25‑羥基維生素D3測定試劑盒及製作方法與流程

2023-06-09 16:23:11

技術領域：

本發明涉及醫學免疫學中螢光免疫層析技術領域，包括蛋白交聯技術、膜層析技術、標記免疫分析技術等。具體地說是一種能夠快速準確的對血清、血漿和全血等樣品中25-羥基維生素d3進行定量分析的25-羥基維生素d3測定試劑盒及製作方法。

背景技術：
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vd系類固醇的衍生物是促進機體鈣磷吸收的主要元素，在自然界中以10多種形式存在，維生素的兩個最重要的形式是維生素d3和維生素d2，對動物最有營養意義。而vd在體內僅是其活性代謝物的前體，只有轉化為25-羥基d3(25-oh-d3)和1,25-二羥基d3(1,25-(oh)2d3)後才有生物活性，才能有效地發揮其生理生化功能。25-oh-d3是維生素d在體內的主要活性產物，是評價維生素d營養水平及診斷佝僂病可靠而敏感的指標。25-oh-d3的重要生理功能是調節機體ca,p的正常代謝，維持動物血鈣、血磷水平,保持骨骼的正常生長發育,防止鈣缺乏症,如軟骨病、佝僂病等。在人體內，維生素d3和d2與血漿中維生素d結合蛋白結合，並轉運到肝臟，兩者經25羥基化成為25羥基維生素d，在血清中檢測出來的95％以上的25羥基維生素d為25羥基維生素d3，維生素d缺乏是繼發性甲狀旁腺機能亢進症的常見病因。提高甲狀旁腺激素含量，特別是提高缺乏維生素d的老年人的甲狀旁腺激素含量會導致骨軟化症，增加了骨轉化，降低了骨質量，並有骨折的危險。25-羥基維生素d3含量低還與骨密度低有關。與其他臨床數據結合，其結果可作為輔助手段來判定骨代謝。

免疫分析技術是利用微量抗原與相應的高特異性抗體之間的免疫反應，來檢測如激素、藥物、蛋白質、多肽、酶、腫瘤相關抗原、微生素、病毒、細菌及金屬元素等生物體內活性物質。免疫分析技術包括標記免疫分析、非標記免疫分析和儀器免疫分析。本試劑盒利用的含有稀土元素的羧基乳膠微球標記免疫分析技術是屬於標記免疫分析之一種。

螢光免疫分析(fia)和放射免疫分析(ria)自問世以來，經歷了幾十年的發展，但是人們越來越感覺到fia因自然本地太高，幹擾檢測結果；ria採用同位素標記，對人體有極大危害並給實驗帶來不便。酶免疫分析(eia)也因酶本身不穩定，受其他影響因素較大，推廣應用受到限制。80年代初，人們開始研究用稀土元素代替螢光物質和同位素標記蛋白質或抗體，將時間分辨技術引入到生物檢測領域，建立了新型的超微量時間分辨螢光免疫分析技術(timeresolvedfluoroimmunoassay，簡稱trfia)。該技術採用多學科先進技術，集結了其他免疫分析的特點，在免疫學、分子生物學、細胞學和醫學等領域，取得長足的發展和廣泛應用。

trfia利用了具有獨特螢光特性的3價稀土離子及螯合物為示蹤物代替螢光物質、酶、同位素、化學發光物質，標記抗體、抗原、激素、多肽、蛋白質、核酸探針及生物細胞，待反應體系(如抗原抗體反應、核酸探針雜交、生物素親和素反應以及靶細胞對效應細胞的殺傷效應等)發生後，用trfia檢測儀測定反應產物中的螢光強度。根據產物螢光強度和相對螢光強度的比值，判斷反應體系中分析物的濃度，從而達到定量分析。在通常的螢光測定中，由於測試樣品中含有多種螢光成分，背景螢光(來自樣品中的膠體顆粒和溶劑分子引起的散射光以及血清中蛋白質和其他化合物發出的非特異性螢光)強度大、幹擾強，成為螢光分析法大範圍推廣的瓶頸。trfia之所以能夠成為繼eia、ria之後一種新的靈敏的檢測方法，主要取決於鑭系元素獨特的螢光特點、檢測中採用的波長分辨和時間延遲技術以及解離-增強技術。

鑭系元素(lanthanide,ln)屬於稀土元素，共有17中，常用於trfia主要有銪(eu)、釤(sm)、鋱(tb)、鏑(dy)。鑭系元素具有獨特的螢光發光特點，與普通螢光相比，鑭系離子螯合物螢光衰變時間長，為傳統螢光的103-106倍。如鑭系離子螯合物的螢光衰變時間在60-900μs，常用的eu3+螢光衰變時間為714μs，普通螢光免疫分析中螢光團的螢光衰變時間只有1-100μs，樣品中一些蛋白質的螢光衰變時間僅為1-10μs，因此利用時間分辨技術，延遲一定時間後測量，便可獲得eu3+特異性螢光信號。同時由於衰變時間長，eu3+標記物在測量時間裡可以反覆被激發，每次激發後由激發態很快躍遷到基態，就有螢光發出，然後又可被重新激發，如此每秒可有1000次激發，使得trfia螢光標記物的相對比活性很高。鑭系元素螢光光譜的最大特徵是激發光與發射光之間的stokes位移較大，eu3+激發波長為337nm，發射波長為615nm，stokes位移可達278nm；同時eu3+被激發的螢光光帶極窄，螢光的發射峰非常尖銳，可使儀器調整在極窄的波長範圍內測定，這樣就幾乎完全消除了背景螢光的幹擾，繼而通過時間延遲和波長分辨，將強特異性螢光和背景螢光辨開(故稱為時間分辨)，使幹擾達到幾乎為零。

鑑於以上標記方法及檢測技術的應用，本試劑盒具有良好的檢測特異性、較高的靈敏度、操作的簡便性以及穩定的螢光標記物保證了檢測的準確性。

技術實現要素：
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本發明針對現有技術中存在的缺點和不足，提出了一種利用螢光免疫層析的靈敏性，結合螢光免疫層析分析儀實現的靈敏度高、快捷簡便，可以準確定量的25-羥基維生素d3測定試劑盒及製作方法。

本發明可以通過以下措施達到：

一種25-羥基維生素d3測定試劑盒，設有試紙卡，其特徵在於所述試紙卡由下至上依次設有：pvc板、樣品墊、結合墊、硝酸纖維素膜和吸水墊，其中結合墊上吸附有稀土螢光微球標記的抗25-羥基維生素d3單克隆抗體-微球偶聯複合物，所述稀土螢光微球的直徑為100-250nm，稀土螢光微球含稀土鑭系元素中的一種或幾種，在基態下穩定，在300-400nm的激發光源作用下發射出波長範圍為550-650nm的螢光；所述單克隆抗體為純化後混合的單克隆抗體，來源於針對2-6個不同的25-羥基維生素d3抗原表位的單克隆抗體細胞株。

本發明所述結合墊的稀土螢光微球的直徑優選是150-200nm；所述稀土螢光微球優選含有一種或幾種稀土鑭系元素；結合墊上稀土螢光微球標記的抗體優選來源於針對2個不同抗原表位的單克隆細胞細胞株。

本發明所述結合墊採用如下步驟製得：將玻璃纖維膜浸泡於150mmtris-hcl處理液中(含1.0％tritonx-100，2.5％bsa，ph7.4)，4℃浸泡2小時，然後取出37℃烘箱烘乾4小時，備用，將玻璃纖維膜放在bio-dotxyz3050三維噴點平臺上，用bio-jetquanti300非接觸式微定量噴頭將稀土螢光微球標記的抗25-羥基維生素d3單克隆抗體偶聯複合物噴到玻璃纖維膜，37℃烘乾1小時後製得。

本發明中結合墊上的所述稀土螢光微球標記的抗25-羥基維生素d3單克隆抗體採用如下步驟製得：

步驟1：單克隆抗體細胞株的獲得：用25-羥基維生素d3純品免疫小鼠，採用標準的單克隆抗體製備方法製備特異性高親和力的單克隆抗體細胞株，對所獲得的單抗細胞株進行配對篩選，根據配對結果和親和力數據選出用於試劑盒的單抗細胞株；

步驟2：單克隆抗體的製備：採用標準的腹水生產工藝製備並純化抗25-羥基維生素d3單克隆抗體，分裝後保存於-20℃備用；

步驟3：稀土螢光微球的醛基化：取5mg稀土螢光微球，用20mm，ph9.5的碳酸鹽緩衝液，採用離心法洗滌3遍，離心速度為12000rpm，時間為5分鐘，最後重懸於100μl的上述碳酸鹽緩衝液中，加入500μl醛基化的葡聚糖，混勻，室溫下暗反應4小時，採用同樣的離心法洗滌和重懸到100μl的上述碳酸鹽緩衝液中，置於4℃備用；

步驟4：稀土螢光微球標記的抗25-羥基維生素d3單克隆抗體的製備：選取來自2個不同抗原表位的單克隆細胞細胞株的單克隆抗體，按照質量比1:1將2mg25-羥基維生素d3單克隆抗體用上述碳酸鹽緩衝液於4℃透析過夜，然後與上述醛基化的稀土螢光微球混合，4℃反應過夜；然後，加入硼氫化鈉至終濃度5mm，4℃反應4小時；再加入等體積的封閉液(50mmtris-hcl，ph7.4，含2％bsa，5％蔗糖)，4℃封閉過夜；然後用50mmtris-hcl，ph7.4的緩衝液採用離心法洗滌3遍，重懸於100μl的50mmtris-hcl緩衝液中(含1.2％nacl，0.5％bsa，0.1％tween20)，4℃避光保存備用。

本發明所述包被有檢測線和質控線的硝酸纖維素膜通過以下步驟製得：

步驟1：採用與結合墊上所用抗25-羥基維生素d3單克隆抗體細胞株不同的細胞株，採用標準的腹水生產工藝製備並純化抗25-羥基維生素d3單克隆抗體，保存於-20℃備用；

步驟2：分別用包被稀釋液將上述鼠源抗25-羥基維生素d3單克隆抗體和羊抗小鼠igg抗體調整濃度到1-3mg/ml，膜液量為0.5-2μl/cm，將它們分別作為檢測線和質控線平行噴灑於硝酸纖維素膜上進行包被，檢測線和質控線間隔為3-7mm，然後置於烘箱中，37℃烘乾2小時。

本發明所述樣品墊通過以下步驟製得：將玻璃纖維膜浸泡於含有1.0％tritonx-100，2.5％bsa，0.15mtris緩衝液，ph7.5的處理液中，於4℃浸泡4個小時，然後置於烘箱中，37℃烘乾2小時。

本發明還提供了一種如上所述試劑盒實現的25-羥基維生素d3製作方法，其特徵在於包括以下步驟：

步驟1：將檢測試劑及樣本平衡至室溫，取出試紙卡，平放；

步驟2：讀卡：將ic卡放置在乾式螢光免疫分析儀標註位置，讀取相關信息，所述螢光免疫層析分析儀是一種光學檢測系統，對25-羥基維生素d3的測定範圍為3.00-120ng/ml；步驟3：加樣：血清/血漿：取100μl血清/血漿樣本垂直滴加至測試卡加樣處；全血：取150μl全血樣本垂直滴加至測試卡加樣處；取樣時注意不要吸入氣泡。

步驟4：檢測，可採用自動測試或即時測試兩種模式進行檢測；自動測試：將測試卡插入乾式螢光免疫分析儀的承載器上，按測試鍵，儀器將自動對測試卡進行掃描分析檢測；即時測試：測試卡室溫放置15min後，插入乾式螢光免疫分析儀的承載器上，點擊即時測試。

本發明提供一種利用稀土羧基乳膠微球標記的螢光免疫層析技術製備的25-羥基維生素d3測定試劑盒，同時適合血清、血漿和全血樣本，並適合臨床上單人份檢測，相對於25-羥基維生素d3定性膠體金試劑，能定量檢測樣本中的25-羥基維生素d3含量，具有更明確的臨床指導意義，具有操作簡便、反應快速、靈敏度高、特異性強、適合現場檢測和經濟實用等優點。

附圖說明：

附圖1是本發明中試紙卡的結構示意圖。

附圖2是本發明中實施例2的準確度分析結果示意圖。

附圖3是本發明中實施例2的準確度分析結果示意圖。

附圖4是本發明中實施例2的準確度分析結果示意圖。

附圖標記：pvc板1、樣品墊2、結合墊3、硝酸纖維素膜4、吸水墊5。

具體實施方式：

下面結合附圖和實施例對本發明作進一步的說明：

如附圖1所示，本發明首先提出了一種25-羥基維生素d3測定試劑盒，盒內設有試紙卡，所述試紙卡由下至上依次設有：pvc板1、樣品墊2、結合墊3、硝酸纖維素膜4和吸水墊5，其中結合墊上吸附有稀土eu3+螢光微球標記的抗25-羥基維生素d3單克隆抗體-微球偶聯複合物，所述稀土螢光微球的直徑為150nm，稀土螢光微球含稀土鑭系元素eu3+，在基態下穩定，在337nm的激發光源作用下發射出波長615nm的螢光；所述單克隆抗體為純化後混合的單克隆抗體，來源於針對2-6個不同的25-羥基維生素d3抗原表位的單克隆抗體細胞株。

所述結合墊3的稀土螢光微球的直徑優選是150nm；所述稀土螢光微球優選含有稀土鑭系元素銪(eu3+)；結合墊上稀土螢光微球標記的抗體優選來源於針對2個不同抗原表位的單克隆細胞細胞株。

實施例1：

25-羥基維生素d3測定試劑盒中試紙卡的各組成部分可以通過以下措施製得：

1、樣品墊2的製備：

將玻璃纖維膜浸泡於含有1.0％tritonx-100，2.5％bsa，0.15mtris緩衝液，ph7.5的處理液中，於4℃浸泡4個小時，然後置於烘箱中，37℃烘乾2小時。

2、吸附螢光微球標記抗體的結合墊3的製備：

將玻璃纖維膜浸泡於150mmtris-hcl處理液中(含1.0％tritonx-100，2.5％bsa，ph7.4)，4℃浸泡2小時，然後取出37℃烘箱烘乾4小時，備用，將玻璃纖維膜放在bio-dotxyz3050三維噴點平臺上，用bio-jetquanti300非接觸式微定量噴頭將稀土eu3+螢光微球標記的抗25-羥基維生素d3單克隆抗體偶聯複合物噴到玻璃纖維膜，37℃烘乾1小時後製得。

稀土螢光納米微球的醛基化：取5mg稀土螢光納米微球，用20mm，ph9.5的碳酸鹽緩衝液，採用離心法洗滌3遍，離心速度為12000rpm，時間為5分鐘，最後重懸於100μl的上述碳酸鹽緩衝液中，加入500μl醛基化的葡聚糖，混勻，室溫下暗反應4小時，採用同樣的離心法洗滌和重懸到100μl的上述碳酸鹽緩衝液中，置於4℃備用；

稀土eu3+螢光微球標記的抗25-羥基維生素d3單克隆抗體的製備：選取來自2個不同抗原表位的單克隆細胞細胞株的單克隆抗體，按照質量比1:1將2mg抗25-羥基維生素d3單克隆抗體用上述碳酸鹽緩衝液於4℃透析過夜，然後與上述醛基化的稀土螢光微球混合，4℃反應過夜；然後，加入硼氫化鈉至終濃度5mm，4℃反應4小時；再加入等體積的封閉液(50mmtris-hcl，ph7.4，含2％bsa，5％蔗糖)，4℃封閉過夜；然後用50mmtris-hcl，ph7.4的緩衝液採用離心法洗滌3遍，重懸於100μl的50mmtris-hcl緩衝液中(含1.2％nacl，0.5％bsa，0.1％tween20)，4℃避光保存備用。

3、包被有檢測線和質控線的硝酸纖維素膜4的製備：

採用與結合墊上所用抗25-羥基維生素d3單克隆抗體細胞株不同的細胞株，採用標準的腹水生產工藝製備並純化抗25-羥基維生素d3單克隆抗體，保存於-20℃備用；

分別用包被稀釋液將上述鼠源抗25-羥基維生素d3單克隆抗體和羊抗小鼠igg抗體調整濃度到1.5mg/ml，膜液量為1.5μl/cm，將它們分別作為檢測線和質控線平行噴灑於硝酸纖維素膜上進行包被，檢測線和質控線間隔為4mm，然後置於烘箱中，37℃烘乾2小時。

試紙卡的組裝：在pvc板1上依次粘貼經過處理的樣品墊2、吸附有稀土螢光標記的抗體的結合墊3、包被有檢測線和質控線的硝酸纖維素膜4和吸水墊5，組裝後得到試紙大板，按照要求切割成4mm寬，將試紙裝入塑料卡內形成試紙卡。

上述各步驟中選用的設備及原料優選以下原料：

25-羥基維生素d3特異性配對抗體；25-羥基維生素d3質控品：英國朗道實驗診斷有限公司；稀土螢光微球：上海甄準生物科技有限公司；硝酸纖維素(nc)膜：millipore公司產品；牛血清白蛋白(bsa)，聚乙二醇peg20000，水解酪蛋白：sigma產品，其它常用試劑均為分析純試劑。

實施例2：準確度試驗

選用上述試紙卡以及螢光免疫層析分析儀(型號：neo-007)，

螢光免疫分析儀參數的設定：在螢光免疫分析儀上設定好試紙卡工藝參數後，取上述組裝好的試紙卡，分別用4、10、20、40、60、80、100ng/ml的25-羥基維生素d3校準品，用試紙卡進行測定，得到各校準品的螢光強度值，將結果輸入到分析儀的參數中，完成分析儀的參數的設定。

主要檢測材料：臨床樣本由相關醫院獲得，共300份膠乳增強免疫比濁法定值樣本，其中血清樣本100份，血漿樣本100份，全血樣本100份，25-羥基維生素d3含量分布區間為3.00-120ng/ml之間。

檢測方法：

步驟1：將檢測試劑及樣本平衡至室溫，取出試紙卡，平放；

步驟2：讀卡：檢查ic卡與試劑盒的批號是否一致。將ic卡放置在乾式螢光免疫分析儀標註位置，讀取相關信息；

步驟3：加樣：血清/血漿：取100μl血清/血漿樣本垂直滴加至測試卡加樣處，全血：取150μl全血樣本垂直滴加至測試卡加樣處；取樣時注意不要吸入氣泡。

步驟4：檢測，可採用自動測試或即時測試兩種模式進行檢測，自動測試：將測試卡插入乾式螢光免疫分析儀的承載器上，按測試鍵，儀器將自動對測試卡進行掃描分析檢測；即時測試：測試卡室溫放置15min後，插入乾式螢光免疫分析儀的承載器上，點擊即時測試。

試驗結果分析：

臨床樣本檢測試劑製備完成後，按檢測方法對所有臨床樣本進行檢測，並分析檢測結果。

試驗結果：

如附圖2至附圖4所示，以實驗系統的檢測值為y軸，以對照系統的測驗值為x軸，繪製散點圖，並進行相關性分析。臨床樣本檢測對300份臨床定值樣本檢測，樣本平均偏差值小於10％，最大偏差小於20％，r2>0.98，一致性係數>0.90。檢測結果表明製備的檢測試劑盒性能良好，適合用於臨床檢測，滿足不同客戶不同檢測場合的差異化需要。

本發明提供一種利用稀土螢光免疫層析技術製備的25-羥基維生素d3快速定量免疫層析檢測試劑盒，同時適合血清/血漿和全血樣本，並適合臨床上單人份檢測，相對於25-羥基維生素d3定性膠體金試劑，能定量檢測樣本中的25-羥基維生素d3含量，具有更明確的臨床指導意義，具有操作簡便、反應快速、靈敏度高、特異性強、適合現場檢測和經濟實用等優點。