytangles,NFT)。該病多發生在60歲以上的人群。我國65歲以上老人的患病率為4%左右，全世界約有5OOO萬老年人患有不同程度的老年痴呆。VD是腦血管疾病引起腦功能障礙而產生的疾病。'在歐美，VD患者佔痴呆總數的1020%。在亞洲，如中國和日本發病率更高。我國正在進入老齡化時代，痴呆患者逐年增多。長期腦供血不足也是導致血管性痴呆的重要原因。痴呆患者不僅本人痛苦，而且對家庭和社會造成很大的負擔，但目前沒有較好的治療藥物，因此尋找有效藥物以延緩、控制AD和VD的發生發展極為重要。本專利申請所用2-(a-羥基戊基)苯甲酸鉀鹽(Potassium2-(l-hydroxypentyl)-benzoate，W-PHPB)是化學合成的新物質，通過核磁、質譜和紅外等光譜分析，證明為單一化合物，高效液相分析，證實其化學純度達98%以上。其製備工藝見專利"2-(a-羥基戊基)苯甲酸鉀鹽及其製法和用途"，公開號1382682。本品的化學結構式如下formulaseeoriginaldocumentpage5迄今尚未見到d-PHPB治療老年痴呆的報導-
發明內容本發明一方面，涉及2-(a-羥基戊^0苯甲酸鉀鹽在製備用於預防、緩解和/或治療老年痴呆疾病或症狀的藥物中的應用。本發明中所述的老年痴呆選自早老性痴呆、血管性痴呆或二者兼有的混合型。所述的老年痴呆疾病或症狀選自記憶力減退、認知功能低下、思維遲鈍和空間定向障礙。本發明中，所述預防是指在老年痴呆發生前，特別是老年痴呆發病初期之前抑制記憶力減退、認知功能低下、思維遲鈍和空間定向障礙等症狀的發生。所述緩解是指老年痴呆發病中過程中或出現老年痴呆後，改善記憶力減退、認知功能低下、思維遲鈍和空間定向障礙等症狀。所述治療是指老年痴呆發病中過程中或出現老年痴呆後，實現臨床意義上的改善記憶力減退、認知功能低下、思維遲鈍和空間定向障礙等症狀。本發明還涉及2-(a-羥基戊基)苯甲酸鉀鹽在製備減輕腦組織氧化應激損傷、提高膽鹼能神經功能、保護神經元和\或提高腦源性神經生長因子含量的藥物中的應用。所述的減輕腦組織氧化應激損傷是通過抑制腦組織代償性異常增高的抗氧化酶活力，減少脂質過氧化產物，恢復腦組織正常的氧化-抗氧化動態平衡。所述的抗氧化酶是超氧化物歧化酶，脂質過氧化產物是丙二酸。改善膽鹼能神經功能是通過提高乙醯膽鹼合成酶的活力，降低乙醯膽鹼水解酶的活力。在本發明中，所述哺乳動物優選的為人。痴呆病人主要表現為認知缺陷，特別是對近記憶和空間知覺的進行性減退。與老年相關的痴呆可由不同原因引起，如血管性(腦缺血)、P-澱粉樣肽沉積相關的改變以及其它與老年相關的未知因素。針對上述病因，本發明釆用了三種公認的模型2-V0大鼠可以模擬臨床上腦供血不足引起的血管性痴呆；大鼠側腦室注射Ae(25,引起的學習記憶障礙是公認的觀測藥物對早老性痴呆(阿爾茨海默病，Alzheimer'sdisease,AD)治療作用的模型；SAMP8既可出現學習記憶障礙，又有部分AD的病理特徵，並且它是一種快速自然發病模型，與人衰老和痴呆的臨床特徵接近，是較為理想的AD替代模型。本研究用國際上公認的方法即Morris水迷宮、水迷路以及跳臺實驗檢測大、小鼠的學習記憶能力，在三種動物模型上觀察了2-U-羥基戊基)苯甲酸鉀鹽對血管性痴呆、！3澱粉樣肽(Af3)誘導的認知障礙以及伴隨快速衰老出現的學習記憶衰退的作用。簡而言之，本發明利用這三種模型觀察了2-(ci-羥基戊基)苯甲酸鉀鹽對痴呆動物學習記憶的改善作用，發現2-(a-羥基戊基)苯甲酸鉀鹽可以明顯改善慢性腦缺血大鼠、A0損傷認知大鼠及快速老化小鼠的學習記憶能力。本發明還研究了其可能的作用機制，發現2-(a-羥基戊基)苯甲酸鉀鹽可以明顯改善慢性腦缺血引起的腦組織形態異常，減少星形膠質細胞的激活，發揮神經元保護作用；可以降低上述三種模型動物腦組織代償性增高的SOD活力、MDA水平升高，減輕氧化損傷，保護神經元；可以增加上述三種模型動物腦內ChAT活力，從而使腦內乙醯膽鹼合成增加，增強學習記憶能力；可以增加慢性腦缺血後腦組織神經營養因子(BDNF)的含量，這可能是其保護腦組織，抗痴呆作用的機理之一。充分說明2-(a-羥基戊基)苯甲酸鉀鹽改善多種原因引起的學習記憶障礙，對老年痴呆可能有明顯的治療作用，也可能改善衰老引起的學習記憶衰退。具體而言，本發明通過慢性腦缺血模型的研究，發現2-(a-羥基戊基)苯甲酸鉀鹽能改善腦供血不足大鼠的近記憶和空間定向功能障礙。VD是由於腦血管疾病引起腦功能障礙而產生的痴呆，多數伴有多發的較大的腦動脈梗塞或腔隙性腦梗塞或腦低灌注。腦血流降低程度與痴呆嚴重性相關。慢性進行性腦供血不足，使其對氧和葡萄糖以及其它必需的代謝物質利用下降，其結果引起氧化損傷、線粒體功能和神經細胞的生物合成受損，突觸傳遞功能受阻，最後導致神經病理學異常，即發生神經退行性改變。VD病人主要表現為近記憶和空間感知進行性衰退以及認知功能缺損。Morris水迷宮實驗是檢測動物空間學習和近記憶能力的經典實驗。本發明通過永久性結紮大鼠雙側頸總動脈(2-V0)建立了持續性腦低灌注模型，用Morris水迷宮法檢測2-(a-羥基戊基)苯甲酸鉀鹽對動物近記憶和空間定向能力的影響。結果發現2-(a-羥基戊基)苯甲酸鉀鹽對腦低灌注大鼠學習記憶的改善作用。在大鼠慢性腦缺血後近l個月後，本發明的發明人進行了兩項實驗，一是定位航行實驗，二是空間探索實驗。在定位航行實驗中觀察了3項指標，包括大鼠找到平臺的時間(潛伏期)、搜索策略及遊泳速度。2-(a-羥基戊基)苯甲酸鉀鹽對慢性腦低灌注大鼠的學習記憶能力減退有較為明顯的改善作用。從潛伏期來看，2-(a-羥基戊基)苯甲酸鉀鹽可明顯改善腦低灌注大鼠的空間學習和近記憶缺陷。以大鼠搜索平臺的策略分析，2-(a-羥基戊基)苯甲酸鉀鹽組採取直線式.、趨向式策略的次數明顯增多。說明2-(a-羥基戊基)苯甲酸鉀鹽可以提高腦低灌注大鼠對空間位置的記憶能力。在整個實驗過程中，各組大鼠的遊泳速度均無明顯變化，組間比較也無明顯差異，表明該實驗方法可很好地檢測大鼠的學習記憶能力而不受體能的幹擾。上述實驗說明2-(a-羥基戊基)苯甲酸鉀鹽可以預防、緩解和/或治療老年痴呆尤其是血管性痴呆疾病中空間學習和近記憶缺陷的症狀。在定位航行實驗結束後，進行平臺探索實驗，將安全島撤去，記錄大鼠在目標象限活動的時間和第一次穿越目標時間，以測試大鼠是否己形成對安全島的空間記憶以及記憶的牢固程度。2-(a-羥基戊基)苯甲酸鉀鹽給藥組大鼠在目標象限的活動時間明顯長於溶劑對照組。從第一次穿越目標時間來看，2-(a-羥基戊基)苯甲酸鉀鹽組也顯著短於溶劑對照組。表明2-(a-羥基戊基)苯甲酸鉀鹽可改善慢性腦低灌注大鼠的空間學習記憶缺陷。上述實驗說明2-(a-羥基戊基)苯甲酸鉀鹽可以預防、緩解和/或治療老年痴呆尤其是血管性痴呆疾病中空間學習記憶缺陷的症狀。為闡述本發明的2-(a-羥基戊基)苯甲酸鉀鹽預防、緩解和/或治療老年痴呆尤其是血管性痴呆的機制，本發明用生化方法檢測2-(a-羥基戊基)苯甲酸鉀鹽對氧化損傷的相關指標和對膽鹼能神經系統的影響，特別是檢測了2-(a-羥基戊基)苯甲酸鉀鹽對腦組織S0D活力、MDA含量和ChAT活力的影響。S0D是體內主要的抗氧化酶之一，可有效清除氧自由基，減輕過氧化損害。MDA是主要的過氧化產物之一。SOD活力可以反映腦組織的抗氧化水平，而MDA反映腦組織脂質過氧化的情況。大鼠慢性腦缺血l個月後，皮層S0D活力和MDA含量顯著升高。給藥治療21天後，2-(a-羥基戊基)苯甲酸鉀鹽組的S0D活力和MM含量顯著低於溶劑對照組。表明2-(a-羥基戊基)苯甲酸鉀鹽可糾正慢性腦低灌注大鼠腦組織代償性異常增高的抗氧化酶活力，減少脂質過氧化產物，恢復腦組織正常的氧化-抗氧化動態平衡。說明2-(a-羥基戊基)苯甲酸鉀鹽能用於製備減輕腦組織氧化應激損傷的藥物。7乙醯膽鹼是中樞神經系統的主要神經遞質之一，介導膽鹼能神經的信號傳遞，與學習記憶有密切關係，而ChAT是乙醯膽鹼的合成酶，其活力可間接反映腦內乙醯膽鹼的含量，反映膽鹼能祌經功能的狀況。大鼠永久性結紮雙側頸總動脈1個月後，海馬ChAT活力下降趨勢明顯。在給藥21天後，2-(ci-羥基戊基)苯甲酸鉀鹽組能顯著提高低灌注大鼠海馬的ChAT活力，改善膽鹼能神經功能。說明2-(a-羥基戊基)苯甲酸鉀鹽能用於製備提高膽鹼能神經功能的藥物。由於腦低灌注引起的行為改變伴隨著腦膠質細胞的激活、白質和灰質改變。為進一步闡述本發明的機制，本發明用病理學和免疫組織化學的方法，觀察了2-(a-羥基戊基)苯甲酸鉀鹽對腦組織形態改變的影響。主要通過HE和K1Uver-Barrera染色(後者反映神經元髓鞘的病理變化)，並以膠質細胞纖維酸性蛋白(GFAP，活化星形膠質細胞的標誌)和腦源性神經生長因子(BDNF，與認知功能和神經元生存有關，對缺血敏感)作為指標。冊染色以不同顏色顯示細胞質和細胞核，可以清楚地看到細胞的大體形態。本研究中溶劑對照組可見皮層神經元皺縮，深染，核不清晰，海馬CA1、CA3區也出現類似變化。實驗結果顯示2-(a-羥基戊基)苯甲酸鉀鹽可明顯改善皮層、海馬CA1和CA3區的神經元形態異常。以上實驗說明，2-(a-羥基戊基)苯甲酸鉀鹽對慢性腦低灌注引起的皮層、海馬神經元損傷有保護和治療作用。K-B染色可反映神經元髓鞘是否完整，進而反映神經纖維的形態學變化。本實驗發現，溶劑對照組大鼠胼胝體和視束出現明顯的空泡化及神經纖維紊亂。2-(a-羥基戊基)苯甲酸鉀鹽三個劑量對胼胝體的病理改變有明顯的改善作用，空泡化減少，神經纖維排列有所恢復。2-(a-羥基戊基)苯甲酸鉀鹽三個劑量對視束的病理改變也有一定的改善作用。以上結果表明，2-(a-羥基戊基)苯甲酸鉀鹽對腦低灌注造成的胼胝體和視束損傷有較為明顯的保護作用。本發明還研究了2-(a-羥基戊基)苯甲酸鉀鹽對低灌注大鼠腦組織GFAP陽性星形膠質細胞的影響。腦低灌注引起的組織學異常可能是空間學習記憶損傷的基礎。其中白質最早受損，同時伴隨反應性星形細胞增加和小膠質細胞活化。膠質細胞酸性蛋白(GFAP)免疫組化染色可用於標記活化的星形膠質細胞。本發明選取四個區域作為觀察對象皮層、海馬、胼胝體和視束。在皮層，溶劑對照組的GFAP陽性細胞數有明顯多於假手術組的趨勢，2-(a-羥基戊基)苯甲酸鉀鹽給藥組在給藥21天後，GFAP陽性細胞數均明顯少於溶劑對照組。在海馬，溶劑對照組的GFAP陽性細胞數明顯多於假手術組，各給藥組的該指標值也明顯小於溶劑對照組。在胼胝體，雖然溶劑對照組的GFAP陽性細胞數與假手術組比較無顯著差異，但2-(a-羥基戊基)苯甲酸鉀鹽給藥組的該指標值還是小於溶劑對照組。在視束，溶劑對照組的GFAP陽性細胞數明顯多於假手術組，2-(a-羥基戊基)苯甲酸鉀鹽給藥21天後，GFAP陽性細胞數明顯少於溶劑對照組。以上說明，2-(a-羥基戊基)8苯甲酸鉀鹽可明顯減輕慢性腦低灌注大鼠腦組織損傷，減少活化的星形膠質細胞數量，尤其在海馬、視束和皮層。服染色、K-B染色和膠質細胞纖維酸性蛋白免疫組化實驗結果說明2-(ci-羥基戊基)苯甲酸鉀鹽能用於製備保護神經元的藥物。本發明進一步研究了2-(a-羥基戊基)苯甲酸鉀鹽對腦低灌注大鼠腦組織BDNF分布面積和含量的影響。腦源性神經生長因子(BDNF)可維持神經元的生存和發育，存在於正常動物的腦組織，也可在缺血早期高表達，但在缺血24h後一般表達下降。從BDNF免疫組化染色密度看，溶劑對照組與假手術組比較，無論在皮層或是海馬，BDNF均顯著減少，給藥組與溶劑對照組比較，在皮層，2-(a-羥基戊基)苯甲酸鉀鹽可增加BDNF的表達；在海馬CA1、CA2、CA3區，2-(a-羥基戊基)苯甲酸鉀鹽可顯著增加BDNF的表達。由於染色密度與BDNF的含量成正比。以上結果表明，2-(a-輕基戊基)苯甲酸鉀鹽可增加慢性腦缺血腦組織中BDNF的含量。說明2-(a-羥基戊基)苯甲酸鉀鹽能用於製備提高腦源性神經生長因子含量的藥物。本發明通過在e-澱粉樣肽痴呆模型上的研究，發現2-(a-羥基戊基)苯甲酸鉀鹽能明顯改善e-澱粉樣肽(25-35)引起的大鼠記憶和空間定向力障礙。AD是老年人認知功能進行性減退的最主要原因。其主要病理改變是形成以e-澱粉樣肽(P-amyloid,Ae)沉積為核心的老年斑和神經元內纖維纏結。AP由39-43個胺基酸組成，是e前體蛋白的降解產物。A0沉積的範圍與神經損傷和認知功能缺損密切相關。而AP(關)是Ae的毒性片段，它具有與AP(h。)或A0(1—幼相似但更強更快的毒性作用。既往研究證實一次性側腦室注射(i.c.v.)Ae(25—35)能引起大鼠學習和記憶損傷，類似AD患者的症狀，提示側腦室注射Ae(25,可模擬AD。本實驗選用大鼠i.c.v.八0(25-35)作為模型。-本發明用Morris水迷宮檢測了2-(a-羥基戊基)苯甲酸鉀鹽對動物近記憶和空間位置記憶功能的影響。結果發現，2-(a-羥基戊基)苯甲酸鉀鹽對痴呆大鼠學習記憶的改善作用。定位航行實驗中，2-(a-羥基戊基)苯甲酸鉀鹽能劑量依賴性地縮短AP(25-35)誘導的痴呆大鼠的潛伏期，說明2-(ci-羥基戊基)苯甲酸鉀鹽能劑量依賴性地改善痴呆大鼠的學習記憶能力。在4天的訓練中，各組大鼠的遊泳速度無顯著性差別，說明i.c.v.Ae(25-糊不影響動物的體能，水迷宮實驗能可靠反映動物的學習記憶能力。說明2-(ct-羥基戊基)苯甲酸鉀鹽可以預防、緩解和/或治療老年痴呆尤其是早老性痴呆疾病中近記憶缺陷的症狀。平臺探索實驗中，2-(a-羥基戊基)苯甲酸鉀鹽組在目標象限活動時間的百分比明顯長於溶劑對照組；第一次穿越平臺時間，2-(a-羥基戊基)苯甲酸鉀鹽組也有縮短的趨勢，2-(a-羥基戊基)苯甲酸鉀鹽可劑量依賴性地增加痴呆大鼠空間位置學習記憶。說明2-(a-羥基戊基)苯甲酸鉀鹽可以預防、緩解和/或治療老年9痴呆尤其是早老性痴呆疾病中空間位置學習記憶缺陷的症狀。為闡述本發明的2-(a-羥基戊基)苯甲酸鉀鹽預防、緩解和/或治療老年痴呆尤其是早老性痴呆的機制，生化方法分別檢測氧化應激損傷以及膽鹼能神經功能缺陷的影響，特別是檢測了2_(a-羥基戊基)苯甲酸鉀鹽對痴呆大鼠腦組織SOD活力、MDA含量和ChAT活力的影響。本發明中，i.c.v.A3(25—35)後14天，S0D的活力代償性升高，而口服給予2-(a-羥基戊基)苯甲酸鉀鹽兩周後，皮層SOD活力分別顯著下降，說明2-(a-羥基戊基)苯甲酸鉀鹽可劑量依賴性地降低皮層S0D活力。在皮層，溶劑對照組的MDA含量顯著升高。連續口服2-(a-羥基戊基)苯甲酸鉀鹽兩周後，皮層MDA含量下降，與溶劑對照組比較均具有顯著性差異，2-(a-羥基戊基)苯甲酸鉀鹽可劑量依賴性的降低A0(25-35)誘導的大鼠皮層MDA含量增高。SOD活力和MDA含量實驗說明2-(a-羥基戊基)苯甲酸鉀鹽能用於製備減輕腦組織氧化應激損傷的藥物。大鼠i.c.v.Af3(25—35)後，皮層ChAT活力未見明顯改變，但口服給予2_(a-羥基戊基)苯甲酸鉀鹽兩周後，與溶劑對照組比較，39mg/kg可顯著增加ChAT活力(P〈0.05)，129mg/kg也有很強的增高該酶活力的趨勢。說明，AeC5-35)雖然未造成皮層ChAT活力的下降，但2-(a-羥基戊基)苯甲酸鉀鹽仍有可能增加痴呆大鼠的ChAT活力。說明2-(a-羥基戊基)苯甲酸鉀鹽能用於製備提高膽鹼能神經功能的藥物。綜上所述，2-(a-羥基戊基)苯甲酸鉀鹽可劑量依賴性地降低早老性痴呆患者皮層的SOD活力和MDA含量，表明該藥可糾正早老性痴呆患者皮層代償性異常增高的抗氧化酶活力，減少脂質過氧化產物，恢復腦組織正常的氧化與抗氧化動態平衡。另外，2-(a-羥基戊基)苯甲酸鉀鹽很有可能提高早老性痴呆患者皮層ChAT活力，改善膽鹼能神經功能。本發明在快速老化小鼠模型上的研究發現2-(a-羥基戊基)苯甲酸鉀鹽對快速老化小鼠學習記憶缺陷的改善作用。快速老化小鼠(senescenceacceleratedmouse,SAM)可分為兩個亞系，即P系和R系。前者稱為快速老化小鼠(SAM/prone，SAMP)，表現有脫毛、皮膚粗糙、行為障礙及生存期縮短等衰老現象，並有遺傳傾向。後者稱為抗快速老化小鼠，有正常的衰老過程。SAMP共有12個亞系，其中SAMP8主要以學習記憶功能呈增齡性衰退，中樞神經系統如皮層、海馬等部位發生病理改變為主。文獻報導，SAMP8在增齡過程中腦內有大量AP沉積，與學習記憶功能相關的腦內神經遞質也發生相應改變，如皮層和海馬乙醯膽鹼水平降低，阿片肽、Y-氨基丁酸水平升高，5-羥色胺先升高後降低等。腦內脂質過氧化物含量也升高，氧化-抗氧化系統紊亂，出現氧化應激損傷。同時伴有明顯的線粒體功能紊亂。總之，SAMP8可以較好的模擬自然衰老過程中緩慢發生的老年痴呆，是研究衰老與學習記憶功能以及學習記憶功能障礙發生機制的良好動物模型。本研究用跳臺實驗檢測SAMP8的被動迴避反應能力，用水迷路檢測其近記憶和空間學習記憶能力。結果發現2-(a-羥基戊基)苯甲酸鉀鹽對SAMP8學習記憶缺陷的改善作用，2-(a-羥基戊基)苯甲酸鉀鹽對老年痴呆的治療作用和智力衰退的延緩作用。本發明中，2-(a-羥基戊基)苯甲酸鉀鹽給藥組SAMP8遭受的電擊次數明顯少於對照組；第一次跳下安全臺的潛伏期明顯長於對照組，並有劑量依賴關係。說明2-(a-羥基戊基)苯甲酸鉀鹽長期給藥可提高SAMP8小鼠的被動迴避反應能力，2-(a-羥基戊基)苯甲酸鉀鹽可明顯改善哺乳動物的學習能力和記憶保持能力。說明2-(a-羥基戊基)苯甲酸鉀鹽可改善老年痴呆尤其混合型痴呆患者的學習能力和記憶保持能力。水迷路實驗常用於測試動物的近記憶和空間學習記憶能力。通過測定動物進入盲端的錯誤次數和找到臺階的潛伏期反映其學習記憶能力。本發明中，2-(a-羥基戊基)苯甲酸鉀鹽給藥組給藥組動物進入盲端的錯誤次數明顯少於對照組；潛伏期也明顯短於對照組。2-(a-羥基戊基)苯甲酸鉀鹽可明顯改善SAMP8的近記憶和空間學習記憶缺陷，並有一定的劑量依賴性。說明2-(a-羥基戊基)苯甲酸鉀鹽可以預防、緩解和/或治療老年痴呆尤其是混合型性痴呆疾病中近記憶和空間學習記憶缺陷的症狀。為闡述本發明的2-(a-羥基戊基)苯甲酸鉀鹽預防、緩解和/或治療老年痴呆尤其是混合型痴呆的機制，用生化方法測定其腦組織與學習記憶和衰老相關的生化指標，特別是檢測了2-(a-羥基戊基)苯甲酸鉀鹽對腦組織SOD活力、MDA含量、ChAT活了和AChE活力的影響。本發明中，SAMP8小鼠連續口服2-(a-羥基戊基)苯甲酸鉀鹽35天後，可明顯降低海馬SOD活力，與對照組比較有顯著性差異。給藥35天後，2-(a-羥基戊基)苯甲酸鉀鹽給藥組的海馬MDA含量與對照組比較，有較明顯的降低趨勢。說明2-(a-羥基戊基)苯甲酸鉀鹽有可能降低海馬的MDA含量。以上說明，2-(a-羥基戊基)苯甲酸鉀鹽可糾正混合型痴呆患者海馬組織代償性異常增高的抗氧化酶活力，也可能減少脂質過氧化產物，進而恢復腦組織正常的氧化-抗氧化動態平衡，減輕氧化應激損傷。乙醯膽鹼是中樞神經系統的主要神經遞質之一，介導膽鹼能神經的信號傳遞，與學習記憶有密切關係，而ChAT是乙醯膽鹼的合成酶，AChE是乙醯膽鹼的水解酶，二者的活力可間接反映腦內乙醯膽鹼的含量，反映膽鹼能神經功能的狀況。連續給藥35天後，2-(a-羥基戊基)苯甲酸鉀鹽給藥組SAMP8小鼠海馬的ChAT活力增高，和對照組比較，有顯著的統計學差異，並有一定的劑量依賴性。2-(a-羥基戊基)苯甲酸鉀鹽給藥組海馬的AChE活力有明顯低於對照組的趨勢。說明2-(a-羥基戊基)苯甲酸鉀鹽可能有降低SAMP8小鼠海馬AChE活力的作用。綜上所述，2-(ct-羥基戊基)苯甲酸鉀鹽可劑量依賴性地提高混合型痴呆患者海馬組織的ChAT活力，對其海馬AChE活力也有一定的降低趨勢。表明，2-(a-羥基戊基)苯甲酸鉀鹽可能通過增加混合型痴呆患者海馬乙醯膽鹼含量而改善其膽鹼能神經功能。總而言之，2-(a-羥基戊基)苯甲酸鉀鹽對血管性痴呆具有預防、緩解和/或治療作用。2-(a-羥基戊基)苯甲酸鉀鹽能明顯改善血管性痴呆患者近記憶和空間位置記憶障礙。2-(a-羥基戊基)苯甲酸鉀鹽能明顯降低血管性痴呆患者腦組織代償性增高的S0D活力和脂質過氧化產物MDA水平，說明其能抑制氧化應激對神經細胞的損傷。2-(a-羥基戊基)苯甲酸鉀鹽可升高血管性痴呆患者腦組織的ChAT活力，很可能使腦內乙醯膽鹼水平增高，有利於改善學習記憶。2-(a-羥基戊基)苯甲酸鉀鹽能改善血管性痴呆患者腦組織的病理改變，包括白質稀疏、空泡形成、膠質細胞增多和神經元形態異常，並緩解缺血引起的腦組織腦源性神經生長因子的減少。2-(a-羥基戊基)苯甲酸鉀鹽對早老性痴呆具有預防、緩解和/或治療作用。2-(a-羥基戊基)苯甲酸鉀鹽對早老性痴呆患者的學習和記憶缺陷有明顯的改善作用。2-(a-羥基戊基)苯甲酸鉀鹽能降低早老性痴呆患者代償性增高的腦組織S0D活力和MDA水平增高，減輕氧化損傷，保護神經元。2-(a-羥基戊基)苯甲酸鉀鹽能提高膽鹼能神經遞質乙醯膽鹼合成酶ChAT的活力，很可能通過改善膽鹼能神經功能而改善早老性痴呆患者的學習記憶障礙。2-(a-羥基戊基)苯甲酸鉀鹽對混合型痴呆具有預防、緩解和/或治療作用。2_(a-羥基戊基)苯甲酸鉀鹽可明顯改善混合型痴呆患者的近記憶以及空間位置記憶缺陷。2-(a-羥基戊基)苯甲酸鉀鹽能降低混合型痴呆患者海馬SOD活力，並可能降低海馬MDA水平，說明其能減輕氧化損傷，保護神經元。2-(a-羥基戊基)苯甲酸鉀鹽能提高海馬膽鹼能神經遞質乙醯膽鹼合成酶ChAT的活力，並可能降低其水解酶AChE的活力。說明其很可能通過提高膽鹼能神經功能而改善混合型痴呆患者的學習記憶缺陷。總之，2-(a-羥基戊基)苯甲酸鉀鹽有治療老年痴呆的作用，並減輕伴隨快速衰老出現的認知衰退，其作用機制包括減輕腦組織氧化應激損傷、提高膽鹼能神經功能、提高腦組織腦源性神經生長因子含量等。本發明另一方面，涉及一種用於預防、緩解和/或治療老年痴呆疾病或症狀的藥物組合物，其含有預防或治療有效量的2-(a-羥基戊基)苯甲酸鉀鹽，以及任選的藥學可接受的載體和/或輔料。在本發明中，根據施用途徑所述藥物組合物可呈選自如下的劑型溶液、懸液、乳劑、丸劑、膠囊、粉末、控制釋放或持續釋放製劑。本發明的2-(a-羥基戊基)苯甲酸鉀鹽藥物組合物可以用已知的方法配製，使用幾種途徑對受試者施用，包括但不限於腸胃外、經口、局部、皮內、肌肉內、腹膜內、皮下、鼻內途徑。本發明中2-(a-羥基戊基)苯甲酸鉀鹽可通過已知方法製備得到。本發明的2-(a-羥基戊基)苯甲酸鉀鹽藥物組合物任選的可以通過任何常規方法用一種或多種藥學可接受的載體和/或賦形劑來配製。因此，2-(a-羥基戊基)苯甲酸鉀鹽和它們的溶劑化物可以特別配製為例如吸入或吹入(通過口或鼻)或經口、含化、腸胃外或直腸給藥。2-(ct-羥基戊基)苯甲酸鉀鹽藥物組合物也可以採用溶液、懸液、乳劑、丸劑、膠囊、粉末、控制釋放或持續釋放製劑等形式。這些製劑將含有治療有效量的2-(a-羥基戊基)苯甲酸鉀鹽，優選為純化形式，以及適量的載體，以提供對患者適當給藥的形式。製劑應當適合給藥方式。在本發明中，所述純化形式的2-(a-羥基戊基)苯甲酸鉀鹽是指基本上純的2-(a-羥基戊基)苯甲酸鉀鹽，尤其是純度大於80%,優選的大於85%，特別優選的大於90%，甚至更優選的大於98%的2-(a-羥基戊基)苯甲酸鉀鹽。具體的，所述純化形式的2-(a-羥基戊基)苯甲酸鉀鹽純度範圍可以是例如95%—99%。腸胃外給藥2-(a-羥基戊基)苯甲酸鉀鹽藥物組合物可以配製為通過注射例如通過推注來腸胃外給藥。用於注射的製劑可以以單位劑型存在於含有任選添加的防腐劑的安瓿或多劑量容器中。腸胃外製劑可以包含在由玻璃、塑料等製成的安瓿、一次性注射器或多劑量瓶中。製劑可以採用諸如在油性或水性載體中的懸液、溶液或乳劑的形式，並且可以含有輔劑，如懸浮劑、穩定劑和/或分散劑。例如，腸胃外製劑可以是在無毒腸胃外可接受的稀釋劑或溶劑中的無菌注射溶液或懸液(例如，1,3-丁二醇中的溶液)。可接受的載體和可以使用的溶劑包括水、林格液和等滲氯化鈉溶液。另外，常規使用無菌的不揮發性油作為溶劑或懸浮介質。為此目的可以使用任何溫和的不揮發性油，包括合成的甘油一酯和甘油二酯。另外，在腸胃外製劑中也可以使用脂肪酸如油酸。此外，2-(a-羥基戊基)苯甲酸鉀鹽藥物組合物也可以配製為粉末形式，以在使用前用適合的載體如無熱原的無菌水重建。例如，適合腸胃外給藥的132-(a-羥基戊基)苯甲酸鉀鹽藥物組合物可以包括無菌等滲鹽水溶液，其中含有每體積O.1%至90%重量的2-((1-羥基戊基)苯甲酸鉀鹽。例如，溶液可以含有約5%至約20%，更優選地約5%至約17%,更優選約8%至約14%，再更優選約10%的2-(ci-羥基戊基)苯甲酸鉀鹽。溶液或粉末製劑也可含有增溶劑和局部麻醉劑如利多卡因，以便減輕注射部位的疼痛。其他腸胃外化合物給藥方法是本領域已知的，並且在本發明的範圍內。'經口給藥對於經口給藥，2-(a-羥基戊基)苯甲酸鉀鹽藥物組合物可以採用片劑或膠囊的形式，其通過常規方法用藥學可接受的賦形劑如粘合劑、填料、潤滑劑和崩解劑製備。A.粘合劑粘合劑包括但不限於玉米澱粉、馬鈴薯澱粉或其他澱粉、明膠、天然和合成樹膠如阿拉伯膠、藻酸鈉、藻酸、其他藻酸鹽、西黃蓍膠粉、瓜爾膠、纖維素及其衍生物(例如，乙基纖維素、乙酸纖維素、羧甲基纖維素鈣、羧甲基纖維素鈉)、聚乙烯吡咯烷酮、甲基纖維素、預膠凝澱粉、羥丙基甲基纖維素(例如，Nos.2208，2906，2910)、微晶纖維素及其混合物。合適的微晶纖維素的形式包括，例如，以AVICEL-PH-101、AVICEL-PH-103和AVICEL-PH-105出售的材茅鬥(可來自FMCCorporation,AmericanViscoseDivision,AvicelSales,MarcusHook，Pennsylvania,USA)。合適的粘合劑的一個例子是FMCCorporation以AVICELRC-581銷售的微晶纖維素和羧甲基纖維素鈉的混合物。B.填料填料包括但不限於滑石、碳酸鈣(例如顆粒或粉末)、乳糖、微晶纖維素、粉狀纖維素、葡聚糖結合劑(dextrates)、高嶺土、甘露醇、矽酸、山梨醇、澱粉、預膠凝澱粉及其混合物。C.潤滑劑潤滑劑包括但不限於硬脂酸鈣、硬脂酸鎂、礦物油、輕質礦物油、甘油、山梨醇、甘露醇、聚乙二醇、其他乙二醉、硬脂酸、硫酸月桂酯鈉、滑石、氫化植物油(例如，花生油、棉籽油、向日葵油、芝麻油、橄欖油、玉米油和豆油)、硬脂酸鋅、油酸乙酯、月桂酸乙酯、瓊脂及其混合物。另外的潤滑劑包括，例如，固態矽膠(AEROSIL200，Baltimore,Maryland,USA的W.R.GraceCo.生產)、合成矽的凝結氣溶膠(DeaussaCo.ofPlano，Texas,USA銷售)、CAB-O-SIL(Boston,Massachusetts,USA的CabotCo.銷售的一種致熱二氧化矽產品)及其混合物。D.崩解劑崩解劑包括但不限於瓊脂-瓊脂、藻酸、碳酸鈣、微晶纖維素、交聯羧甲基纖維素鈉、交聚維酮、聚克立林鉀、澱粉羥乙酸鈉、馬鈴薯或木薯澱粉、其他澱粉、預膠凝澱粉、其他澱粉、粘土、其他藻膠、其他纖維素、樹膠及其混合物。片劑或膠囊可以任選地用本領域公知的方法包衣。如果本發明的2-(a-羥基戊基)苯甲酸鉀鹽藥物組合物使用粘合劑和/或填料，則它們一般配製成約50%至約99%重量的化合物。一方面，約0.5%至約15%重量的崩解劑，特別是約1%至約5%重量的崩解劑，可以與2-('a-羥基戊基)苯甲酸鉀鹽組合使用。任選地可以添加潤滑劑，其量一般不到2-(a-羥基戊基)苯甲酸鉀鹽的約1%重量。製備固體口服劑型的技術和藥學可接受的添加劑在Marshall,SOLIDORALDosageFo脂s，ModernPharmaceutics(Banker禾口Rhodes,Eds.)，7:359-427(1979)中描述。其他較不典型的製劑是本領域公知的。用於口服的液體製劑可以採用溶液、糖漿或懸液的形式。或者，液體製劑可以為幹製品的形式，在使用前用水或合適的載體重建。這些液體製劑可以通過常規方法用藥學可接受的添加劑如懸浮劑(例如，山梨醇糖漿、纖維素衍生物或氫化食用脂)、乳化劑(例如，卵磷脂或阿拉伯膠)、非水載體(例如，杏仁油、油狀酯、乙醇或分餾植物油)、和/或防腐劑(例如，甲基或丙基對羥基苯甲酸脂或山梨酸)來製備。這些製劑也可以含有適當的緩衝鹽、調味劑、著色劑、芳香劑和甜味劑。用於口服的製劑也可以配製為實現化合物的控制釋放。口服製劑優選地含有10%至95%的化合物。另外，本發明的2-(ci-羥基戊基)苯甲酸鉀鹽藥物組合物也可以用常規方法配製為用於含化給藥的片劑或錠劑。2-(d-羥基戊基)苯甲酸鉀鹽藥物組合物的其他經口給藥方法是本領域技術人員公知的，並且在本發明的範圍內。控制釋放給藥為了延長2-(a-羥基戊基)苯甲酸鉀鹽的活性和減少給藥頻率，可以配製控制釋放(或持續釋放)製劑。控制釋放製劑也可以用來影響起效時間或其他特徵，如血液化合物水平，從而影響副作用的產生。控制釋放製劑可以設計為最初釋放產生所需療效的一定量的2-(a-羥基戊基)苯甲酸鉀鹽，逐漸且連續地釋放另外含量的2-(a-羥基戊基)苯甲酸鉀鹽，以便在長時間內保持療效水平。為了在體內保持接近恆定的化合物水平，2-(a-羥基戊基)苯甲酸鉀鹽可以以一定的速度從劑型中釋放出來，代替從體內代謝和/或分泌出去的2-(a-羥基戊基)苯甲酸鉀鹽。2-(a-羥基戊基)苯甲酸鉀鹽的控制釋放可以由多種誘導因素來刺激，如，pH變化，溫度變化，酶，水，或其他生理條件或分子。控制釋放系統可以包括，例如，輸注泵，其可以用來以類似於向特定器官或腫瘤輸送胰島素或化療劑的方式施用化合物。使用這種系統，2-(a-羥基戊基)苯甲酸鉀鹽一般與生物可降解的、生物相容的聚合植入體組合施用，其在選擇的部位在控制的時間內釋放2-(a-羥基戊基)苯甲酸鉀鹽。聚合材料的例子包括聚酐、聚原酸酯、聚乙醇酸、聚乳酸、聚乙烯乙烯乙酸酯及其共聚物和組合。另外，控釋系統可以置於治療目標附近，因此只需要全身劑量的一部分。本發明的2-(a-羥基戊基)苯甲酸鉀鹽可以用本領域技術人員公知的其他控制釋放方法或給藥裝置來施用。包括，例如，羥丙基甲基纖維素、其他聚合基質、凝膠、可透膜、滲透系統、多層包衣、微粒、脂質體、微球等，或者任何上述的組合，以不同的比例提供所需的釋放譜。2-(a-羥基戊基)苯甲酸鉀鹽的其他控制釋放給藥方法是本領域技術人員公知的，並且在本發明的範圍內。吸入給藥2-(a-羥基戊基)苯甲酸鉀鹽也可以通過吸入直接向肺施用。對於吸入給藥，可以通過許多不同的裝置方便地將2-(a-羥基戊基)苯甲酸鉀鹽輸送到肺。例如，計量吸入器(〃MDI〃)，其使用的罐含有合適的低沸點拋射劑，例如，二氯二氟甲烷、三氯氟甲垸、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其他合適的氣體，可以用來直接向肺輸送化合物。MDI裝置可以從許多供應者處獲得，例如3MCorporation、Aventis、BoehringerIngleheim、ForestLaboratories、Glaxo-Wellcome、ScheringPlough和Vectura。此外，也可以使用乾粉吸入器(DPI)裝置向肺施用化合物。DPI裝置一般使用一種機構，例如，爆發的氣體，在容器內產生雲狀乾粉，然後可以被患者吸入。DPI裝置也是本領域公知的，可以購自許多供應商，包括，例如，Fisons、Glaxo-Wellcome、InhaleTherapeuticSystems、MLLaboratories、Qdose和Vectura。一種普及的變化形式是多劑量DPI(〃MDDPI〃)系統，它允許施用一個以上的治療劑量。MDDPI裝置可以從諸如AstraZeneca、GlaxoWellcome、IVAX、ScheringPlough、SkyePharma和Vectura這樣的公司獲得。例如，用於吸入器和吹入器的明膠膠囊和藥筒可以配製為含有2-(a-羥基戊基)苯甲酸鉀鹽和適用於該系統的粉末基質如乳糖或澱粉的粉末混合物。可以用於向肺施用化合物的另外一種類型的裝置是例如AradigmCorporation提供的液體噴霧裝置。液體噴霧系統使用極小的噴嘴來使液體化合物霧化，然後可以被直接吸入到肺中。例如，可以使用霧化器裝置向肺施用化合物。霧化器例如通過使用超聲能，由液體化合物製劑產生氣溶膠，形成易於吸入的細顆粒。霧化器的例子包括Sheffield/SystemicPulmonaryDeliveryLtd.、Aventis禾口BatellePulmonaryTherapeutics提供的裝置。在另外一個實施例中，可以使用電流體力學(〃EHD〃)氣溶膠裝置向肺施用16化合物。EHD氣溶膠裝置使用電能將液體化合物溶液或懸液霧化。當用EHD氣溶膠裝置向肺施用該化合物時，化合物製劑的電化學性質是將要優化的重要參數。這種優化由本領域技術人員常規進行。2-(a-羥基戊基)苯甲酸鉀鹽的其他肺內給藥方法是本領域技術人員公知的，並且在本發明的範圍內。適用於霧化器和液體噴霧裝置和EHD氣溶膠裝置的液體2-(a-羥基戊基)苯甲酸鉀鹽製劑一般包含2-(a-羥基戊基)苯甲酸鉀鹽和藥學可接受的載體。在一個代表性實施方案中，藥學可接受的載體是一種液體，如醇、水、聚乙二醇或全氟碳。任選地，可以加入另外一，種物質來改變化合物溶液或懸液的氣溶膠性質。例如，這種物質可以是液體，如醇、二醇、聚乙二醇或脂肪酸。配製適用於氣溶膠裝置的液體化合物溶液或懸液的其他方法是本領域技術人員公知的。貯庫型給藥2-(a-羥基戊基)苯甲酸鉀鹽也可以配製為貯庫型製劑。這樣的長效製劑可以通過植入(例如皮下或肌肉內)或通過肌肉注射給藥。因此，化合物可以與合適的聚合或疏水性材料一起配製，如在可接受的油或離子交換樹脂中的乳劑，或者作為微溶性的衍生物如微溶性的鹽。2-(a-羥基戊基)苯甲酸鉀鹽的其他貯庫型給藥方法是本領域技術人員公知的，並且在本發明的範圍內。局部給藥對於局部給藥，2-(a-羥基戊基)苯.甲酸鉀鹽可以與載體組合，以便遞送有效劑量，根據所需活性，有效劑量為例如1.0iiM至1.0mM。在本發明的一個方面，局部給藥的藥物組合物可以應用於皮膚。載體可以是，例如但不限於軟膏、乳膏、凝膠、糊狀物、泡沫、氣溶膠、栓劑、墊或膠凝棒的形式。局部製劑也可以在眼科可接受的賦形劑如緩衝鹽水、礦物油、植物油如玉米油或花生油、凡士林、Mglyol182、醇溶液或脂質體或脂質體樣產品中包含治療有效量的化合物。任何這些化合物也可以包含防腐劑、抗氧化劑、抗生素、免疫抑制劑和其他對該化合物沒有有害作用的生物學或藥學有效的藥劑。2-(a-羥基戊基)苯甲酸鉀鹽的其他局部給藥方法是本領域技術人員公知的，並且在本發明的範圍內。其他給藥系統各種其他給藥系統是本領域公知的，可以用來施用本發明的化合物。而且，這些和其他給藥系統可以聯合和/或改變，來優化本發明的2-(a-羥基戊基)苯甲酸鉀鹽的給藥。本發明還涉及一種預防、緩解和/或治療老年痴呆疾病或症狀的方法，包括向需要的患者施用治療有效量的2-(a-羥基戊基)苯甲酸鉀鹽或含有其的藥物組合物。給藥的途徑包括但不限於腸胃外、經口、局部、皮內、肌肉內、腹膜內、皮下、鼻內的途徑。在本發明中，所述治療有效量的2-(a-羥基戊基)苯甲酸鉀鹽可以為0.5一200mg/kg體重之間的任一量，優選為1-150mg/kg體重，更優選為2—100mg/kg體重，更優選為3—50mg/kg體重，更優選為4一35mg/kg體重，更優選為5-20mg/kg體重之間的任一量。治療有效劑量的確定原則本發明中所述術語"治療有效量"是指當根據受試者疾病或病症的性質和嚴重程度對特定受試者施用時具有所霄療效的量，例如將治癒、預防、抑制或至少部分阻止或部分預防目標疾病或病症的量。2-(a-羥基戊基)苯甲酸鉀鹽的毒性和療效可以通過在細胞培養物或實驗動物中用於測定LD5。(50%群體致死劑量)和ED5。(50%群體有效治療劑量)的標準藥學方法來確定。毒性和療效之間的劑量比是一個治療指數，可以表示為比值LD5。/ED5。。。從細胞培養試驗和動物研究中獲得的數據可以在配製用於人類和其他哺乳動物的劑量範圍中使用。2-(ci-羥基戊基)苯甲酸鉀鹽的劑量優選地在具有極小毒性或沒有毒性的包括ED5。的循環血漿或其他體液濃度的範圍內。該劑量可能在該範圍內變化，取決於所使用的劑型和給藥途徑。對於本發明的2-(ci-羥基戊基)苯甲酸鉀鹽，治療有效劑量可以在開始時根據動物試驗來估計。可以在動物模型中設計劑量，以達到測定的包括IC5。的循環血漿濃度範圍。可以利用這些信息更精確地確定在人類和其他哺乳動物中有用的劑量。血漿中的2-(a-輕基戊基)苯甲酸鉀鹽水平例如可以通過高效液相層析來測定。可與藥學可接受的載體組合產生單劑型的2-(a-羥基戊基)苯甲酸鉀鹽的量根據所治療的宿主和具體給藥模式而不同。本領域技術人員應當理解，每個劑型的個別劑量中所含的2-(a-羥基戊基)苯甲酸鉀鹽的單位含量不需要本身構成治療有效量，因為可以通過施用多個個別劑量來達到需要的治療有效量。劑量的選擇取決於使用的劑型、所治療的疾病和根據本領域技術人員的決定所要達到的具體目的。用本發明的2-(d-羥基戊基)苯甲酸鉀鹽治療疾病或病症的劑量方案根據多種因素來選擇，包括患者的類型、年齡、體重、性別、飲食和醫學狀況，給藥途徑，藥理學考慮因素，如活性、有效性、所使用的具體化合物的藥物代謝動力學和毒理學分布，是否使用2-(a-羥基戊基)苯甲酸鉀鹽給藥系統。因此，實際使用的劑量方案可能在受試者與受試者之間非常不同。18W-raPB、PHPB是指2-(a-羥基戊基)苯甲酸鉀鹽，SOD是指超氧化物歧化酶，MDA是指丙二醛。ChAT是指膽鹼乙醯基轉移酶，AChE是乙醯膽鹼脂酶，ATPase是指三磷酸腺苷酶。圖1.口服W-PHPB對永久性結紮雙側頸總動脈大鼠在水迷宮定位航行實驗中逃避潛伏期的影響。所有數值以均數±標準誤表示^=17-20)。#戶<0.05,##屍<0.01與假手術(sham)組比較；*P<0.05與溶劑對照組(vehicle)比較(LSD檢驗)。圖2.永久性結紮雙側頸總動脈大鼠在水迷宮定位航行實驗中的典型搜索策略。A:邊緣式；B:隨機式；C:趨向式；D:直線式。圖3.口服W-PHPB對永久性結紮雙側頸總動脈大鼠在水迷宮平臺探索實驗中目標象限活動時間和第一次穿越目標時間的影響。圖A表示目標象限活動時間的變化；圖B表示第一次穿越目標時間的變化。所有數值以均數±標準誤表示("=17-20)。#^0.01與假手術(sham)組比較；*P<0.0;5，***P<0.01與溶劑對照組(vehicle)比較(LSD檢驗)。圖4.口服"/^1^8對永久性結紮雙側頸總動脈大鼠腦組織生化的影響。圖A表示皮層超氧化物歧化酶(SOD)活力的改變；圖B表示皮層丙二醛(MDA)含量的改變；圖C表示海馬膽鹼乙醯基轉移酶(ChAT)活力的改變。所有數值以均數土標準誤表示("=5-8)。###屍<0.001與假手術(sham)組比較；*P<0.05，**屍<0.01,***屍<0.001與溶劑對照組(vehicle)比較(LSD檢驗)。圖5.口服d-PHPB對永久性結紮雙側頸總動脈大鼠大腦皮層神經元形態的影響(HE染色)。Sham:假手術組；Vehicle:溶劑對照組。400倍。圖6.口服d-PHPB對永久性結紮雙側頸h動脈大鼠大腦海馬CA1區神經元形態的影響(HE染色)。Sham:假手術組；Vehicle:溶劑對照組。400倍。圖7.口服d-PHPB對永久性結紮雙側頸總動脈大鼠大腦海馬CA3區神經元形態的影響(HE染色)。Sham:假手術組；Vehicle:溶劑對照組。400倍。圖8.口服C//-PHPB對永久性結紮雙側頸總動脈大鼠大腦胼胝體形態的影響(K-B染色)。Sham:假手術組；Vehicle:溶劑對照組。400倍。圖9.口服d-PHPB對永久性結紮雙側頸總動脈大鼠大腦視束形態的影響(K-B染色)。Sham:假手術組；Vehicle:溶劑對照組。400倍。圖10.口服d-PHPB對永久性結紮雙側頸總動脈大鼠海馬GFAP陽性星形膠質細胞數量的影響(免疫組化染色)。A:假手術組；B:溶劑對照組；C:吡拉西坦600mg/kg組；D:PHPB13mg/kg組；E:PHPB39mg/kg組；F:PHPB129mg/kg組。200倍。圖ll.口服a-PHPB對永久性結紮雙側頸總動脈大鼠視束GFAP陽性星形膠質細胞數量的影響(免疫組化染色)。A:假手術組;B:溶劑對照組；C:吡拉西坦600mg/kg組；D:PHPB13mg/kg組；E:PHPB39mg/kg組；F:PHPB129mg/kg組。200倍。圖12.口服d-PHPB對永久性結紮雙側頸總動脈大鼠腦組織GFAP陽性星形膠質細胞數量的影響。圖A表示皮層；圖B表示海馬；圖C表示胼胝體；圖D表示視束。所有數值以均數±標準誤表示("=4)。##P<0.01與假手術(sham)組比較；*屍<0.05，**_P<0.01與溶劑對照組(vehicle)比較(LSD檢驗)。圖13.口服d-PHPB對永久性結紮雙側頸總動脈大鼠皮層腦源性神經生長因子(BDNF)分布和含量的影響(免疫組化染色)。Sham:假手術組；Vehicle:溶劑對照組。200倍。圖14.口服W-PHPB對永久性結紮雙側頸總動脈大鼠海馬CA1區腦源性神經生長因子(BDNF)分布和含量的影響(免疫組化染色)。A:假手術組；B:溶劑對照組；C:PHPB39mg/kg組。200倍。圖15.口服W-PHPB對永久性結紮雙側頸總動脈大鼠海馬CA2區腦源性神經生長因子(BDNF)分布和含量的影響(免疫組化染色)。A:假手術組；B:溶劑對照組；C:PHPB39mg/kg組。200倍。圖16.口服W-PHPB對永久性結紮雙側頸總動脈大鼠海馬CA3區腦源性神經生長因子(BDNF)分布和含量的影響(免疫組化染色)。A:假手術組；B:溶劑對照組；C:PHPB39mg/kg組。200倍。圖17.口服^-1^8對永久性結紮雙側頸總動脈大鼠腦組織腦源性神經生長因子(BDNF)含量的影響。所有數值以均數±標準誤表示("=4)。#屍<0.05與假手術(sham)組比較；*屍<0.05，**屍<0.01與溶劑對照組(vehicle)比較(LSD檢驗)。圖18.口服W-PHPB對AP(25.35)誘導的痴呆大鼠在水迷宮定位航行實驗中潛伏期的影響。所有數值以均數±標準誤表示("=7-9)。#屍<0.05與假手術(sham)組比較；*屍<0.05,**P<0.01與溶劑對照組(vehicle)比較(LSD檢驗)。圖19.口服W-PHPB對AP(25.35)誘導的痴呆大鼠在水迷宮平臺探索實驗中空間位置記憶障礙的影響。圖A表示目標象限活動時間百分比的改變；圖B表示第一次穿越平臺時間的改變。所有數值以均數±標準誤表示^=7-9)。#屍<0.05與假手術(sham)組比較；*屍<0.05與溶劑對照組(vehicle)比較(LSD檢驗)。圖20.口服W-PHPB對Ae(25.35)誘導的痴呆大鼠腦組織生化的影響。圖A表示皮層超氧化物歧化酶(SOD)活力的改變；圖B表示皮層丙二醛(MDA)含量的改變；圖C表示皮層膽鹼乙醯基轉移酶(ChAT)活力的改變。所有數值以均數士標準誤表示("=7-9)。#屍<0.05與假手術(sham)組比較；*P<0.05,**P<0.01與溶劑對照組(vehicle)比較(LSD檢驗)。圖21.口服W-PHPB對SAMP8小鼠在跳臺實驗中遭受的電擊次數和電擊潛伏期的影響。圖A表示電擊次數的改變；圖B表示電擊潛伏期的改變。所有數值以均數±標準誤表示("=11-14)。*屍<0.05,**屍<0.01,***P<0.001與對照組(control)比較(Du皿ett檢驗)。圖22.口服W-PHPB對SAMP8小鼠在水迷路實驗中進入盲端的錯誤次數和找到安全臺階潛伏期的影響。圖A表示進入盲端錯誤次數的改變；圖B表示潛伏期的改變。所有數值以均數±標準誤表示("=11-14)。*屍<0.05,**屍<0.01與對照組(control)比較(Dunnett檢驗)。圖23.口服WHPB對SAMP8小鼠腦組織超氧化物歧化酶活力(SOD)活力和丙二醛(MDA)含量的影響。圖A表示海馬SOD活力的改變；圖B表示海馬MDA含量的改變。所有數值以均數±標準誤表示0=11-14)。*屍<0.05與對照組(control)比較(LSD檢驗)。圖24.口服^-PHPB對SAMP8小鼠腦組織膽鹼乙醯基轉移酶(ChAT)和膽鹼酯酶(AChE)以及皮層線粒體三磷酸腺苷酶(ATPase)活力的影響。圖A表示海馬ChAT活力的變化；圖B表示海馬AChE活力的變化；圖C表示皮層線粒體ATPase活力的變化。所有數值以均數±標準誤表示("=11-14)。*P<0.05與對照組(control)比較(LSD檢驗)。.圖25，實施例1的試驗進程。21圖26，實施例2的試驗進程。圖27，實施例3的試驗進程。'具體實施例方式下述實施例具體顯示本發明的應用。但本實施例不限定本發明的使用範圍。實施例1、慢性腦缺血模型研究dl-PHPB能改善腦供血不足大鼠的近記憶和空間定向功能障礙材料和方法1.試劑和藥品.W-PHPB由本所合成室提供，化學純度為98.5%(HPLC法測定)，用蒸鎦水配製。吡拉西坦片，天津金世製藥有限公司生產。超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒，丙二醛(MDA)試劑盒，膽鹼乙醯基轉移酶(ChAT)試劑盒，考馬斯亮蘭蛋白測定試劑盒均購自南京建成生物工程研究所。中性紅、牢固藍購自Sigma公司。碳酸鋰由北京化學試劑公司生產。TritonX-100購自北京中山生物技術有限公司。膠質纖維酸性蛋白(GFAP)多克隆抗體購自Chemicon公司。腦源性神經生長因子(BDNF)多克隆抗體購自SantaCruzBiotechnology公司。二抗，生物素化抗小鼠/兔IgG;三抗，辣根酶標記鏈黴卵白素；DAB顯色試劑盒；抗體稀釋液，均購自北京中杉金橋生物技術有限公司。.2.儀器Morris水迷宮自動監控儀由中國醫學科學院藥物研究所研製。MQX200型酶標儀為美國BioTeklnstruments產品。IR2135型石蠟切片機為德國Leica公司產品。620-E型恆溫冷凍切片機為英國Shandon公司產品。NikonECLIPSE80i自動顯微照相系統為日本NikonCorportion生產。3.2-VO模型建立釆用永久性結紮大鼠雙側頸總動脈造成持續性腦低灌注模型。用10%的水合氯醛腹腔注射(i.p.)麻醉大鼠G50mg/kg)，仰臥位固定於手術臺上，體溫維持在36.5±0.5°C。用碘伏消毒手術野，沿頸正中線縱向切開皮膚及皮下組織，分離左右兩側頸總動脈，用5-0手術絲線結紮。縫合切口，將動物放回籠中。術後連續三日，每日i.p.青黴素20萬單位/只。4.實驗分組及設計大鼠隨機分成6組，每組20隻。(l)假手術組除不結紮雙側頸總動脈外，其餘操作與低灌注組完全相同；(2)溶劑對照組口服蒸餾水；(3)吡拉西坦600mg/kg組；(4)d-PHPB13mg/kg組；(5)t//-PHPB39mg/kg組；(6)d/-PHPB129mg/kg組。術後第10天開始灌服藥物或溶劑。每天1次，連續21天，第25-30天用Morris水迷宮法測定大鼠的空間學習記憶能力。行為學實驗均在給藥後40min進行。動物在第30天處死，進行腦組織生化測定及病理學檢査。組間比較實驗結果。(試驗進程見圖25)5.水迷宮實驗Morris水迷宮主要由一金屬圓柱形水池(池高60cm，直徑120cm)和自動顯示、監測、記錄裝置及安全島(直徑10cra的平臺)組成。預先將池壁及平臺用黑色自帶膠塑料紙粘貼為黑色，使池水顯示為黑色，'水面高出平臺15翻，這樣動物不能通過聽、視和嗅覺到達平臺，以便檢測動物對空間位置的記憶能力。水溫保持在25士rc，水池分為4個象限(東北、東南、西北、西南)，平臺置於西北象限的中心。每隻大鼠的遊泳活動通過監視儀進行監測並記錄，直接連於計算機進行處理分析。定位航行實驗連續進行5天。每隻大鼠1天接受2次訓練尋找平臺，兩次分別從東南和西南象限的中點，頭朝向池壁入水，兩次訓練間隔10分鐘。記錄找到平臺的時間(潛伏期)、搜索策略和遊泳速度3項指標，並將每日的2次實驗結果進行平均(搜索策略除外)。如果大鼠在60秒內未找到平臺，則潛伏期以60秒計算。無論在60秒內找到平臺與否，大鼠都在平臺上停留10秒。第一次實驗開始前將大鼠放在平臺上適應10秒。隨著訓練次數的增加，各組大鼠尋找安全島的潛伏期逐漸縮短。實驗結果以遊泳速度反映大鼠在實驗期間體能的變化，以其餘2項指標反映大鼠對空間位置的學習和記憶能力。最後一次訓練結束後進行空間探索實驗。移去平臺，讓大鼠自由遊泳60秒尋找平臺，記錄大鼠在每個象限花費的時間及第一次穿越目標的時間。如大鼠在原來平臺所在象限停留的時間長、第一次穿越目標的時間短，則提示大鼠巳經對這個空間目標產生記憶。將搜索策略分為4類(1)邊緣式，大鼠始終沿水池邊緣運動，無尋找動機；(2)隨機式，大鼠搜索安全島時無明確方向；(3)趨向式，大鼠已記得安全島的大概位置，在發現安全島前轉彎少於4次；(4)直線式，大鼠已明確記得安全島的位置，直接遊向安全島。.6.SOD、MDA和ChAT的檢測行為學實驗結束後，將大鼠斷頭取腦，在冰浴上剝離出皮層和海馬組織，用濾紙吸乾後稱重，按重量體積比l:9加入4t:預冷的生理鹽水，用內切式勻漿機製備10%的組織勻漿，然後低溫低速離心10分鐘，取上清棄沉澱。考馬斯亮蘭法定蛋白以及SOD、MDA、ChAT的測定均按照南京建成生物工程研究所的試劑盒說明書進行。7.病理學和免疫組織化學檢測每組隨機選取4隻動物，行為學實驗後，用10%水合氯醛麻醉，依次剪開皮膚、胸腔，充分暴露心臟，剪開心包膜，以7號灌注針朝主動脈方向從心尖插入，快速輸注生理鹽水，同時於右心耳處剪開右心房，灌注15-20min(200-300ml)，至流出液變清，換以預冷的4%多聚甲醛_3%蔗糖灌注固定液繼續灌注15-20min(150-200ml)，先快後慢，至動物全身僵硬，肝臟發白為止，然後斷頭取腦，用刀片切去前部端腦和後部小腦，放入4%多聚甲醛-3(m蔗糖後固定液繼續固定48h，至標本完全下沉後，更換新鮮後固定液，4'C冷藏。一側大腦半球進行石蠟切片，固定、包埋，在海馬部位進行冠狀切片(厚度5pm)，用做HE和K-B染色。另一側大腦半球用恆溫冷凍切片機進行冰凍切片，切片部位、方式同前，0CT包埋，厚度40ym，每隻動物切4張，以備GFAP和BDNF免疫組化染色用。8.統計分析所有結果採用均數士標準誤表示。水迷宮定位航行實驗中各項指標的差異比較採用重複測定的雙因素方差分析(two-wayANOVA)。水迷宮空間探索實驗、生化測定各項指標以及免疫組化的半定量分析均採用單因素方差分析(one-wayANOVA)。組間差異則採用;^rf/wcLSD(水迷宮定位航行實驗搜索策略的比較採用Ridit分析)。代0.05為有顯著性差異。結果1.^/^1^8對腦低灌注大鼠學習記憶的改善作用Morris水迷宮實驗是檢測動物空間學習和近記憶能力的經典實驗。本研究在大鼠慢性腦缺血後近l個月進行。實驗分兩部分，一是定位航行實驗，二是空間探索實驗。在定位航行實驗中觀察了3項指標，包括大鼠找到平臺的時間(潛伏期)、搜索策略及遊泳速度。從潛伏期看，隨著訓練次數的增加，各處理組大鼠的潛伏期均逐漸縮短，表明各組大鼠對平臺位置的記憶越來越準確。從第二天開始，溶劑對照組大鼠的潛伏期就明顯長於假手術組，而且它們之間的差距在逐漸增加(代0.05或代0.01)，表明慢性腦低灌注對大鼠的學習記憶能力造成了明顯的損害，說明模型是成功的。可以看到，前三天各給藥組的潛伏期與溶劑對照組比較沒有明顯的縮短，在第四天，fl7-PHPB129mg/kg組和吡拉西坦600mg/kg組的潛伏期明顯短於溶劑對照組(代0.05)，第五天，o7-raPB39和129mg/kg組的潛伏期亦明顯短於溶劑對照組(代O.05)，說明c//-HffB39、129mg/kg、吡拉西坦600mg/kg均對慢性腦低灌注大鼠的學習記憶能力減退有較為明顯的改善作用，而c//-PHPB13mg/kg沒有明顯的治療作用(圖l)。因此，從潛伏期來看，o7-PHra39、129mg/kg、吡拉西坦600mg/kg均可明顯改善腦低灌注大鼠的空間學習和近記憶缺陷。以大鼠搜索平臺的策略分析，隨著訓練次數的增加，動物採取邊緣式、隨機式策略的次數逐漸減少，而採用趨向式、直線式策略的次數則逐漸增加。以等級資料序值法分析，可見，最後一天測試時，W-PHPB39mg/kg與溶劑對照組比較有非常顯著的差異(代O.Ol)，亦即前者採取直線式、趨向式策略的次數明顯多於後者，其它各藥各劑量採取直線式、趨向式策略的次數有多於溶劑對照組的趨勢，但無統計學意義。說明raPB39mg/kg可以提高腦低灌注大鼠對空間位置的記憶能力(圖2、表1和2)。同時，在定位航行實驗中，測定了大鼠的遊泳速度，以判斷該實驗對大鼠的體能是否有影響。結果發現，在整個實驗過程中，各組大鼠的遊泳速度均無明顯變化，組間比較也無明顯差異(數據未列出)。說明，一方面，本模型製作方法對大鼠的活動能力無影響，另一方面，水迷宮實驗對大鼠的活動能力也無影響。因此，該實驗方法可很好地檢測大鼠的學習記憶能力而不受體能的幹擾。在定位航行實驗結束後，進行平臺探索實驗，將安全島(平臺)撤去，記錄大鼠在目標象限活動的時間和第一次穿越目標時間，以測試大鼠是否已形成對安全島的空間記憶以及記憶的牢固程度。結果顯示，假手術組大鼠在目標象限的活動時間明顯長於溶劑對照組(代O.Ol)，除W-raPB129mg/kg外，各給藥組大鼠在目標象限的活動時間也明顯長於溶劑對照組，尤其是o7-raPB39mg/kg組大鼠(代O.OOl)(圖3A)。從第一次穿越目標時間來看，假手術組明顯短於溶劑對照組(代O.Ol)，PHPB39mg/kg組也顯著短於溶劑對照組(代0.05)。表明c/7-PHPB可改善慢性腦低灌注大鼠的空間學習記憶缺陷，尤以W-raPB39mg/kg最為顯著(圖3B)。綜上所述，從水迷宮定位航行實驗的兩項主要指標(潛伏期和搜索策略)以及平臺探索實驗的目標象限時間來看，W-raPB13、39、129mg/kg三個劑量均可改善慢性腦低灌注大鼠的空間學習和近記憶缺陷，作用強度以W-raPB39mg/kg最強，W-raPB129mg/kg次之，t/7-PHPB13mg/kg組最弱，同時，t/7-PHPB129mg/kg與5倍劑量的吡拉西坦比較也無明顯差異。表1.rf/-PHPB對永久性結紮雙側頸總動脈大鼠在水迷宮定位航行實驗中搜索策略的影響tableseeoriginaldocumentpage26表2.說-PHPB對永久性結紮雙側頸總動脈大鼠在水迷宮定位航行實驗中搜索策略的影響tableseeoriginaldocumentpage26表1和2.口服d-PHPB對永久性結紮雙側頸總動脈大鼠在水迷宮定位航行實驗中搜索策略的影響。數據以搜索策略的次數表示("=17-20)。*屍<0.05，##屍<0.01與假手術組比較；*<0.01與溶劑對照組比較(Ridit分析)。M:邊緣式;R:隨機式;T:趨向式；L:直線式。2.<//118對腦組織800活力、MDA含量和ChAT活力的影響SOD是體內主要的抗氧化酶之一，可有效清除氧自由基，減輕過氧化損害。MDA是主要的過氧化產物之一。SOD活力可以反映腦組織的抗氧化水平，而MDA反映腦組織脂質過氧化的情況。大鼠慢性腦缺血l個月後，皮層SOD活力明顯升高，溶劑對照組SOD活力為77.39±8.70U/mg蛋白，明顯高於假手術組35.03±5.20U/mg蛋白(代O.001)，給藥治療21天後，PHPB13和39mg/kg組的SOD活力分別為53.92±4.32、48.86±8.97U/mg蛋白，均顯著低於溶劑對照組(代O.05)，吡拉西坦600mg/kg組51.83±8.88U/mg蛋白也顯著低於溶劑對照組(代0.05)，而c//-raPB129mg/kg對該酶活力的影響無顯著性意義(圖4A)。在海馬，慢性腦缺血沒有造成SOD活力的下降或升高，各藥各劑量也未明顯影響該酶活力(數據未列出)。大鼠慢性腦低灌注後1個月，皮層MDA含量顯著升高(假手術組0.69±0.06nmol/mg蛋白，溶劑對照組1.31±0.22nmol/mg蛋白，代O.OOl)。給藥3周後，t/7-PHPB13、39、129mg/kg組的MDA含量分別為0.60±0.06、0.77±0.10、0.67±0.07nmol/mg蛋白，顯著低於溶劑對照組(代O.Ol或代O.OOl)。吡拉西坦600mg/kg則對其無明顯影響(圖4B)。在海馬，慢性腦缺血沒有引起MDA含量的變化，各藥各劑量也未對其產生影響(數據未列出)。乙醯膽鹼是中樞神經系統的主要神經遞質之一，介導膽鹼能神經的信號傳遞，與學習記憶有密切關係，而ChAT是乙醯膽鹼的合成酶，其活力可間接反映腦內乙醯膽鹼的含量，反映膽鹼能神經功能的狀況。大鼠永久性結紮雙側頸總動脈1個月後，海馬ChAT活力下降趨勢明顯，與假手組比較，下降了24%。在給藥21天後，W-PHPB129mg/kg能顯著提高低灌注大鼠海馬的ChAT活力(代O.05)，^-PHPB39mg/kg、吡拉西坦600mg/kg也有升高的趨勢。而c/Z-PHTO13mg/kg未表現出明顯的效果(圖4C)。在皮層，慢性腦缺血對ChAT活力無明顯影響，各藥各劑量對其影響與溶劑對照組比較也無顯著性差異(數據未列出)。綜上所述，W-PHPB可降低慢性腦低灌柱大鼠皮層的SOD活力。對皮層MDA含量的升高也有很強的降低作用。這些作用以^-PHPB39和129mg/kg較強。表明該藥可糾正慢性腦低灌注大鼠腦組織代償性異常增高的抗氧化酶活力，減少脂質過氧化產物，恢復腦組織正常的氧化-抗氧化動態平衡。另外，PHPB39、129mg/kg很有可能提高慢性腦低灌注大鼠海馬ChAT活力，改善膽鹼能神經功能。3.<//41^8對腦低灌注大鼠腦組織病理的影響(1)HE染色HE染色以不同顏色顯示細胞質和細胞核，可以清楚地看到細胞的大體形態。本研究中溶劑對照組可見皮層神經元皺縮，深染，核不清晰，海馬CA1、CA3區也出現類似變化，但程度較輕，海馬CA2區則無明顯改變。W-PHPB39mg/kg可明顯改善皮層、海馬CA1和CA3區的神經元形態異常；W-PHPB129mg/kg可改善皮層及海馬CA1區的神經元形態異常；而d-PHPB13mg/kg僅可輕微改善皮層的神經元形態異常(圖5-7)。以上表明，d-PHPB對慢性腦低灌注引起的皮層、海馬神經元損傷有保護和治療作用。(2)K-B染色K-B染色可反映神經元髓鞘是否完整，進而反映神經纖維的形態學變化。本實驗發現，溶劑對照組大鼠胼胝體和視束出現明顯的空泡化及神經纖維紊亂。d-PHPB三個劑量對胼胝體的病理改變有明顯的改善作用，空泡化減少，神經纖維排列有所恢復，其中W-PHPB39mg/kg作用最強，必PHPB129mg/kg次之，W-PHPB13mg/kg作用最弱(圖8)。W-PHPB三個劑量對視束的病理改變也有一定的改善作用，其中以d-PHPB39mg/kg作用較強(圖9)。以上結果表明，d-PHPB對腦低灌注造成的胼胝體和視束損傷有較為明顯的保護作用。4.說-PHPB對低灌注大鼠腦組織GFAP陽性星形膠質細胞的影響腦低灌注引起的組織學異常可能是空間學習記憶損傷的基礎。其中白質最早受損，同時伴隨反應性星形細胞增加和小膠質細胞活化。膠質細胞酸性蛋白(GFAP)免疫組化染色可用於標記活化的星形膠質細胞。在每張切片上選取相同的區域，每個區域拍攝2-3張照片，記錄每張照片固定大小視野中星形膠質細胞的數量，計算平均值作為該區域的值。選取四個區域作為觀察對象皮層、海馬、胼胝體和視束。結果可見，在皮層，溶劑對照組的GFAP陽性細胞數(16.9±6.9)有明顯多於假手術組(9.9±2.0)的趨勢，但由於標準誤過大而沒有統計學意義，而d-PHPB三個劑量組以及吡拉西坦600mg/kg組在給藥21天後，GFAP陽性細胞數均明顯少於溶劑對照組，尤其是d-PHPB39mg/kg組作用最明顯(PO.01)(圖12A)。在海馬，溶劑對照組的GFAP陽性細胞數(26.8±5.5)明顯多於假手術組(12.0±3.0，戶O.Ol)，各給藥組的該指標值也明顯小於溶劑對照組(屍<0.05或屍O.Ol)，尤以d-PHPB39、129mg/kg組最顯著(圖10和12B)。在胼胝體，雖然溶劑對照組的GFAP陽性細胞數與假手術組比較無顯著差異，但W-PHPB39mg/kg組的該指標值還是小於溶劑對照組(PO.05)(圖12C)。在視束，溶劑對照組的GFAP陽性細胞數(4.4±0.7)明顯多於假手術組(0.8±0.3，PO.Ol)。d-PHPB39、129mg/kg以及吡拉西坦600mg/kg給予動物21天後，GFAP陽性細胞數明顯少於溶劑對照組(屍O.05或PO.01)(圖11和12D)。以上說明，W-PHPB可明顯減輕慢性腦低灌注大鼠腦組織損傷，減少活化的星形膠質細胞數量，尤其在海馬、視束和皮層，且多以！？1^83911^/]^作用最強，J/-PHPB129mg/kg次之，^-PHPB13mg/kg最弱。5.<//-PHPB對腦低灌注大鼠腦組織BDNF分布面積和含量的影響腦源性神經生長因子(BDNF)可維持神經元的生存和發育，存在於正常動物的腦組織，也可在缺血早期高表達，但在缺血24h後一般表達下降。從BDNF免層和海馬，溶劑對照組與假手術組沒有明顯的差異，給藥組與溶劑對照組也無明顯差異(數據未列出)。但從染色密度看，溶劑對照組與假手術組比較，無論在皮層或是海馬，BDNF均顯著減少，給藥組與溶劑對照組比較，在皮層，W-PHPB三個劑量均可增加BDNF的表達，其中d-PHPB39mg/kg作用最強，^-PHPB129mg/kg次之，c^-PHPB13mg/kg作用最弱(圖13和17);在海馬CA1、CA2、CA3區，W-PHPB39mg/kg可顯著增加BDNF的表達(PO.05或PO.Ol)，d-PHPB129mg/kg則僅有增.加BDNF的趨勢，沒有統計學意義(圖14-17)。由於染色密度與BDNF的含量成正比，而染色面積在一定範圍內並不考慮染色的深淺，因此，可以認為，染色密度比染色面積能更準確的反映BDNF的含量。以上結果表明，d-PHPB可增加慢性腦缺血腦組織中BDNF的含量。實施例2、在P-澱粉樣肽痴呆模型上的研究dl-PHPB能明顯改善e-澱粉樣肽(25-35)引起的大鼠記憶和空間定向力障礙材料和方法1.試劑和藥品W-PHPB由本所合成室提供，用PBS酉己制。八{3(25.35)購自Sigma公司。超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒，丙二醛(MDA)試劑盒，膽鹼乙醯基轉移酶(ChAT)試劑盒，以及考馬斯亮蘭蛋白測定試劑盒均購自南京建成生物工程研究所。2.儀器Morris水迷宮自動監控儀以及酶標儀同前。3.模型建立雄性Wistar大鼠，IO月齡，體重600克左右，每籠放置2隻動物，室溫保持在23土rC，自由進食和引水。用戊巴比妥鈉麻醉(45mg/kg)大鼠，將其腹臥位固定於立體定位儀上，剪開頭頂部的皮膚，暴露頂骨，根據Paxions和Watson大鼠腦立體定位圖譜，用牙科鑽在前囟後1.2mm,中線右側1.5mm處鑽破顱骨和硬腦膜，用微量注射器垂直插入4.0mm深處，緩慢注入15nmo1(容積為5ul)聚集態的Ae(25-35)。對照組僅注入5u1溶劑PBS。術後每日腹腔注射青黴素20萬單位，連續4天。4.實驗分組及設計大鼠隨機分成4組，每組10隻。假手術組腦室僅注入溶劑PBS;模型組、d-PHPB39和129mg/kg組腦室注入AP(25.35)+溶劑。術後第1天開始灌服藥物(假手術和模型組灌服蒸餾水)。水迷宮定位航行試驗在術後第9-12天進行，第13天進行平臺探索試驗。動物在第14天給藥後40分鐘處死，斷頭取腦進行生化測定。行為學實驗均在實驗前40分鐘給藥。(試驗進程見圖26)5.水迷宮實驗自i.c.v.Ae(25-35)後第9-12天進行水迷宮定位航行試驗，方法同前；第13天進行平臺探索試驗，移去平臺，大鼠自由遊泳30秒尋找平臺，記錄大鼠在每個象限花費的時間及第一次穿越目標的時間，並計算目標象限活動時間百分比。如大鼠在目標象限活動時間百分比大、第一次穿越目標的時間短，則提示大鼠已經對這個空間目標產生記憶。6.SOD活力、MDA含量和ChAT活力的檢測方法同前。7.統計分析所有結果採用均數土標準誤表示。水迷宮定位航行實驗中各組的潛伏期差異比較採用重複測定的雙因素方差分析(two-wayANOVA)。組間差異採用poW/ocLSD檢驗。水迷宮平臺探索試驗、生化測定採用單因素方差分析(one-wayANOVA)。屍O.05為有顯著性差異。'結果i.w-raPB對痴呆大鼠學習記憶的改善作用定位航行實驗，在4天的訓練中，各組的潛伏期逐漸縮短，說明各組大鼠對安全臺的位置記憶越來越強。第1天，各組間沒有顯著性差異，但溶劑對照組的潛伏期有長於假手術組的趨勢。第2天，d-PHPB39mg/kg組的潛伏期有短於溶劑對照組的趨勢。第3-4天，溶劑對照組的潛伏期明顯長於假手術組(P<0.05)，^-PHPB129mg/kg組明顯短於溶劑對照組(PO.05或PO.01)，39mg/kg組的潛伏期也有短於溶劑對照組的趨勢。說明，經過兩周的治療，W-PHPB能劑量依賴性地縮短八0(25.35)誘導的痴呆大鼠的潛伏期。也即WHPB能劑量依賴性地改善痴呆大鼠的學習記憶能力(圖18)。在4天的訓練中，各組大鼠的遊泳速度無顯著性差別(數據未列出)，說明i.c.v.Ae(25-均不影響動物的體能，水迷宮實驗能可靠反映動物的學習記憶能力。平臺探索實驗中，溶劑對照組的目標象限活動時間百分比(21.6±1.6%)明顯少於假手術組(32.8±4.0%，P<0.05)，而d-PHPB129mg/kg組(30.2±2.5%)明顯長於溶劑對照組(屍8可劑量依賴性地增加痴呆大鼠在目標象限活動時間的百分比。從第一次穿越平臺時間來看，溶劑對照組有長於假手術組的趨勢。與溶劑對照組比較，"Z-PHPB也有縮短第一次穿越平臺時間的趨勢，如增加實驗例數，可能會有顯著性意義(圖19B)。總之，W-PHPB可劑量依賴性地改善AP(25-35)誘導的痴呆大鼠的近記憶和空間位置學習記憶障礙。2.W-PHPB對痴呆大鼠腦組織SOD活力、MDA含量和ChAT活力的影響SOD是體內主要的抗氧化酶之一，可有效清除氧自由基，減輕過氧化損害。MDA是主要的過氧化產物之一。SOD活力可以反映腦組織的抗氧化水平，而MDA反映腦組織脂質過氧化的情況。實驗中，假手術組皮層組織中SOD的活力為216.9士14.5U/mg蛋白，i.c.v.AP(25-35)後14天，SOD的活力代償性升高了32%，達到286.8±18.3U/mg蛋白，有顯著性差異(屍<0.05)，而口服給予W-PHPB39和129mg/kg兩周後，皮層SOD活力分別降至238.2±32.7和185.2±21.6U/mg蛋白，後者與溶劑對照組比較有明顯的差異(屍O.Ol)。說明W-PHPB可劑量依賴性地降低皮層SOD活力(圖20A)。在海馬，A3(25-35)未引起SOD活力的顯著變化，d-PHPB也未引起SOD活力的顯著改變。在皮層，溶劑對照組的MDA含量(5.43土0.55nmol/mg蛋白)顯著高於假手術組(3.69±0.52nmol/mg蛋白)(屍<0.05)。連續口服d-PHPB39和129mg/kg兩周後，皮層MDA含量分別降至3.62±0.21和3.28±0.25nmol/mg蛋白，與溶劑對照組比較均具有顯著性差異(屍<0.05和屍<0.01)。由此說明，^-PHPB可劑量依賴性的降低Ae(25-35)誘導的大鼠皮層MDA含量增高(圖20B)。乙醯膽鹼是中樞神經系統的主要神經遞質之一，介導膽鹼能神經的信號傳遞，與學習記憶有密切關係，而ChAT是乙醯膽鹼的合成酶，其活力可間接反映腦內乙醯膽鹼的含量，反映膽鹼能神經功能的狀況。大鼠i.C.V.AP(25-35)後，皮層ChAT活力未見明顯改變，但口服給予c7-raPB兩周後，與溶劑對照組比較，39mg/kg可顯著增加ChAT活力(代0.05)，129mg/kg也有很強的增高該酶活力的趨勢。說明，Ae(25-35)雖然未造成皮層ChAT活力的下降，但c/7-PHPB仍有可能增加痴呆大鼠的ChAT活力(圖20C)。綜上所述，W-PHPB可劑量依賴性地降低AP(25-35)誘導的痴呆大鼠皮層的SOD活力和MDA含量。表明該藥可糾正Ae(25-35)誘導的痴呆大鼠皮層代償性異常增高的抗氧化酶活力，減少脂質過氧化產物，恢復腦組織正常的氧化與抗氧化動態平衡。另外，W-raPB很有可能提高痴呆大鼠皮層ChAT活力，改善膽鹼能神經功能。而對正常大鼠皮層ChAT活力是否有影響尚待進一步研究。實施例3在快速老化小鼠模型上的研究:dl-PHPB對快速老化小鼠學習記憶缺陷的改善作用材料和方法1.試劑和藥品iPHPB由本所合成室提供，化學純度98.5%(HPLC法測定)，蒸餾水配製。超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒，丙二醛(MDA)試劑盒，膽鹼乙醯基轉移酶(ChAT)試劑盒，三磷酸腺苷酶(ATPase)試劑盒，考馬斯亮蘭蛋白測定試劑盒均購自南京建成生物工程研究所。2.儀器STT-2型跳臺儀及水迷路由中國醫學科學院藥物研究所研製。MQX200型酶標儀為美國BioTekInstruments產品。3.動物10月齡SAMP8，雄性，SPF級，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司。4.實驗分組及設計動物適應l周后，進行行為學實驗，按實驗結果均勻分三組對照組、d-PHPB50mg/kg和W-PHPB160mg/kg組(分別相當於大鼠的39和129mg/kg)，灌胃給予蒸餾水或藥物，每日1次，連續35日，給藥後第31-35日進行跳臺及水迷路實驗，第36日每組隨機取8-10隻動物，斷頭取腦，分離皮層和海馬，進行生化測定，指標包括SOD、MDA、ChAT、AChE、線粒體ATPase。(試驗進程見圖27)5.跳臺實驗'跳臺儀是一方形電擊裝置，分5間，每間底部為可帶36伏交流電的鐵柵欄，在底部一角放置一個電絕緣的直徑約3cm的圓形橡膠平臺，動物可站於其上躲避電擊，四周為塑料板，其中朝向觀察者一面是透明的，其餘三面是黑色不透明的，頂部開放供取放動物用。將小鼠放入跳臺儀的一間，適應3分鐘後，打開電源，電擊小鼠，觀察5分鐘，記錄每隻小鼠遭受電擊的次數。24小時後，打開跳臺電源，將小鼠小心置放於安全臺上，記錄小鼠第一次跳下安全臺的潛伏期及3分鐘內遭受電擊的次數，以此判斷小鼠的被動迴避反應能力。6.水迷路實驗水迷路裝置是一個黑色不透明的方形塑料盒(80cmX50cmX20cm)，其中有四個盲端和一個終點臺階，小鼠可沿此臺階爬出水面。另有一塊15cmX20cm大小的黑色塑料板，可供放於不同位置設置不同的起點，不同的起點含有的盲端數不同。實驗時裝置盛水，水深12cm，水溫25士rC。可將小鼠置於不同的起點，使其經歷含不同盲端數的曲折路線到達終點，爬出水面。通過測定小鼠進入盲端的錯誤次數和到達終點所花費的時間，判斷其近記憶和空間學習記憶能力。每次實驗時，先將小鼠放在終點臺階上適應5秒，然後將其頭部朝向起點的盲端壁，放入水中，記錄其進入盲端的錯誤次數和找到安全臺階花費的時間，即逃避潛伏期，總時間限定3分鐘，如在3分鐘內未找到臺階，則由實驗人員將其引導至終點，潛伏期按3分鐘計。訓練4次，分別經由含2、3、4、4個盲端的路線進行。測試1次，含4個盲端，同樣記錄小鼠進入盲端的錯誤次數和找到臺階的時間。7.腦組織SOD、MDA、ChAT、AChE和ATPase的檢測皮層和海馬SOD、MDA、ChAT和AChE的觀〗定方法同前。另取一部分皮層組織，製備組織勻槳，採用梯度離心法提取線粒體，並用超聲法破碎，然後測定其總ATPase活力。測定方法亦按照試劑盒說明書進行。8.統計分析所有結果採用均數土標準誤表示。水迷路實驗指標的差異採用重複測定的雙因素方差分析(two-wayANOVA)，其它各項指標的差異採用單因素方差分析(one-wayANOVA)。組間差異採用jmrt/zocDunnett或LSD檢驗。結果1.W-PHPB對SAMP8學習記憶缺陷的改善作用跳臺實驗是測試動物被動迴避反應能力的經典實驗之一。通過測定動物遭受的電擊次數和遭電擊的潛伏期判定動物的被動迴避反應能力。在第一天的訓練中，PHPB50和160mg/kg組SAMP8遭受的電擊次數(5.8±0.5，4.9±0.5)明顯少於對照組SAMP8(8.3±0.6)，經Dunnett檢驗，.有顯著性差異(代O.Ol和代O.001),並有一定的劑量依賴性。第二天測試中，兩個給藥組SAMP8遭受的電擊次數(3.4±0.3，2.1±0.3)亦明顯少於對照組(4.6±0.3)(代O.05和代0.01);且兩個給藥組第一次跳下安全臺的潛伏期(5.5±0.8，10.2±2.4)明顯長於對照組(O.7±0.2)(代O.Ol)，並有劑量依賴關係(圖21)。以上說明，W-raPB50和160mg/kg長期給藥均可提高SAMP8小鼠的被動迴避反應能力，並有劑量依賴關係，亦即t/7-PHPB可明顯改善其學習能力和記憶保持能力。水迷路實驗常用於測試動物的近記憶和空間學習記憶能力。通過測定動物進入盲端的錯誤次數和找到臺階的潛伏期反映其學習記憶能力。本實驗中，第一、二次採用的盲端總數分別為2禾B3個，第三到五次則為4個。在前三次訓練中，給藥組SAMP8進入盲端的錯誤次數與對照組比較沒有顯著差別；第三到第五次測試中，給藥組動物進入盲端的錯誤次數均逐漸減少，表明動物對臺階位置的記憶逐漸增強，而對照組進入盲端的錯誤次數無明顯改變。兩個給藥組在第四次測試中進入盲端的錯誤次數有少於對照組的趨勢。在第五次測試中，兩個給藥組的錯誤次數(分別為3.1±0.9和2.7±0.3)則明顯少於對照組(6.1±1.1)(代O.05)。第一、二次訓練中，各組動物找到臺階的潛伏期沒有明顯差別。第三次訓練中，兩個給藥組的潛伏期有短於對照組的趨勢。以後，隨著訓練次數的增加，各組找到臺階的潛伏期均逐漸縮短。第四次訓練中，raPB50mg/kg組的潛伏期有短於對照組的趨勢，而W-raPB160mg/kg組的潛伏期則明顯短於對照組(代0.05)。最後一次測試中，兩個劑量組的潛伏期均明顯鈕於對照組(代0.01)(圖22)。表明，PHPB可明顯改善SAMP8的近記憶和空間學習記憶缺陷。綜上所述，W-raPB50和160mg/kg均可顯著改善SAMP8小鼠的學習記憶能力，並有一定的劑量依賴性。2.說-PHPB對腦組織SOD活力和MDA含量的影響S0D是體內主要的抗氧化酶之一，可有效清除氧自由基，減輕過氧化損害。MDA是主要的過氧化產物之一。SOD活力可以反映腦組織的抗氧化水平，而MDA反映腦組織脂質過氧化的情況。實驗中，對照組海馬組織SOD的活力為279.4±65.7U/mg蛋白，W-PHPB50和160mg/kg連續口服35天後，SOD活力分別下降到156.2±7.8和158.7±11.4U/mg蛋白，均與對照組有顯著性差異(屍<0.05)。說明t/Z-PHPB可降低海馬SOD活力(圖23A)。在皮層，W-PHPB兩個劑量均未引起SOD活力的顯著變化(數據未列出)。給藥35天後，d-PHPB50和160mg/k'g組海馬MDA含量分別為1.23±0.05和1.26±0.09nmol/mg蛋白，與對照組(1.90±0.50nmol/mg蛋白)比較，分別降低了35.3%和33.7%，有較明顯的降低趨勢，但無統計學意義(圖23B)。說明W-PHPB有可能降低海馬的MDA含量。在皮層，各組MDA含量無顯著差異(數據未列出)。以上說明，J/-PHPB可糾正SAMP8小鼠海馬組織代償性異常增高的抗氧化酶活力，也可能減少脂質過氧化產物，進而恢復腦組織正常的氧化-抗氧化動態平衡，減輕氧化應激損傷。3.<//-PHPB對腦組織ChAT和AChE活力以及皮層線粒體ATP酶活力的影響乙醯膽鹼是中樞神經系統的主要神經遞質之一，介導膽鹼能神經的信號傳遞，與學習記憶有密切關係，而ChAT是乙醯膽鹼的合成酶，AChE是乙醯膽鹼的水解酶，二者的活力可間接反映腦內乙醯膽鹼的含量，反映膽鹼能神經功能的狀況。連續給藥35天後，W-PHPB50和160mg/kg組SAMP8小鼠海馬的ChAT活力分別比對照組增高了40%和61%，有顯著的統計學差異，並有一定的劑量依賴性(圖24A)。在皮層，兩個給藥組的ChAT活力與對照組比較沒有明顯差異(數據未列出)。兩個給藥組海馬的AChE活力(0.632±0.036和0.597±0.030U/mg蛋白)有明顯低於對照組(0.850土0.195U/mg蛋白)的趨勢。說明^-PHPB可能有降低SAMP8小鼠海馬AChE活力的作用(圖24B)。在皮層，各給藥組的AChE活力則沒有明顯差異(數據未列出)。線粒體ATPase是反映線粒體產能功能的重要指標之一。本研究發現W-fflPB160rag/kg組SAMP8小鼠的ATPase活力(9.82±0.51U/mg蛋白)高於對照組(8.58±0.21U/mg蛋白)(代O.05)，PHPB50mg/kg組(8.79±0.33U/mg蛋白)則與對照組無明顯差別。考慮到大劑量組的增加幅度僅14%，推測c7-PHPB可能對SAMP8小鼠皮層線粒體ATPase活力並無影響(圖24C)。綜上所述，d-PHPB可劑量依賴性地提高SAMP8小鼠海馬組織的ChAT活力，對其海馬AChE活力也有一定的降低趨勢。表明，c/Z-PHPB可能通過增加痴呆小鼠海馬乙醯膽鹼含量而改善其膽鹼能神經功能。另外，"Z-PHPB對痴呆小鼠皮層線粒體ATPase活力影響甚微。權利要求1、2-(α-羥基戊基)苯甲酸鉀鹽在製備用於預防、緩解和/或治療老年痴呆疾病或症狀的藥物中的應用。2、根據權利要求l的應用，其特徵在於，所述的老年痴呆選自早老性痴呆、血管性痴呆或二者兼有的混合型。3、根據權利要求l的應用，其特徵在於，所述的老年痴呆疾病或症狀選自記憶力減退、認知功能低下、思維遲鈍或空間定向障礙。4、2-(a-羥基戊基)苯甲酸鉀鹽在製備減輕腦組織氧化應激損傷、提高膽鹼能神經功能、保護神經元和\或提高腦源性神經生長因子含量的藥物中的應用。5、根據權利要求4的應用，其特徵在於，所述的減輕腦組織氧化應激損傷是通過抑制腦組織代償性異常增高的抗氧化酶活力，減少脂質過氧化產物，恢復腦組織正常的氧化-抗氧化動態平衡。6、根據權利要求5的應用，其特徵在於，所述的抗氧化酶是超氧化物歧化酶，脂質過氧化產物是丙二醛。7、根據權利要求4的應用，其特徵在於，改善膽鹼能神經功能是通過提高乙醯膽鹼合成酶的活力，降低乙醯膽鹼水解酶的活力。8、一種用於預防、緩解和/或治療老年痴杲疾病或症狀的藥物組合物，其含有預防或治療有效量的2-(a-羥基戊基)苯甲酸鉀鹽，以及任選的藥學可接受的載體和/或輔料。9、權利要求8所述的藥物組合物，其特徵在於，所述的老年痴呆選自早老性痴呆、血管性痴呆或二者兼有的混合型。10、權利要求8所述的藥物組合物，其特徵在於，其中所述的老年痴呆疾病或症狀選自記憶力減退、認知功能低下、思維遲鈍或空間定向障礙。11、權利要求8所述的藥物組合物，根據施用途徑所述藥物組合物可呈選自如下的劑型溶液、懸液、乳劑、丸劑、膠囊、粉末、控制釋放或持續釋放製劑。全文摘要本發明公開了2-(α-羥基戊基)苯甲酸鉀鹽在製備用於預防、緩解和/或治療老年痴呆疾病或症狀的藥物中的應用。本發明還公開了一種用於預防、緩解和/或治療老年痴呆疾病或症狀的藥物組合物，其含有預防或治療有效量的2-(α-羥基戊基)苯甲酸鉀鹽，以及任選的藥學可接受的載體和/或輔料。以及一種預防、緩解和/或治療老年痴呆疾病或症狀的方法，包括向需要的患者施用治療有效量的2-(α-羥基戊基)苯甲酸鉀鹽或含有其的藥物組合物。文檔編號A61K31/185GK101627984SQ20081011663公開日2010年1月20日申請日期2008年7月14日優先權日2008年7月14日發明者楠馮,徐少峰,江李,楊靖華,玲王,王曉良,趙萬紅,馬士平申請人:中國醫學科學院藥物研究所