一種氧化亞鐵硫桿菌固定化載體及其固定化方法和應用的製作方法
2023-06-09 15:18:11 2
一種氧化亞鐵硫桿菌固定化載體及其固定化方法和應用的製作方法
【專利摘要】本發明公開了一種氧化亞鐵硫桿菌固定化載體及其固定化方法和應用。所述載體為紗布，其固定化方法包括將紗布剪成邊長0.9~1.1cm的碎片，用蒸餾水洗淨碎片後烘乾，填充到反應器中，進行直接紫外線滅菌；再加入9K培養基，並接入氧化亞鐵硫桿菌Z1菌液；採用吸附法，將接種過的反應器於30℃恆溫條件下操作，同時對反應器中的溶液進行曝氣，氧化亞鐵硫桿菌Z1大量生長並吸附在紗布表面；待反應器成功運行48h後，去除培養基，得到固定氧化亞鐵硫桿菌的紗布載體。同時，本發明公開了其在生物氧化中的應用。本發明所提出的氧化亞鐵硫桿菌固定化方法及其應用具有成本低、操作簡單、無二次汙染、利用大規模應用及生物氧化速率快等優點。
【專利說明】一種氧化亞鐵硫桿菌固定化載體及其固定化方法和應用
【技術領域】
[0001]本發明屬於微生物固定領域，具體涉及一種氧化亞鐵硫桿菌固定化載體及其固定化方法和應用。
【背景技術】
[0002]氧化亞鐵硫桿菌(Acidithiobacillusferrooxidans 簡稱 A/)是由 Temple、Colmer等於20世紀50年代初發現並命名的。該菌系短杆狀，嗜酸性化能自養菌，專性好氧，最佳生長PH值為2~2.5，最佳生長溫度28~35，由於它能以氧化Fe2+、元素S和金屬硫化物等來獲得生命過程中所需的能量，並以O2作為最終電子受體，所以廣泛應用於生物冶金、生物脫硫和含硫廢水的處理等領域。但是，該菌存在生長緩慢，代謝周期長，細胞得率低等缺陷，使其工業化應用大大受到了限制。為實現快速、連續反應，並增強反應的穩定性，細菌的固定化很重要。大多數生物反應器如生物濾池、生物滴濾池等是以在載體表面形成的生物膜作為工作介質的，因此固定化載體的選擇及載體掛膜是大規模應用A /菌的重要環節之一。
[0003]在最近幾年，細胞固定化技術發展迅速並成功應用到實際工程領域。具體到固定化氧化亞鐵硫桿菌，不同的固定化方法和載體已經被廣泛研究。例如，像利用吸附進行固定化的材料有交換離子樹脂、沙粒、活性炭、殼聚糖粉末、玻璃粉、貧礦石和鎳合金纖維等；而利用包埋法進行固定化的材料有聚乙烯醇凝膠、海藻酸鈣、聚亞安酯泡沫、瓊脂、卡拉膠和珍珠巖等。比較以上兩種固定化方法，吸附法有著表面積小和生物膜容易脫落等局限。同樣，包埋法有著氧擴散慢、機械強度和耐受性較弱等缺點，而且大部分高分子聚合物對細菌有著一定的毒性。另外，目前研究的關於氧化亞鐵硫桿菌固定化方法中最高序批式氧化亞鐵速率僅僅為0.5g/(L.h)。低氧化亞鐵速率限制了 A /菌的實際工程應用。
【發明內容】
[0004]本發明克服了上述缺陷，提供一種氧化亞鐵硫桿菌固定化載體及其固定化方法和應用。該方法便捷操作，實現了氧化亞鐵硫桿菌的連續化生產，以及可以用來研究氧化亞鐵固定化的生物氧化效果，為其他微生物固定化的規模化和規範化應用提供依據。
[0005]本發明中所使用的氧化亞鐵硫桿菌Zl為中國專利CN201310100105.X中記載的氧化亞鐵硫桿菌Z1，所述氧化亞鐵硫桿菌Zl是從廣東雲浮某硫鐵礦山的酸性廢水中分離純化所得，該菌株是氧化亞鐵硫桿菌Zl (.AcicIi thiobacillus ferrooxi dans strain Z/),由中國典型培養物保藏中心保藏，簡稱CCTCC，保藏號為CCTCC NO: M 2013102，保藏日期為2013年3月25日，保藏地址為中國.武漢.武漢大學。該菌在TSM I固體培養基上呈現單菌落。菌落為圓形、中部突起、紅棕色。光學顯微鏡下觀察該菌的形態為杆狀，寬度和長度分別約為0.53 μ m和2.2 μ m，具有運動性，生長對數期為18~30h。生物學特徵為:革蘭氏染色陰性，專性好氧，嗜酸性。
[0006]本發明採用網狀結構的紗布作為固定化載體材料同時結合相應的反應器保護細胞不受外界不利條件(如酸、鹼、有害離子等)的影響，也不影響傳質、營養物質的供給和產物的導出，同時保持菌種高活性，且可反覆利用。
[0007]本發明中氧化亞鐵在固定化過程中利用生物氧化來獲得生長所需要的能量，從而實現在菌種持續生長的過程中亞鐵離子的生物氧化。
[0008]一種氧化亞鐵硫桿菌固定化載體，所述載體為紗布，其經線密度和緯線密度分別為11根/釐米和9根/釐米。
[0009]本發明所提供的氧化亞鐵硫桿菌固定化載體的固定化方法，具體包括下述步驟:
(1)將紗布剪成邊長為0.9^1.1cm的碎片，用蒸餾水洗淨碎片後烘乾備用；所述紗布的經線密度和緯線密度分別為11根/釐米和9根/釐米；
(2)將步驟(1)中所述紗布填充到反應器中，進行直接紫外線滅菌；
(3)向反應器內加入40(T500mL的9K培養基，並按9%~11%的接種量接入45~55mL的氧化亞鐵硫桿菌Zl菌液，所述9K培養基的配比為=(NH4)2SO4 3g/L，KCl 0.lg/L, K2HPO4
0.5g/L, MgSO4.7H20 0.5g/L, Ca (NO3) 2 0.01g/L, FeSO4.7H20 44.3g/L, pH 值為 2 ；
(4)採用吸附法，將接種過的反應器於30°C恆溫條件下進行操作，同時對反應器中的溶液進行曝氣，曝氣量為0.5~2L/min，氧化亞鐵硫桿菌Zl大量生長並吸附在紗布表面；
(5)待反應器成功運行48h後，去除培養基，得到固定氧化亞鐵硫桿菌的紗布載體。
[0010]優選地，步驟(2)中的所述反應器為自製的實驗裝置系統，採用耐酸有機玻璃製成，反應器呈圓柱體，直徑5c`m，高30cm，有效體積500mL，設有曝氣裝置，底部設有排水口。
[0011]優選地，步驟(2)中的所述紗布投加質量為l(T30g。
[0012]優選地，步驟(3)中的所述氧化亞鐵硫桿菌Zl由中國典型培養物保藏中心保藏，簡稱CCTCC，保藏號為CCTCC M 2013102，保藏日期為2013年3月25日。
[0013]優選地，步驟(3)中的所述氧化亞鐵硫桿菌Zl是從廣東雲浮某硫鐵礦山的酸性廢水中分離純化所得，接種菌液菌濃度為1.7 X IO7個/mL。
[0014]優選地，步驟(5)中的所述去除培養基的方式為重力脫水，即為打開反應器排水口直至無水滴流出。
[0015]本發明還提供了一種上述的固定氧化亞鐵硫桿菌的紗布載體在生物氧化中的應用。
[0016]上述應用具體操作步驟為:將所述的固定化氧化亞鐵硫桿菌的紗布繼續放入反應器中，再加入40(T500mL的9K培養基，在曝氣量為0.5~2L/min，恆溫30°C的條件下啟動反應器。
[0017]對於上述應用的長期效果，可以按以上步驟進行:待反應器運行24h後，去除培養基，重新投加40(T500mL 9K培養基，以相同的條件繼續運行反應器。如此反覆操作。
[0018]本發明與現有技術相比具有如下優點和有益效果:
(1)紗布為一種新型的固定化氧化亞鐵硫桿菌載體，採用吸附法成功固定化氧化亞鐵硫桿菌，該方法具有操作條件溫和，成本低，效果好，無二次汙染等優點，具有良好的實際工程應用前景和商業前景；
(2)通過穩定、連續的處理方式，固定化的氧化亞鐵硫桿菌成功應用到生物氧化過程中，這種方式的優勢在於，能夠保證氧化亞鐵硫桿菌足夠的數量和活性，解決了目前氧化亞鐵硫桿菌生物氧化速率低下的技術問題。[0019](3)在曝氣量lL/min、恆溫30°C下，反應器中紗布固定化氧化亞鐵硫桿菌的平均亞鐵氧化速率和最快亞鐵氧化速率分別達到0.55 g/(L h)和0.92 g/(L h)。
[0020]
【專利附圖】
【附圖說明】
[0021]圖1為實施例1中反應器的示意圖，其中I為生物反應器，2為溶液儲罐，3為儲水池，4為空氣泵，5為恆溫水浴鍋，6為氣體流量計，7為閥門。
[0022]圖2為實施例1中投加不同載體的溶液中pH值與時間的變化曲線圖。
[0023]圖3為實施例1中投加不同載體的亞鐵離子濃度與時間的變化曲線圖。
[0024]圖4為實施例1中投加不同載體的總鐵濃度與時間的變化曲線圖。
[0025]圖5為實施例2中兩種不同脫水方式處理後溶液中亞鐵離子濃度的的變化曲線圖。
[0026]圖6表示實施例3中不同批次下反應器內溶液的亞鐵氧化率的對比圖。
[0027]圖7a~圖7c表示實施例3中固定化前的紗布載體的SEM圖，其中圖7a為100倍，圖7b為5000倍，圖7c為30000倍。
[0028]圖8a~圖8c表示實施例3中固定化後的紗布載體的SEM圖，其中圖8a為100倍，圖8b為5000倍，圖8c為30000倍。
[0029]圖9a~圖9c表示實施例3中一次生物氧化後的紗布載體的SEM圖，其中圖9a為100倍，圖9b為500 0倍，圖9c為30000倍。
[0030]圖1Oa~圖1Oc表示實施例3中十次生物氧化後的紗布載體的SEM圖，其中圖1Oa為100倍，圖1Ob為5000倍，圖1Oc為30000倍。
【具體實施方式】
[0031]下面結合具體實施例對本發明作進一步具體詳細描述，但本發明的實施方式不限於此，對於未特別註明的工藝參數，可參照常規技術進行。
[0032]實施例1
不同載體對氧化亞鐵硫桿菌的影響:
將15g不同載體:紗布、活性炭、沸石分別投加到三個相同的反應器(圖1)內，反應器內已經添加450mL 9K培養基同50mL活化好的氧化亞鐵硫桿菌Zl的菌液，在恆溫30°C和曝氣量lL/min的條件下啟動反應器，同時設置一組空白組(不添加載體，其他條件一致)，通過觀察反應器內溶液的顏色變化和測量溶液pH值、亞鐵離子同總鐵濃度、載體上的單位生物量等指標來比較不同載體對氧化亞鐵硫桿菌的影響。
[0033]結果如圖2、圖3、圖4和表1所示，從圖2、圖3和圖4中可以看出投加不同載體的溶液中PH值、亞鐵離子濃度和總鐵濃度的變化趨勢比較接近，圖2中pH值都是先經歷一段緩慢上升的過程後快速的下降；圖3中亞鐵離子濃度在開始階段緩慢下降，24h後快速降低直至濃度接近於零；圖4中總鐵濃度變化趨勢同亞鐵離子濃度的相近，先經歷一段緩慢下降後快速降低。具體比較不同載體的情況，以紗布作為載體的溶液亞鐵氧化速率最快，其亞鐵離子氧化率在48h時就接近達到100%。從表1中可以看出，在48h後沸石、活性炭、紗布三種載體都有很高的生物量，分別為6.0482 nmol P/g, 3.8753 nmol P/g和7.8063 nmolp/g,此外，只有紗布載體的溶液比較清澈。
[0034]本實例說明沸石、活性炭和紗布都能作為氧化亞鐵硫桿菌Zl的固定化載體，但是其中以紗布的效果最好，其在固定化菌種Zl的過程中達到最多的單位生物量和最快的亞鐵氧化速率。
[0035]表1實施例1中投加不同載體的溶液中顏色和單位生物量的情況
【權利要求】
1.一種氧化亞鐵硫桿菌固定化載體，其特徵在於，所述載體為紗布，其經線密度和緯線密度分別為11根/釐米和9根/釐米。
2.權利要求1所述一種氧化亞鐵硫桿菌固定化載體的固定化方法，其特徵在於，包括如下步驟: (1)將紗布剪成邊長為0.9^1.1cm的碎片，用蒸餾水洗淨碎片後烘乾備用； (2)將步驟(1)中所述紗布填充到反應器中，進行直接紫外線滅菌； (3)向反應器內加入40(T500mL的9K培養基，並按9%~11%的接種量接入45~55mL的氧化亞鐵硫桿菌Zl菌液，所述9K培養基的配比為=(NH4)2SO4 3g/L，KCl 0.lg/L，K2HPO40.5g/L, MgSO4.7H20 0.5g/L, Ca (NO3) 2 0.01g/L, FeSO4.7H20 44.3g/L, pH 值為 2 ； (4)採用吸附法，將接種過的反應器於30°C恆溫條件下進行操作，同時對反應器中的溶液進行曝氣，曝氣量為0.5~2L/min，氧化亞鐵硫桿菌Zl大量生長並吸附在紗布表面； (5)待反應器成功運行48h後，去除培養基，得到固定氧化亞鐵硫桿菌的紗布載體。
3.根據權利要求2所述一種氧化亞鐵硫桿菌固定化載體的固定化方法，其特徵在於，步驟(2)中的所述反應器為自製的實驗裝置系統，採用耐酸有機玻璃製成，反應器呈圓柱體，直徑5cm，高30cm，有效體積500mL，設有曝氣裝置，底部設有排水口。
4.根據權利要求2所述一種氧化亞鐵硫桿菌固定化載體的固定化方法，其特徵在於，步驟(2)中的所述紗布投加質量為l(T30g。
5.根據權利要求2所述一種氧化亞鐵硫桿菌固定化載體的固定化方法，其特徵在於，步驟(3)中的所述氧化亞鐵硫`桿菌Zl由中國典型培養物保藏中心保藏，簡稱CCTCC，保藏號為CCTCC NO: M 2013102，保藏日期為2013年3月25日。
6.根據權利要求2所述一種氧化亞鐵硫桿菌固定化載體的固定化方法，其特徵在於，步驟(3)中的所述氧化亞鐵硫桿菌Zl是從廣東雲浮某硫鐵礦山的酸性廢水中分離純化所得，接種菌液菌濃度為1.7 X IO7個/mL。
7.根據權利要求2所述一種氧化亞鐵硫桿菌固定化載體的固定化方法，其特徵在於，步驟(5)中的所述去除培養基的方式為重力脫水，即為打開反應器排水口直至無水滴流出。
8.權利要求2所述固定化方法得到的固定氧化亞鐵硫桿菌的紗布載體的應用，其特徵在於，所述固定氧化亞鐵硫桿菌的紗布載體應用於生物氧化，包括如下步驟:將步驟(5)所述的固定化氧化亞鐵硫桿菌的紗布繼續放入反應器中，再加入40(T500mL的9K培養基，在曝氣量為0.5~2L/min，恆溫30°C的條件下啟動反應器，待反應器運行24h後，去除培養基，重新投加40(T500mL 9K培養基，以相同的條件繼續運行反應器，如此反覆操作。
【文檔編號】C12N11/02GK103865915SQ201410061537
【公開日】2014年6月18日 申請日期:2014年2月24日 優先權日:2014年2月24日
【發明者】朱能武, 許治國, 楊崇, 吳平霄 申請人:華南理工大學