千金藤鹼及其鹽酸鹽在製備抗B肝病毒藥物中的應用的製作方法

2023-06-09 16:34:46

專利名稱：：千金藤鹼及其鹽酸鹽在製備抗B肝病毒藥物中的應用的製作方法
技術領域：
：本發明涉及千金藤鹼及其鹽酸鹽的用途，尤其涉及千金藤鹼及其鹽酸鹽在醫藥領域的用途。
背景技術：
：乙型病毒性肝炎是由B型肝炎病毒引起的一種世界性疾病。發展中國家發病率高，據統計全世界無症狀攜帶者(HBsAg攜帶者)超過2.8億，我國佔1億以上。對慢性HBV感染，病毒複製指標持續陽性者，抗病毒治療是一項重要措施。目前抗病毒藥物，效果都不十分滿意。應用後可暫時抑制HBV複製，停藥後這種抑制作用消失，使原被抑制的指標又回復到原水平。有些藥物作用較慢，需較長時間才能看到效果。千金藤鹼(C印haranthine)是從防己科千金藤屬植物的塊根中提取分離出的一種生物鹼，其加鹽酸成鹽可得一種雙苄基異喹啉類單體化合物，即鹽酸千金藤鹼(C印haranthineHydrochlori，CH)，其分子式為C37H38N2062HC1，結構式如下已知千金藤鹼/鹽酸千金藤鹼除了有升高由於化療導致的白細胞減少外，還具有抗腫瘤作用，逆轉化療引起的多藥耐藥，而且在抗炎鎮痛，抑制脂質過氧化反應等方面也具有很好的治療效果；據報導千金藤鹼還可抑制SARS-CoV病毒引起的細胞病變作用，抑制HIV-I複製，抑制HSV-1對Vero細胞的致病變作用。
發明內容本發明要解決的技術問題是提供千金藤鹼及其鹽酸鹽的一種新用途，即在製備藥物中的應用。實際上，本發明是以千金藤鹼或鹽酸千金藤鹼為有效成分製備成抗B肝病毒藥物，可採用常規的製備工藝，製備成不同的藥物劑型供患者使用，如製成口服劑型、膠囊、粉劑、針劑等劑型。千金藤鹼或鹽酸千金藤鹼對細胞有一定的毒性，根據細胞存活率，計算藥物CH對細胞的半數毒性濃度(TC5。)為2.09WmL—、螢光定量PCR結果發現，CH能抑制細胞內的HBVDNA合成(P<0.01)，並呈劑量依賴性，劑量大於0.5PgmL—1時能對細胞上清液中HBVDNA的抑制率超過50%。計算CH的半數抑制率IC5。為0.324WmL—、治療指數TI=TC5。/IC5。=6.45,2.0<TI<10.0。因此可以認為CH有較強的抑制HBVDNA合成作用，為有效低毒類藥物。1.千金藤鹼和鹽酸千金藤鹼製備方法將地不容塊根粉用稀酸浸泡提取,提得的酸水液用鹼溶液調節呈鹼性，濾集析出的粗生物鹼，再經苯加成精製後過氧化鋁柱，減壓蒸乾溶劑得千金藤鹼，千金藤鹼溶解後與濃鹽酸反應即得鹽酸千金藤鹼粗品，將析出的鹽酸千金藤鹼粗品重結晶精製，真空乾燥即得鹽酸千金藤鹼金藤鹼原料藥(參見l.黃加鑫，陳嫵.地不容中生物鹼的分離與鑑定，藥學學報,1979，14(10):612616;2.陳正慶,楊素聆，丁緒亮.地不容的非酚性生物鹼，南京醫學院學報，1985，5(3):203208;3.TheMerckIndex(13版),No.l997.)。2.鹽酸千金藤鹼注射劑製備方法-取按重量份計注射用原料藥1份，用200份的5(TC的水混勻使溶解，過濾，灌封，滅菌，檢漏，即得鹽酸千金藤鹼注射劑(規格10mg/2mL)。3.鹽酸千金藤鹼凍乾粉針劑的製備取按重量份計鹽酸幹金藤鹼110份，用10004000份的5060。C的水混勻使鹽酸千金藤鹼溶解，再加入凍幹賦形劑(如甘露醇、葡萄糖、蔗糖、海藻糖或乳糖等)10400份混合均勻後，過濾除菌，測鹽酸千金藤鹼含量後凍幹，即製得鹽酸千金藤鹼凍乾粉針劑。為了更好地理解本發明的實質，下面以鹽酸千金藤鹼的藥理試驗及結果來說明其在製藥領域中的新用途。l.主要試驗材料①H印G2.2.15細胞株由廣州暨南大學生物醫藥研究開發基地提供，本研究室自行傳代培養供實驗使用。實驗藥物鹽酸千金藤鹼由河南省醫藥科學研究院藥化室製備(製備方法如上所述)。②主要試劑拉米夫定(3TC，賀普丁片)，葛蘭素-史克製藥(蘇州)有限公司產品；DMEM培養基，Hyclone海克隆生物化學製品有限公司；FBS，Hyclone海克隆生物化學製品有限公司；胰蛋白酶，美國Amersco公司；MTT,美國Sigma公司；G418，美國irwitrogen公司；HBV核酸擴增螢光定量檢測試劑盒，深圳匹基生物工程股份有限公司；B型肝炎病毒表面抗原診斷試劑盒，上海科華生物技術有限公司；B型肝炎病毒e抗原診斷試劑盒，上海科華生物技術有限公司。③主要儀器及器皿生物安全櫃Hfsafe-1200TEClassIITypeB2，香港力康發展有限公司；水套式二氧化碳培養箱HF160W，香港力康發展有限公司；酶標儀168-1000XC，美國BIORAD;螢光PCR檢測儀，美國RocheLightCyclerl.5;全自動滅菌器HVE-50，日本HIRAYAMA;96孔培養板，24孔培養板，50mL細胞培養瓶，美國corning公司。2.鹽酸千金藤鹼(CH)對細胞的毒性試驗根據Mosmann建立的MTT比色法檢測藥物對H印G2.2.15細胞的毒性。細胞長滿培養瓶後，加入0.25%胰蛋白酶，消化後加入培養液吹打成單細胞，加入細胞計數板計數，濃度為1X105個/mL後接種於96孔細胞培養板每孔100ul，每個濃度設三個復孔，置C02培養箱(37°C,5.0%C02)中培養24小時。細胞長成單層後加入含有不同濃度藥物的培養基，並設不含藥物的正常細胞為對照組。連續培養72小時，每孔加入MTT10ul，於C02培養箱(37°C，5.0%C02)中繼續培養。4小時後，棄去上清液，每孔加入DMS0200ul，用微量振蕩器充分震蕩，使結晶紫充分溶解。用酶標儀(檢測波長490nm，參考波長630nm)讀取各孔0D值，記錄結果。計算CH對H印G2.2.15細胞的抑制百分率抑制百分率二空白對照孔0灘—給藥孔0灘空白對照孔OZ)值由表可以看出鹽酸千金藤鹼給藥組對細胞有一定的毒性。根據細胞存活率，計算藥物CH對細胞的半數毒性濃度(TC5。)為2.09Hg，mL一1。表lCH對HepG2.2.15細胞的毒性作用(^±s，n=3)tableseeoriginaldocumentpage6注A:CH5.0嗎.mL";B:CH2.5ng.mI/1;C:CHl.25ng.mI/1;D:CH0.63^mL";3.藥物對HBV抑制實驗選擇小於CHTCs。的一系列濃度l^g.mL—1,0.5Pg.ml/1，0.25PgmL1，0.125PgmL—i作為試驗濃度，檢測其對細胞培養液中HBVDNA以及表面抗原和e抗原的影響。選用對數生長期的H印G2.2.15細胞，胰酶消化成單細胞懸液，按照2Xl4個.mL—工的濃度接種於24孔板，每孔lmL，每個濃度3個孔。ld後待細胞貼於孔底，吸去舊的培養基，加入含有不同藥物濃度的培養基，並設加完全培養基的細胞為正常對照，之後根據細胞生長情況可適當更換培養基。收集第三天、第六天、第九天的細胞上清液，於-2(TC保存。用ELISA方法測定第三天、第六天、第九天的e抗原和表面抗原，用螢光定量PCR方法測定第九天的HBVDNA拷貝值。①CH對H印G2.2.15細胞上清液中HBeAg和HBsAg的影響a)實驗準備:從冷藏環境中取出試劑盒，在室溫下平衡30分鐘，同時將濃縮洗滌液稀釋20倍。b)加待測標本加入待測標本每孔0.05mL，並設HBeAg和HbsAg陽性對照及陰性對照各2孔，空白對照1孔。c)加酶結合物每孔0.05mL，空白對照孔不加，充分混勻，置恆溫箱中37。C孵育30min。d)洗板棄去反應板各孔內液體，拍幹；用洗滌液注滿每孔，靜置5-10s，棄去孔內洗滌液，拍幹，如此反覆五次，拍幹。e)加顯色劑先加顯色劑A，每孔0.05mL，再加顯色劑B，每孔0.05mL;充分混勻，放置37'C避光孵育15min。f)終止反應每孔加入終止液0.05mL，混勻。g)測定用酶標儀讀數，選擇雙波長450/630mn，讀取各孔OD值。h)結果判定首先按照COV邱月性對照平均OD值X2.l計算Cutoff值，如果標本0D值》C0V為陽性，標本0D值《C0V為陰性。通過ELISA試劑盒測定CH對HepG2.2.15細胞分泌表面抗原和e抗原的影響，發現CH四個劑量組都對表面抗原和e抗原都有一定的抑制作用，並且有濃度和時間依賴性(見表2、表3)。CH作用的第九天，lpgTnL"劑量組對表面抗原的抑制將近一半，對e抗原的抑制作用也達到了40%。表2CH在不同的時間點對HBsAg的影響tableseeoriginaldocumentpage8表3CH在不同的時間點對HBeAg的影響tableseeoriginaldocumentpage8②用螢光定量PCR法測CH對H印G2.2.15細胞中HBVDNA拷貝數的影響HBV"DNA檢測有助於判斷HBV感染者病毒複製程度及傳染性大小，較靈敏評價抗病毒藥物的療效。a)樣本處理取100ul各藥物處理組的細胞上清液，分別加入0.5mL離心管中；向各管中加入100ulDNA提取液I，振蕩混勻，13000rpm離心10min;吸棄液體；再加入25ulDNA提取液II，振蕩混勻至沉澱完全溶解，2000rpm離心10sec，沸水浴10min;13000rpm離心10min，保留上清液備用。b)擴增試劑準備從試劑盒中取出HBVPCR反應液、Taq酶，室溫融化並混合均勻後，2000rpm離心10sec。設所需要的Roche毛細管管數為n(n-樣本數+2管陰性對照+1管強陽性對照+1管臨界陽性對照+4管陽性工作標準品)可每個測試反應體系配置如下表4:表4反應體系配置試劑HBVPCR反應液Taq酶用量17.8ul0.2ul計算好各試劑的使用量，加入一適當體積離心管中，充分混勻均勻，2000rpm離心10sec，向設定的Roche毛細管中分別加入18ul。c)加樣樣本和陽性工作標準品使用前室溫解凍，震蕩混勻。在所設定的n個Roche毛細管中分別加入5.1步驟中處理過的樣本，陰性對照，強陽性對照和臨界陽性對照上清液以及陽性工作標準液(5.0X104copies/mL，5.OX105copies/mL,5.0X106copies/mL，5.0X107copies/mL)2ul，蓋緊管蓋，連同Roche專用金屬反應管套放在離心機中，於2000rpm離心10sec。將毛細管排好放入螢光PCR檢測儀內。d)PCR擴增循環條件設置見表5，選擇儀器F1通道進行檢測。表5PCR擴增循環條件tableseeoriginaldocumentpage9e)結果判斷按照試劑盒說明書設定結果分析條件。若樣本拷貝值在5.0X102copies/mL5.0X107copies/mL，測定結果有效，可直接使用相應的拷貝數，若樣本拷貝數超過這個範圍，需要稀釋，測定結果以稀釋倍數進行校正。f)計算ICs。按照下式計算化合物對HBVDNA的半數抑制率IC5。抑制百分率二-對照孔膠層拷貝數-Xl(K)%g)計算治療指數(TI):計算TI=TC5。/IC5Q。TK1.0表明受試樣品無效，L0《TI《2.0為低效有毒即弱陽性，2.0<TIIO.O為高效低毒即強陽性。螢光定量PCR結果發現(參見表6和圖1)，CH能抑制細胞內的HBVDNA合成(P<0.01)，並呈劑量依賴性。劑量大於0.5PgmL—1時能對細胞上清液中HBVDNA的抑制率超過50%。計算CH的ICs。為0.32扭gml/1,所以治療指數TI=TC5。/IC5。=6.45,2.0<TI<10.0。認為CH在體外細胞培養體系中有較強的抑制HBVDNA合成作用，為有效低毒類藥物。表6CH給藥後第九天對HepG2.2.15細胞上清液中HBVDNA拷貝數的影響(;±sX105,n=3)分組劑量HBVDNA拷貝值(X105copies)抑制率(％)正常對照037.68±5.3103TClOpg.mr17.68±0.94*79.62CHI8.94±0.98*76.27CHIlHg'ml陽i11.43±3.25*69.67CH20.5(ig.mr116.24±4.25*56.90CH30.25wml隱120.65±3.39*45.21與正常對照組細胞HBVDNA拷貝數比較，*P<0.01從以上結果可以得出本發明的優點在於-1.本發明對已知鹽酸千金藤鹼/千金藤鹼(素)挖掘了新的醫藥用途，開拓了一個新的應用領域。2.本發明的鹽酸千金藤鹼/千金藤鹼(素)安全低毒，穩定性好，藥理作用強，預示著很好的藥用前景。3.本發明的產品原料來源豐富、廉價、毒副作用小，製備工藝簡單，並可做成口服劑型、注射劑型、片劑等，使用方便。4.本發明採用國內外通用的H印G2.2.15細胞株在體外來檢測鹽酸千金藤鹼/千金藤鹼(素)抗B肝病毒作用，通過一系列實驗數據表明，鹽酸千金藤鹼具有明顯的抗B肝病毒效果。圖1CH給藥後第九天對H印G2.2.15細胞上清液中HBVDNA拷貝數的影響(3TC:,g'mL—1，CH1:2PgmL—1,CH2:lPgml/1，CH3:0.5PgmL—1，CH4:0.25WmL-1)具體實施例方式實施例1鹽酸千金藤鹼注射劑製備方法量取注射用水1500mL，加熱至約50°C，加入10.0g的注射用原料藥，溶解。加入O.1%的針用活性炭，攪勻，保溫15分鐘，過濾。用適量注射用水洗滌後，加至2000mL，G4垂熔玻璃漏鬥精濾，灌封，滅菌，檢漏，即得鹽酸千金藤鹼注射劑。(規格10mg/2mL)。實施例2千金藤鹼供試液製備方法將千金藤鹼用適量0.lmol/L鹽酸溶解，用蒸餾水配製成5mg/mL,用1.Omol/LNaOH調節PH至3.54.0並稀釋至所需濃度。實施例3鹽酸千金藤鹼凍乾粉針劑製備取注射用鹽酸千金藤鹼(素)原料1.1克(純度99%)，加入注射用水(50°C)1000mL，攪拌溶解，再加甘露醇10克，攪拌使溶解，0.22gm的微孔濾膜過濾除菌，測鹽酸千金藤鹼(素)含量達到標示量的99%以上即分裝，2mL/瓶。進行冷凍乾燥，凍幹條件為凍幹溫度-20-35°C，真空度50200Pa，時間24小時。然後出箱，封口，檢漏，貼標籤。實施例4鹽酸千金藤鹼片劑製備鹽酸千金藤鹼500mg,乳糖3.0g，澱粉1.28g，羥基丙醯纖維素200mg和硬脂酸鎂20mg，混合，制粒，壓片(規格每片100mg)。實施例5鹽酸千金藤鹼膠囊製備鹽酸千金藤鹼500mg，乳糖2.5mg，澱粉1.75mg，結晶纖維素240mg和硬脂酸鈣10mg，混合，充填於囊形成膠囊(規格每粒10mg)。權利要求1.千金藤鹼及其鹽酸鹽在製備抗B肝病毒藥物中的應用。2.根據權利要求1所述的鹽酸千金藤鹼在製備抗B肝病毒藥物中的應用，其特徵在於，製備藥物的劑型是口服液、膠囊、散劑、片劑、針劑中的任意一種。3.根據權利要求1所述的鹽酸千金藤鹼在製備抗B肝病毒藥物中的應用，其特徵在於，鹽酸千金藤鹼用於製備抗B肝病毒的凍乾粉針劑。全文摘要本發明涉及千金藤鹼及其鹽酸鹽在醫藥領域的用途。即以千金藤鹼或鹽酸千金藤鹼為有效成分製備成抗B肝病毒藥物。本發明研究表明，CH對細胞的半數毒性濃度(TC50)為2.09μg·ml-1；CH能抑制細胞內的HBVDNA合成(P＜0.01)，並呈劑量依賴性，劑量大於0.5μg·mL-1時能對細胞上清液中HBVDNA的抑制率超過50％，CH的IC50為0.324μg·mL-1，治療指數TI＝6.45，2.0＜TI＜10.0，CH有較強的抑制HBVDNA合成作用，為有效低毒類藥物。本發明開拓了千金藤鹼及其鹽酸鹽新的醫藥用途，其製備原料來源豐富、廉價、毒副作用小，製備工藝簡單，並可做成口服劑型、注射劑型、片劑等，使用方便。文檔編號A61P1/00GK101507725SQ20081023732公開日2009年8月19日申請日期2008年12月31日優先權日2008年12月31日發明者劉晨江,張潁君,楊崇仁,江金花,王一飛,王東陽,王慶端,趙志鴻,鄭立運,錢垂文申請人:河南省醫藥科學研究院