一種基於酶切的TA克隆載體及其構建方法和應用與流程
2023-06-09 14:53:36 3
本發明屬於分子生物學領域，具體地說，涉及一種基於酶切的ta克隆載體及其構建方法和應用。
背景技術：
ta克隆是目前克隆pcr產物最簡便、快捷、經濟的方法，在分子生物學領域應用極其廣泛。根據反應過程中使用的酶的種類，ta克隆可主要分為兩類，一類是基於t4dna連接酶，一類是基於dna拓撲異構酶i(topo)，其中前者載體製備容易，成本低，高效連接耗時長，後者載體製備繁瑣，成本高，高效連接耗時極短。根據載體產生t末端的方式，有利用轉移酶在pcr產物末端加t和酶切產生t末端兩種，前者通量高，一致性差，後者通量略低，一致性好。
技術實現要素：
有鑑於此，本發明針對上述的問題，提供了一種基於酶切的ta克隆載體及其構建方法和應用，該ta克隆載體可靠性高，一致性好，成本低廉，中小型實驗室即可使用。
為了解決上述技術問題，本發明公開了一種基於酶切的ta克隆載體，所述基於酶切的ta克隆載體的核苷酸序列如seqidno.1所示，命名為pta03載體。
本發明還提供一種基於酶切的ta克隆載體的構建方法，包括以下步驟：取3-5μgpta03載體，37℃條件下用限制性內切酶ahdi酶切消化3-18小時，酶切結束後補加少量ecorv-hf內切酶消化30分鐘，65℃保持20分鐘，酶切產物採用酶切試劑盒直接過柱回收，或者用dna凝膠回收試劑盒回收；回收產物-20℃保存，該產物即為製備好的ta克隆載體。
本發明還提供一種上述的基於酶切的ta克隆載體的使用方法，包括以下步驟：
步驟1、製備基於酶切的ta克隆載體：取3-5μgpta03載體，37℃條件下用限制性內切酶ahdi酶切消化3-18小時，酶切結束後補加少量ecorv-hf內切酶消化30分鐘，65℃保持20分鐘，酶切產物採用酶切試劑盒直接過柱回收，或者用dna凝膠回收試劑盒回收；回收產物-20℃保存，該產物即為製備好的ta克隆載體；
步驟2、將步驟1製備好的基於酶切的ta克隆載體與目的pcr片段混合配製連接反應體系，混勻後短暫離心3-5秒，將混合液於22度反應5分鐘，反應結束後置冰上，進行後續的轉化反應。
進一步地，步驟1中的酶切反應體系具體為：10xcutsmartbuffer(neb)10μl，10u/μl的限制性內切酶ahdi2μl，1μg/μl的基於酶切的ta克隆載體5μl，餘量為h2o，以上體積總量為100μl。
進一步地，步驟2中的連接反應體系具體為：10xt4dnaligasebuffer(neb)1μl，400u/μl的t4dnaligase0.5μl，50ng/μl的基於酶切的ta克隆載體1μl，目的pcr片段與基於酶切的ta克隆載體的摩爾比為3～7∶1，餘量為ddh2o，以上體積總量為100μl。
進一步地，連接體系中的基於酶切的ta克隆載體的添加量為0.03pmol，當目的pcr片段的長度在2000bp以下時，目的pcr片段：基於酶切的ta克隆載體的摩爾比為7∶1，22℃連接5分鐘；當目的pcr片段的長度在2000bp以上時，目的pcr片段：ta克隆載體的摩爾比為3∶1，22℃連接30分鐘。
進一步地，目的pcr片段的用量(μl)＝[660×a×0.03×b(ng)]÷[1000×目的pcr片段濃度(ng/μl)]，其中a是目的pcr片段的鹼基對數(bp)，b是pcr片段：ta克隆載體的摩爾比。
與現有技術相比，本發明可以獲得包括以下技術效果：
1)本發明ta克隆載體製備簡單，成本低，酶切一次可製備大量載體；
2)本發明ta克隆載體可靠性高，一致性好，末端基本全部帶t；
3)本發明ta克隆載體攜帶致死基因，無需藍白斑篩選，陽性率接近100％。
當然，實施本發明的任一產品並不一定需要同時達到以上所述的所有技術效果。
附圖說明
此處所說明的附圖用來提供對本發明的進一步理解，構成本發明的一部分，本發明的示意性實施例及其說明用於解釋本發明，並不構成對本發明的不當限定。在附圖中：
圖1是本發明基於酶切的ta克隆載體的圖譜；
圖2是本發明陽性菌在lb/amp平板培養基上的生長情況；
圖3是本發明不同菌落pcr鑑定結果，其中，m為d2000dnamarker，1-6為隨機的pcr鑑定。
具體實施方式
以下將配合實施例來詳細說明本發明的實施方式，藉此對本發明如何應用技術手段來解決技術問題並達成技術功效的實現過程能充分理解並據以實施。
實施例1基於酶切的ta克隆載體及其構建方法
本發明提供一種基於酶切的ta克隆載體，本載體由puc19載體為骨架構建而成，不含多克隆位點，攜帶ccdb致死基因，陽性率接近100％，適用於dna測序。採用限制性內切酶ahdi酶切該載體後，純化回收即得到線性化的ta克隆載體，命名為pta03載體。該載體圖譜如圖1所示，ta克隆載體的核苷酸序列如seqidno.1所示，其目標片段序列如下：其中分別是m13fwd和m13rev引物序列，是ampr序列，是限制性內切酶ahdi序列，加粗部分為ccdb致死基因片段。
ta克隆載體的核苷酸序列如下：
實施例2基於酶切的ta克隆載體的構建及使用方法
取3-5μgpta03質粒，用限制性內切酶ahdi酶切消化3-18小時，酶切結束後補加少量ecorv-hf內切酶消化30分鐘，65℃保持20分鐘，酶切產物採用酶切試劑盒直接過柱回收，也可用dna凝膠回收試劑盒回收。回收產物-20℃保存，該產物即為製備好的ta克隆載體，可以用t4dna連接酶與pcr產物進行ta連接，連接產物無需藍白斑篩選。
實施例3
1.載體線性化：如表1所示，配製酶切體系，37℃反應3-18小時，酶切結束後補加1μlecorv-hf內切酶(neb)消化30分鐘，65℃保持20分鐘，酶切產物採用酶切試劑盒直接過柱回收，也可用dna凝膠回收試劑盒回收，回收產物-20℃保存，該產物即為製備好的ta克隆載體，可以用t4dna連接酶與pcr產物進行ta連接。
表1酶切反應體系
2.ta連接：如表2所示，按照目的pcr片段：ta克隆載體的摩爾比為3～7∶1配製連接反應體系，混勻後短暫離心3-5秒，將混合液於22℃反應5分鐘，反應結束後置冰上，進行後續的轉化反應。
表2連接反應體系
註：(1)連接體系中加入的基於酶切的ta克隆載體為0.03pmol，當目的pcr片段的長度在2000bp以下時建議目的pcr片段：ta克隆載體的摩爾比為7∶1，22℃連接5分鐘；當目的pcr片段的長度在2000bp以上時建議目的pcr片段：ta克隆載體的摩爾比為3∶1，22℃連接30分鐘；
(2)目的pcr片段的用量(μl)＝[660×a×0.03×b(ng)]÷[1000×目的pcr片段濃度(ng/μl)]，其中a是目的pcr片段的鹼基對數(bp)，b是pcr片段：ta克隆載體的摩爾比。
(3)轉化的菌株應儘量選擇不含laqi基因的，如dh5a，top10，t1等，如需使用jm109菌株，應在平板培養基上添加少量iptg。
實施例4
如表3所示，按照目的pcr片段(約150bp)：ta克隆載體的摩爾比為7∶1配製連接反應體系，該目的pcr片段為famyb5基因，其序列如seqidno.2所示，混勻後短暫離心3-5秒，將混合液於22℃反應5分鐘，反應結束後置冰上，取全部產物轉化dh5a。圖2為陽性菌在lb/amp平板培養基上的生長情況，隨機挑取6個菌落，使用m13fwd和m13rev引物進行菌落pcr鑑定，如圖3所示，結果顯示擴增的條帶均與預期大小(約500bp)完全相同，進一步的測序顯示目標片段接入均完全正確，這也證實了用本發明得到的ta重組載體陽性率接近100％。
表3連接反應體系
上述說明示出並描述了發明的若干優選實施例，但如前所述，應當理解發明並非局限於本文所披露的形式，不應看作是對其他實施例的排除，而可用於各種其他組合、修改和環境，並能夠在本文所述發明構想範圍內，通過上述教導或相關領域的技術或知識進行改動。而本領域人員所進行的改動和變化不脫離發明的精神和範圍，則都應在發明所附權利要求的保護範圍內。
sequencelisting
四川農業大學
一種基於酶切的ta克隆載體及其構建方法和應用
2017
2
patentinversion3.3
1
2721
dna
人工合成
1
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