蛋白質結晶設備與蛋白質結晶方法
2023-06-27 12:30:31 1
專利名稱：蛋白質結晶設備與蛋白質結晶方法
技術領域：
本發明涉及一種蛋白質結晶設備與蛋白質結晶方法。
背景技術：
在蛋白質結構分析中用於生長蛋白質晶體的技術是非常重要的。可通過使用象X-射線衍射這樣的分析方法來識別蛋白質晶體結構。蛋白質晶體結構識別對於包含有蛋白質晶體在內的藥物的開發是必不可少的。
作為結晶蛋白質的方法，靜止條件下的結晶蛋白質方法是已知的(靜止條件下批量處理方法、液-液(自由邊界的)擴散方法、小量分離方法等等)。在通過降低蛋白質溶解度從而結晶蛋白質的方法中，將蛋白質溶液和包含沉澱劑的緩衝溶液封閉在同一容器中。當沉澱劑擴散進入蛋白質溶液時，蛋白質溶解度降低從而使蛋白質結晶。
但是，在靜止條件下的通過降低蛋白質溶解度從而結晶蛋白質的傳統方法中，難以生長出各向同性的蛋白質晶體。
而且，該蛋白質結晶過程的晶體生長速度緩慢。由於這個原因，生長蛋白質晶體需要很長時間。這是妨礙提高蛋白質結構分析效率的一個因素。
和上述描述一道，在日本公開的專利申請(JP-A-平成6-321700)中披露了一種蛋白質結晶方法。在傳統的蛋白質結晶方法中，如圖1所示將包含蛋白質的蛋白質凝膠105、包含沉澱劑的沉澱劑凝膠106、以及只包含緩衝溶液的緩衝溶液凝膠107放入容器101中。這樣，在傳統的蛋白質結晶方法中凝膠用於提供蛋白質晶體生長所必需的材料。在上述參考資料中描述指出使用凝膠的目的是為了使流體對流運動儘可能小。在容器101中，形成為夾層結構，其中沉澱劑凝膠106、緩衝溶液凝膠107、蛋白質凝膠105、緩衝溶液凝膠107、以及沉澱劑凝膠106依次分層放置。在蛋白質晶體生長期間容器101上下來回地翻轉。在傳統的蛋白質結晶方法中，沉澱劑凝膠106包含的沉澱劑通過緩衝溶液凝膠107而擴散進入蛋白質凝膠105。本發明不需要凝膠化而且是從與傳統的蛋白質結晶方法根本不同的技術。
發明內容
因此，本發明的一個目的是提供一種蛋白質結晶技術，可以更加各向同性地生長蛋白質晶體。
本發明的另一個目的是提供一種蛋白質結晶工藝，可以促進蛋白質晶體的生長。
在蛋白質晶體化設備中包括容器支承部分和旋轉部件。容器以可拆卸方式固定在容器支承部分上。旋轉部件繞著第一與第二旋轉軸旋轉容器支承部分。容器中包含有蛋白質溶液且在容器支承部分旋轉期間生長蛋白質晶體。
旋轉部件可包括第一旋轉部件，其繞著第一旋轉軸旋轉容器；以及第二旋轉部件，其繞著第二旋轉軸旋轉第一旋轉部件。在這種情況下，第一旋轉部件可包括內框架，其支承容器支承部分；以及第一電動機，其旋轉內框架。還有，第二旋轉部件可包括外框架，其上安裝有第一旋轉部件；以及第二電動機，其旋轉第一旋轉部件。
旋轉部件旋轉容器支承部分符合下面的微分方程(1)，.=A|sin|]]>.=B|sin|-----(1)]]>其中φ是與第一旋轉軸垂直的預設方向和外框架之間的角度，而θ是與第二旋轉軸垂直的預設方向和內框架之間的角度，而A與B以如下方式選擇2m/n(m與n都是正整數)不是一個整數，使n與m取最小值以符合A∶B＝n∶m的關係。
而且，理想的狀況是旋轉部件旋轉容器支承部分使得施加到容器上的重力各向同性。
而且，該容器可包括具有開口的容器部分；用於密封容器部分開口的密封部分；吸收件，其設置在容器部分中且其中吸收了沉澱劑溶液；以及扣形件(a button)，其設置在容器部分中遠離吸收件，用以保持蛋白質溶液。沉澱劑由吸收件蒸發而擴散進入容器部分內部。蛋白質溶液吸收沉澱劑從而沉澱產生蛋白質晶體。
在本發明的另一個方面，蛋白質結晶方法是通過如下步驟來實施的(a)提供容器給容器支承部分；(b)繞著第一與第二旋轉軸旋轉容器支承部分；以及(c)在容器支承部分旋轉期間生長蛋白質晶體，其中容器包含有蛋白質溶液。
可以通過如下方式實施(b)旋轉步驟繞著第一旋轉軸旋轉容器；且繞著第二旋轉軸旋轉第一旋轉部件。
還有，(b)旋轉步驟可以通過旋轉容器支承部分來實施，所述旋轉符合下面的微分方程(1)，.=A|sin|]]>.=B|sin|-----(1)]]>其中φ是關於第一旋轉軸的旋轉角度，而θ是關於第二旋轉軸的旋轉角度，而A與B以如下方式選擇2m/n(m與n都是正整數)不是一個整數，使n與m取最小值以符合A∶B＝n∶m的關係。
而且，(b)旋轉步驟可以通過旋轉容器支承部分來實施以使得重力各向同性地施加到容器上。
而且，蛋白質結晶方法還可包括提供容器。該容器包括具有開口的容器部分；用於密封容器部分開口的密封部分；吸收件，其設置在容器部分中且其中吸收了沉澱劑溶液；以及扣形件，其設置在容器部分中遠離吸收件，用以保持蛋白質溶液。沉澱劑由吸收件蒸發而擴散進入容器部分內部。(d)生長步驟可通過如下方式實施由吸收件對沉澱劑蒸發；蛋白質溶液吸收沉澱劑；以及沉澱產生蛋白質晶體。
圖1顯示了傳統的蛋白質結晶方法；圖2顯示了依照本發明實施例的蛋白質結晶設備；圖3A與3B顯示了容器的構造；圖4A是在容器旋轉條件下生長的溶菌酶晶體表面觀察圖片，而圖4B是在容器不旋轉條件下生長的溶菌酶晶體表面觀察圖片；以及圖5是顯示容器旋轉生長得到的溶菌酶晶體與容器不旋轉生長得到的溶菌酶晶體之間特徵差異的表格。
具體實施例方式
在下文中，將結合附圖詳細描述依照本發明實施例的蛋白質結晶設備。
圖2顯示了依照本發明實施例的蛋白質結晶設備。蛋白質結晶設備由三維迴轉器1與容器2組成。蛋白質晶體生長在容器2中。
三維迴轉器1包括主部件3、電動機4、外框架5、電動機6、內框架7以及容器支承部分8。主部件3包括底部3a以及支架3b與3c。支架3b和3c與底部3a連在一起。電動機4設置在支架3b。外框架5與電動機4連在一起。電動機4具有旋轉軸4a從而旋轉外框架5。電動機6設置在外框架5。內框架7與電動機6連在一起。電動機6具有旋轉軸6a從而旋轉內框架7。旋轉軸6a實質上垂直於旋轉軸4a。
容器支承部分8與內框架7連在一起。容器支承部分8與內框架7同時旋轉。容器支承部分8支承著上述的容器2。當外框架5與內框架7分別旋轉時，該容器的旋轉具有兩個旋轉軸。同時，容器2位於旋轉軸4a與旋轉軸6a的交點附近。
圖3A與3B顯示了容器2的構造。圖3A是容器2的垂直橫斷面視圖，而圖3B是容器2的沿著圖3A中A-A′線的橫斷面視圖。容器2包括容器主部件21、扣形件22以及密封件23。
如圖3A所示，在扣形件22的上表面設置空腔22a。將其中溶解了蛋白質的少量蛋白質溶液注入空腔22a。該蛋白質溶液的量典型地為20μl。使用的蛋白質溶液具有流動性。注入空腔22a的蛋白質溶液在表面張力作用下保持在空腔22a中。因此，即使旋轉容器2，蛋白質溶液也不會從空腔22a中溢流出去。這樣，用於支承蛋白質溶液的機構大大簡化了。而且，如圖3B所示，在扣形件22上設置間隙22b，從扣形件22的上表面貫穿至其下表面。
纖維素纖維24放在容器主部件21的內部。纖維素纖維24吸入了溶解了沉澱劑的沉澱劑溶液。只有一部分被吸收進入纖維素纖維24的沉澱劑經過間隙22b蒸發且擴散進入放置在空腔22a中的蛋白質溶液。當沉澱劑擴散進入蛋白質溶液時，蛋白質的溶解度下降從而從蛋白質溶液中結晶出蛋白質。
纖維素纖維24吸入了沉澱劑溶液因此當容器2旋轉時沉澱劑溶液不會滲流出來。這就防止了沉澱劑溶液與注入空腔22a中的蛋白質溶液在容器2旋轉時接觸。
開口21a設置在容器主部件21。蛋白質溶液與沉澱劑溶液由開口21a注入容器2。密封件23密封開口21a從而使容器2內部保持密封狀態。
下面，將描述蛋白質晶體的生長步驟。
首先，將蛋白質溶液與沉澱劑溶液注入容器2。蛋白質溶液注入在上述的空腔22a中。而且，沉澱劑溶液被吸收進入纖維素纖維24中。然後，用密封件23封住開口21a從而密封容器2。然後，將容器2裝入容器支承部分8。
之後，電動機4與電動機6分別旋轉外框架5與內框架7。容器2的旋轉具有兩個旋轉軸。在容器2的旋轉期間，沉澱劑在容器2中蒸發。蒸發的沉澱劑通過設置在扣形件22上的間隙22b擴散進入被注入在空腔22a中的蛋白質溶液。當沉澱劑擴散進入蛋白質溶液時，蛋白質在蛋白質溶液中的溶解度降低從而產生蛋白質結晶。這個時候，因為容器2在蛋白質結晶化期間處於旋轉狀態，所以蛋白質晶體各向同性地生長。
下面的兩個理由可以解釋為什麼通過旋轉容器2可以使蛋白質晶體生長各向同性。第一個理由是，據估計蛋白質溶液輕輕流動使蛋白質濃度變得均勻了。為了蛋白質晶體生長各向同性，蛋白質溶液的蛋白質濃度均勻是必需的。通過旋轉容器2，蛋白質溶液輕輕流動使蛋白質濃度變得均勻了。因此，估計蛋白質晶體的生長各向同性。第二個理由是，生長的蛋白質晶體不會落到容納蛋白質溶液的容器的底部而且也永遠不會粘附在該容器的壁上。假如該蛋白質晶體落在容器上或粘附在壁上，晶體的生長在接觸面上就會受到阻礙。如此，蛋白質晶體的生長就不會是各向同性的。據估計，容器2的旋轉可阻止蛋白質晶體的沉澱以及粘附到壁上，因此使得蛋白質晶體的生長各向同性。
而且，通過旋轉容器2，可獲得較大的蛋白質晶體。這個理由未必清楚。但是，當旋轉容器2時，據估計只有部分蛋白質晶體的晶核選擇性地生長從而晶核生長為大的蛋白質晶體。
需要電動機4與電動機6分別旋轉外框架5與內框架7以使得施加到容器2的重力各向同性。那即，當在一段足夠長的時間內觀察容器2時，需要施加到容器2上的重力在各個方向上都是均勻的。這使得蛋白質晶體的生長更加各向同性。
如下所述，需要電動機4與電動機6分別旋轉外框架5與內框架7。假定φ是與旋轉軸4a垂直的任意方向和外框架5之間的角度。而且假定θ是與旋轉軸6a垂直的任意方向和內框架7之間的角度。這時，外框架5與內框架7旋轉，其角度φ與θ符合下面的微分方程，.=A|sin|]]>.=B|sin|-----(1)]]>應當注意到，φ與θ的初始值是任意的。還有，A與B以如下方式選擇2m/n不是一個整數，使n與m取最小值以符合A∶B＝n∶m的關係。
當角度φ與θ的設定符合微分方程(1)時，重力是各向同性地施加到容器2上的。該理由在由本發明受讓人提交的日本公開的專利申請(JP-P2000-79900A)中有描述。
然後，在這個實施例中說明了通過蛋白質結晶設備生長蛋白質晶體的一個示例。
將其中溶解有溶菌酶的溶菌酶溶解緩衝溶液用作蛋白質溶液。溶菌酶溶解緩衝溶液的溶菌酶濃度是80mg/ml。將乙酸與乙酸鈉作為緩衝劑溶入溶菌酶溶解緩衝溶液。乙酸與乙酸鈉的濃度分別都是50mM。製成的溶菌酶溶解緩衝溶液的pH值為4.7。
將其中溶解有氯化鈉的氯化鈉溶解緩衝溶液用作沉澱劑溶液。氯化鈉的濃度是1.0M。將乙酸與乙酸鈉作為緩衝劑溶入氯化鈉溶解緩衝溶液。乙酸與乙酸鈉的濃度分別都是50mM。製成的氯化鈉溶解緩衝溶液的pH值為4.7。
將溶菌酶溶解緩衝溶液20μl注入扣形件22的空腔22a中。而且，將氯化鈉溶解緩衝溶液300μl吸收進入纖維素纖維24。用密封件23封住容器2且將容器2固定到容器支承部分8上。
當三維迴轉器1開始動作時溶菌酶晶體也就開始生長。以平均旋轉速度約1.5rpm繞著旋轉軸4a旋轉外框架5。以平均旋轉速度約1.7rpm繞著旋轉軸6a旋轉內框架7。這樣，容器2的旋轉具有兩個旋轉軸，因此施加到其上的重力各向同性。當容器2旋轉期間容器2保持恆定溫度約20℃。旋轉持續約90個小時。之後，取出得到的溶菌酶晶體。
作為一個對比實驗，執行一個類似的實施例，只是容器2不旋轉。
對得到的溶菌酶晶體執行晶體結構分析，諸如測量晶體的尺寸大小、外觀觀測、密度測量以及X射線衍射。
通過外觀觀測發現，通過旋轉容器2獲得的溶菌酶晶體更加各向同性。圖4A是在容器2旋轉條件下生長的溶菌酶晶體的表面觀察圖片。圖4B是在容器2不旋轉條件下生長的溶菌酶晶體的表面觀察圖片。在容器2旋轉條件下生長的溶菌酶晶體具有比較光滑的表面。這表明溶菌酶晶體的生長通過旋轉容器2更加各向同性。
而且，發現旋轉或不旋轉容器2對作為晶體尺寸測量結果的溶菌酶晶體尺寸大小有影響。在容器2旋轉的條件下獲得尺寸大於200μm的溶菌酶晶體和尺寸小於20μm的溶菌酶晶體。另一方面，在容器2不旋轉的條件下獲得的溶菌酶晶體尺寸範圍為50-100μm。這表明只有部分溶菌酶晶體的晶核選擇性地生長且表明當容器2旋轉時該晶核生長為大的溶菌酶晶體。
作為密度測量與晶體結構分析的結果，發現旋轉或不旋轉容器2對溶菌酶晶體密度、品格結構以及微晶都沒有影響。圖5顯示了獲得的溶菌酶晶體的特徵。不管是否旋轉容器2，生成的溶菌酶晶體的密度均約為1.25g/ml。發現X-射線分析結果表明不管是否旋轉容器2，所獲得的溶菌酶晶體都具有四方晶系的晶體結構且其點群為P43212。而且，作為X-射線分析結果，不管是否旋轉容器2，生成的溶菌酶晶體的單位晶胞的大小尺寸大致彼此相同。而且，作為鑲嵌擴散的觀察結果，發現鑲嵌係數為0.2且彼此相同。而且，用X射線照射獲得的溶菌酶晶體以產生布喇格反射。此時，發現任意溶菌酶晶體的最大解析度都等於或大於約1.4且彼此大致相同。因此，發現旋轉容器2不會對所獲得溶菌酶晶體的微晶產生不利的影響。
本發明提供了促進蛋白質晶體生長的蛋白質結晶技術。
而且，本發明提供了蛋白質晶體可以更加各向同性生長的蛋白質結晶技術。
權利要求
1.一種蛋白質結晶設備，其包括容器支承部分，其上以可拆卸方式固定有至少一個容器；以及旋轉部件，其繞著第一與第二旋轉軸旋轉所述容器支承部分，其中所述容器包含有蛋白質溶液且在所述容器支承部分旋轉期間生長蛋白質晶體。
2.依照權利要求1所述的蛋白質結晶設備，其中所述旋轉部件包括第一旋轉部件，其繞著所述第一旋轉軸旋轉所述容器；以及第二旋轉部件，其繞著所述第二旋轉軸旋轉所述第一旋轉部件。
3.依照權利要求2所述的蛋白質結晶設備，其中所述第一旋轉部件包括內框架，其支承所述容器支承部分；以及第一電動機，其旋轉所述內框架，並且所述第二旋轉部件包括外框架，其上安裝有所述第一旋轉部件；以及第二電動機，其旋轉所述第一旋轉部件。
4.依照權利要求3所述的蛋白質結晶設備，其中所述旋轉部件旋轉所述容器支承部分以符合下面的微分方程(1)，.=A|sin|]]>.=B|sin|]]>...(1)其中φ是與所述第一旋轉軸垂直的預設方向和所述外框架之間的角度，而θ是與所述第二旋轉軸垂直的預設方向和所述內框架之間的角度，而A與B以如下方式選擇2m/n(m與n都是正整數)不是一個整數，使n與m取最小值以符合A∶B＝n∶m的關係。
5.依照權利要求1-4中任意一個所述的蛋白質結晶設備，其中所述旋轉部件旋轉所述容器支承部分，使得施加到所述容器上的重力各向同性。
6.依照權利要求1-4中任意一個所述的蛋白質結晶設備，其中所述容器包括具有開口的容器部分；密封所述容器部分的所述開口的密封部分；吸收件，其設置在所述容器部分中且其中吸收了沉澱劑溶液，沉澱劑由所述吸收件蒸發而擴散進入所述容器部分內部；以及扣形件，其設置在所述容器部分中遠離所述吸收件，用以保持所述蛋白質溶液，所述沉澱劑由所述蛋白質溶液吸收從而沉澱產生蛋白質晶體。
7.一種蛋白質結晶方法，其包括步驟(a)提供容器給容器支承部分；(b)繞著第一與第二旋轉軸旋轉所述容器支承部分；以及(c)在所述容器支承部分旋轉期間生長蛋白質晶體，其中所述容器包含有蛋白質溶液。
8.依照權利要求7所述的蛋白質結晶方法，其中所述(b)旋轉步驟包括步驟繞著所述第一旋轉軸旋轉所述容器；以及繞著所述第二旋轉軸旋轉所述第一旋轉部件。
9.依照權利要求7所述的蛋白質結晶方法，其中所述(b)旋轉步驟包括步驟旋轉所述容器支承部分以符合下面的微分方程(1)，.=A|sin|]]>.=B|sin|]]>...(1)其中φ是關於所述第一旋轉軸的旋轉角度，而θ是關於所述第二旋轉軸的旋轉角度，而A與B以如下方式選擇2m/n(m與n都是正整數)不是一個整數，使n與m取最小值以符合A∶B＝n∶m的關係。
10.依照權利要求7-9中任意一個所述的蛋白質結晶方法，其中所述(b)旋轉步驟包括步驟旋轉所述容器支承部分使得施加到所述容器上的重力各向同性。
11.依照權利要求7-9中任意一個所述的蛋白質結晶方法，還包括步驟提供所述容器，所述容器包括具有開口的容器部分；密封所述容器部分的所述開口的密封部分；吸收件，其設置在所述容器部分中且其中吸收了沉澱劑溶液，沉澱劑由所述吸收件蒸發而擴散進入所述容器部分內部；以及扣形件，其設置在所述容器部分中遠離所述吸收件，用以保持所述蛋白質溶液，且其中所述(d)生長步驟包括如下步驟由所述吸收件蒸發所述沉澱劑；所述蛋白質溶液吸收所述沉澱劑；以及沉澱產生所述蛋白質晶體。
全文摘要
蛋白質結晶設備和蛋白質結晶方法。蛋白質結晶設備由容器支承部分(8)與旋轉部件(1)組成。容器(2)可拆卸地固定在容器支承部分上。旋轉部件繞著第一與第二旋轉軸(4a、6a)旋轉容器支承部分。該容器由以下部分組成:具有開口的容器部分;密封所述容器部分的所述開口的密封部分;吸收件,其設置在容器部分中且其中吸收了沉澱劑溶液;以及扣形件,其設置遠離吸收件用以保持所述蛋白質溶液。在容器支承部分旋轉期間沉澱劑蒸發而擴散進入容器部分內部。蛋白質溶液吸收沉澱劑從而沉澱產生蛋白質晶體。
文檔編號C30B30/08GK1381618SQ0211869
公開日2002年11月27日 申請日期2002年4月12日 優先權日2001年4月12日
發明者植村勝 申請人:三菱重工業株式會社