用於免疫抑制藥物的單受體測定方法
2023-06-27 20:47:36 2
專利名稱：：用於免疫抑制藥物的單受體測定方法
技術領域：
：本發明涉及治療藥物監控領域，尤其涉及免疫抑制藥物的檢測和定量測定方法。
背景技術：
：免疫抑制藥物用於抑制或阻滯免疫系統反應性的免疫抑制療法。在臨床上，用它們預防器官和組織(例如固髓、心臟、腎臟、肝臟)移植排斥和治療自身免疫性疾病或極可能由自身免疫引起的疾病(例如類風溼性關節炎、重症肌無力、系統性紅斑狼痴、節段性迴腸炎和潰瘍性結腸炎)。免疫抑制藥物例如FK506(他克莫司)和雷帕黴素(西羅莫司)的單受體測定方法已使用親免素例如FKBP(FK結合蛋白)，但FKBP對一種以上免疫抑制藥物或惰性代謝物出現明顯的交叉反應性。因為通常按互相聯合的形式給予免疫抑制藥物，所以對母體藥物的特異性至關重要，前述測定方法在通常治療藥物監控中受到嚴格限制。可通過使用用於單受體測定的特異性FKBP解決該問題。有人曾試圖通過開發使用抗體的單受體測定法，即專用於目的免疫抑制藥物的免疫測定法解決該問題。儘管證實免疫測定對母體藥物具有良好選擇性，但它們通常對一種或多種惰性代謝物出現明顯交叉反應性。當與色語參比測定對比時，這種交叉反應性在免疫測定中易出現不必要的正偏差。仍然需要對免疫抑制藥物具有專屬性、靈敏性和穩定性的測定方法，尤其需要可用於高通量臨床分析儀器的此類測定方法。已知FKBP25對雷帕黴素具有特異性，但該性質未曾用於對雷帕黴素的特異性測定中。對雷帕黴素(西羅莫司)和FK506(f也克莫司)均具有高交叉反應性的FKBP已用於多相單受體測定。對免疫抑制藥物使用抗體的均相或多相形式的單受體測定在本領域中已知。發明概述在以上背景下，本發明提供了相對於現有技術的某些不明顯的優點和改進。尤其認識到需要改進對免疫抑制藥物的單受體測定方法。儘管本發明不限於特定的優點或功能，但應指出，本發明提供了對免疫抑制藥物按單受體形式使用FKBP的高特異性均相測定方法。該最簡單形式利用了類似於竟爭性免疫測定的單受體。因此，用親免素代替抗體，建立了藥物綴合物和藥物之間對有限數目的親免素結合位點產生竟爭的關係。對於微粒凝集測定，使親免素與粒子結合或為溶液形式。在其中親免素與粒子結合的情況下，將藥物的多價綴合物加入待分析的樣品中。在其中親免素為溶液形式的情況下，使綴合物與粒子結合，並使親免素二聚(或聚合)以便橋接粒子。該過程通過融合蛋白技術或化學交聯完成。對於雷帕黴素和他克莫司藥物，單受體形式的主要難點是特異性，因為與這些藥物結合的親免素類即所謂的FK結合蛋白或FKBP通常區分雷帕黴素和他克莫司的程度很不明顯，因為存在藥物結構相似性。一個例外是FKBP25,它是雷帕黴素選擇性親免素。據報導，在肽基-脯氨醯異構酶(旋轉異構酶)測定中，雷帕黴素的Ki為0,9nM,而他克莫司的Ki為200nM(J.Liangetal,J.爿w.C72em.Soc.118.1231-1232,1996)。對於他克莫司，可以通過基因工程製備選擇性FKBP12突變體(參見M.T.DeCenzoetal,￡"g/weeh"g,9，173-180，1996)。或者，據報導，他克莫司的FKBP14Kd(即1.8nM)低於西羅莫司的(40nM)約1/20(Davis,D.etal.,C/z".772era/ew"^22,Suppl.B,B62畫B70,2000)，按照該報導，建議FKBP14為FK506(他克莫司)單受體測定的備選。本發明的第二方面是對免疫抑制藥物按單受體形式使用FKBP的靈敏的均相測定方法。預計，可通過使用被測免疫抑制藥物、其它免疫抑制藥物或免疫抑制藥物片段的二聚綴合物增加靈敏度。例如，可通過C-40位使雷帕黴素與多種連接體二聚，和用於雷帕黴素單受體測定，用FKBP25代替通常負載兩種以上藥物的氨基葡聚糖綴合物。預計，游離的雷帕黴素與這些二聚綴合物竟爭比與典型的氨基葡聚糖綴合物竟爭好。C-端FKBP25肽FKBP25C,P109-D224(J.Liangetal.)也可用於雷帕黴素測定。據J.Liang等報導"TheN-terminaldomaindoesnotinfluencethebindingspecificitysincetheC-terminaldomainshowsthesamebindingpreferencesastheflilllengthprotein"(N-端域不影響結合特異性，因為證實C-端域的結合優先度與全長蛋白相同)。FKBP25的N-端域(接近P109的13kDa肽)可位於結合的雷帕黴素的C-40位附近，可阻礙或減少在C-40位綴合的氨基葡聚糖雷帕黴素物的結合，因此降低測定靈敏度。使用FKBP25C的優點是可提高穩定性，因為丄Liang作者在論文的補充材料中聲稱，"RecombinanthFKBP25isunstableanddegradesrapidlyfollowingpurification.Withtime,onlyamixtureoffragmentswithmolecularweightsfrom13.7to15kDacanbeidentifiedintheoriginalFKBP25sample"(重組hFKBP25不穩、定，純化後迅速降解。隨時間推移，只能鑑定原始FKBP25樣品中的13.7-15kDa分子量片段的混合物)。FKBP25C的另一個潛在的優點是可略微減少pi,因為FKBP25的N-端域富含鹼性胺基酸(Galatet.a1.1992)。較低pi可減少與患者樣品中蛋白(具有低pl)非特異性結合。作為GST(穀胱苷肽S-轉移酶)融合蛋白的FKBP25和FKBP25C各自可用於雷帕黴素測定。含GST的全胺基酸序列的融合蛋白可形成二聚體(AmershamBiosciences,GSTGeneFusionSystemHandbook,p27)。發現GST本質上是二聚酶(D.B.Smith,K.S.Johnson,Ge"e，67,31,1988)。使用二聚FKBP25的優點是提高對雷帕黴素測定的靈敏度。FKBP25-GST或FKBP25C-GST融合蛋白二聚的結果是每個大分子形成兩個結合位點，可使其與類似於抗體的兩個相同配體交聯或結合。可在溶液中，用二聚FKBP25-GST或FKBP25C-GST融合蛋白與雷帕黴素偶聯的微粒交聯或使微粒凝集。樣品中的雷帕黴素可在溶液中與二聚FKBP25-GST或FKBP25C-GST結合，從而抑制雷帕黴素偶聯的微粒凝集。按照本發明的一個實施方案，提供測定樣品中目標免疫抑制藥物的存在或量的方法，該方法包括以下步驟提供可能含有免疫抑制藥物的樣品，將免疫抑制藥物的特異性親免素受體、含免疫抑制藥物或免疫抑制藥物的類似物的綴合物和大分子載體加入樣品中，其中目標免疫抑制藥物與綴合物竟爭有限數目的受體結合位點；測量與親免素結合的綴合物量，並將測得的綴合物量與樣品中的免疫抑制藥物的存在或量進行相關性分析。在本發明的另一個實施方案中，提供測定樣品中目標免疫抑制藥物的存在或量的方法，該方法包括以下步驟提供可能含有免疫抑制藥物的樣品，將免疫抑制藥物的特異性親免素受體和外源性免疫抑制藥物或藥物類似物加入樣品，其中親免素是二聚體，且其中免疫抑制藥物和外源性藥物或藥物類似物竟爭有限數目的受體結合位點；和測量與親免素結合的外源性藥物或藥物類似物的量，作為對樣品中免疫抑制藥物的存在或量的測量。根據以下本發明詳述和權利要求，可更全面理解本發明的這些和其它特徵及優點。應指出，權利要求的範圍由其中的描述而非本說明書中列舉的特徵和優點的具體論述限定。附圖簡述當結合以下附圖閱讀時，可最準確地理解以下本發明實施方案的詳述，其中圖l舉例說明代表性的本發明氨基葡聚糖綴合物。圖2舉例說明氨酯連接的雷帕黴素氨基葡聚糖綴合物的製備。圖3舉例說明酯連接的雷帕黴素氛基葡聚糖綴合物的製備。圖4舉例說明具有PEG連接體的雷帕黴素氨基葡聚糖綴合物的製備。圖5舉例說明雷帕黴素二聚體的製備。圖6舉例說明雷帕黴素生物素的製備。圖7顯示實施例14中所述劑量-反應曲線。發明詳述應指出，本文中的術語如"優選"、"一般"和"通常"不用來限制要求保護的本發明的範圍，或不暗示某些特徵對要求保護的本發明的結構或功能而言關4定、必需或甚至重要。這些術語僅強調可或不可用於本發明特定實施方案的備選或其它特徵，更為合適。本文中使用的術語"檢測粒子"是指任何通常具有球形且直徑為約10nm-約1000nm的粒子，這種粒子允許人在均相測定中區分聚集狀態和非聚集狀態。檢測粒子的大小(直徑)可以為納米或微米級，但為方便起見，所有此類粒子在本文中均稱為"微粒"。檢測粒子包括微粒和納米殼體。可將檢測粒子的表面官能化，各種化合物可附著在該表面上，這些化合物包括例如螢光團、化學發光實體、抗體、生物素或鏈黴抗生物素。表位是抗原分子表面上的區域，抗原分子刺激特異性免疫反應並4氐抗該反應涉及的作用。表位標記是重組DNA方法，通過該方法，使通過克隆基因編碼的蛋白對已知抗體產生免疫反應。用親和基質和特異性抗體開發的融合標記系統為易於純化和檢測重組蛋白提供了很大的適應性。表位標記的範圍為10-15胺基酸長度，設計其構建蛋白的分子柄。通常將它們置於氨基或^免基末端，以使對三級結構的任何潛在破壞減至最小，並因此發揮蛋白功能。因為標記很小，它們也不可能妨礙重組蛋白的結構和功能。因此，在進行隨後的實驗前，通常無須除去表位標記。已使用過多種不同的標記例如His6(對含金屬離子如Ni+2或Co+2的基質具有強親和力的6個組氨酸序列)、HA(由人流感病毒血凝素蛋白衍生的肽序列)和AviTag，它是可通過大腸桿菌(Eco/z')生物素蛋白連接酶(BirA)在其內賴氨酸殘基上被酶促單生物素化的序列。可將BirA酶加入表達混合物中，原位進行生物素化。術語"特異性結合"是指兩個成對物質之間的高結合力和/或高親和力結合，它們包括例如此類成對物質例如配體/目標部分、酶/底物、受體/激動劑、抗體/抗原和凝集素/碳水化合物。可通過共價或非共價相互作用或共價和非共價相互作用的組合介導結合相互作用。尤其是，特異性結合的特徵在於成對中的一個成員只與結合成員中相應成員所屬化合物家族的特定化合物結合而不與其它化合物結合。因此，例如優選抗體與蛋白質家族的單個表位結合而不與其它表位結合。本文中使用的術語"受體"或"結合部分"是指與目標化合物特異性結合的蛋白或糖蛋白而非抗體。受體的一個實例是與免疫抑制藥物結合的親免素。本文中使用的術語"納米殼體"是指塗布超薄金屬(例如金)層的由介電芯(例如二氧化矽或磷酸鈣)組成的微粒。適用於本發明的納米殼體的直徑選自約10nm-約250nm。可將微粒表面官能化，且可使各種化合物附著在該表面，這些化合物包括例如抗體或鏈黴抗生物素。本文中使用的術語"微粒"是指直徑約100nm-約1000nm的固體粒子。通常用於本發明的微粒的直徑為約100nm-約600nm。微粒可由多種物質形成，它們包括聚苯乙烯和膠乳微粒，任選將微粒的表面官能化，且可使各種化合物附著在該表面，這些化合物包括例如抗體或鏈黴抗生物素。本文中使用的術語"抗體"是指由至少一個結合域組成的多肽或多肽的基團，其中抗體結合域由抗體分子的可變域摺疊形成，形成具有與抗原的抗原決定簇特徵互補的內表面形狀和電荷分布的三維結合空間，使其與抗原進行免疫反應。除另有說明外，通常涉及抗體時包括多克隆抗體和單克隆抗體。術語"抗體"還包括含結合域和抗體片段的重組蛋白，抗體片段包括Fab、Fab'、F(ab)2和F(ab')2片段。本文中使用的"連接體"是使兩個分開的實體互相連接的鍵、分子或分子團。連接體可為兩種實體提供最佳間距，或還可提供將兩種實體彼此分開的不穩定鍵。不穩定鍵包括可光致斷裂的基團、對酸不穩定的部分、對鹼不穩定的部分和可酶解離的基團。本文中使用的術語"均相測定"是指測定樣品中化合物的存在或濃度的定性或定量試驗，其中為了檢測或測量目標化合物濃度，未反應的試驗試劑無須與已與目標化合物反應的試劑分離。本文中使用的通用術語"親免素"是指與免疫抑制藥物特異性和可逆性結合的任何不為抗體的蛋白受體。例如，該術語將包括與免疫抑制藥物環孢素、他克莫司、雷帕黴素和依維莫司結合的已知蛋白受體，它們包括FK506結合蛋白(FKBP)、親環蛋白、鍋調-疇酸酶和雷帕黴素靶(TOR)蛋白，或與免疫抑制藥物結合的那些親免素的類似物。此類類似物包括保留對母體親免素的目標免疫抑制藥物的高親和力但代表母體蛋白片段的蛋白，或融合蛋白(包含至少一部分母體蛋白)，或是母體親免素的衍生物，此類衍生物相對於母體蛋白包括一個或多個胺基酸替代、缺失或插入。本文中使用的"免疫抑制藥物類似物"是指母體免疫抑制藥物的二聚體、片段、二聚片段或其它衍生物，它們保留對母體藥物的親免素的高親和力。本文中使用的術語"雷帕黴素-特異性FKBP"是指與雷帕黴素可逆性和特異性結合的蛋白。雷帕黴素-特異性FKBP的實例包括FKBP25、FKBP25C、FKBP25和FKBP25C的片段；和含FKBP25和與雷帕黴素結合的FKBP25片段的融合蛋白。術語"外源性免疫抑制藥物"是指原本不存在於用於分析免疫抑制藥物存在的樣品中但通常在測定期間以綴合物的形式加入的免疫抑制藥物。外源性免疫抑制藥物綴合物作為樣品中免疫抑制藥物的竟爭劑與親免素結合。本文中使用的術語"大分子載體"是指多支鏈聚合物骨架(包括例如多肽或碳水化合物)，該骨架可與兩種或多種化合物連接，同時允許連接的化合物各自與其對應的受體特異性結合。本文中使用的術語"螢光能量轉移關係"是指供體和受體焚光團彼此相距足夠近，以致當供體螢光團被入射光激發時，供體的激發態能量轉移至受體螢光團。本發明涉及檢測和測定存在於樣品中的免疫抑制藥物(目標藥物)量的均相竟爭性測定方法。按照一個實施方案，樣品是指生物流體例如從患者回收的血液。該測定方法包括使樣品與綴合物(含與第二部分連接的免疫抑制藥物類似物)和目標藥物的特異性受體蛋白混合。綴合物與存在於樣品中的游離的免疫抑制藥物竟爭結合受體蛋白，混合步驟後，通過檢測與受體蛋白結合的綴合物的量確定樣品中免疫抑制藥物的初始濃度。通常，將作為不同成分的兩種測定試劑(即蛋白受體和綴合物)加入樣品；但是在一個實施方案中，將兩種試劑作為單一組合物加入。用標記物標記受體蛋白或綴合物，當受體與綴合物結合後，該標記物產生可檢測信號。存在於樣品中的免疫抑制藥物與綴合物竟爭結合受體蛋白，導致產生的信號與存在於樣品中的免疫抑制藥物的濃度成比例減少。因此，本文中公開的方法無須純化或洗滌步驟即可測定存在於樣品中的藥物量。記系統，它們適用於已^^開的組合物和方法。在一個實施方案中，該方法包括基於粒子的均相測定方法，其中使受體蛋白(例如親免素)或免疫抑制藥物綴合物與檢測粒子結合。受體蛋白與綴合物類物質結合導致凝集，而存在於樣品中的免疫抑制藥物與受體結合取代或阻止綴合物與受體蛋白結合，導致凝集減少。在該實施方案中，可根據測得的凝集量確定存在於樣品中的免疫抑制藥物量。更尤其是，樣品中的免疫抑制藥物將與免疫抑制藥物綴合物竟爭結合受體蛋白，以使樣品中存在的免疫抑制藥物量增加將導致凝集量減少，可通過標準濁度分析檢測凝集量。在一個實施方案中，用檢測粒子標記受體蛋白，免疫抑制藥物綴合物包含通過連接體結合在一起的兩種或多種免疫抑制藥物化合物(或兩種免疫抑制藥物類似物)。在一個實施方案中，免疫抑制藥物綴合物含有與大分子載體結合的多種免疫抑制藥物化合物。按照一個實施方案，大分子載體是氨基葡聚糖。但是，任何聚合物結構均可用作大分子載體，條件是大分子載體允許多種免疫抑制藥物化合物按可使免疫抑制藥物與其對應的親免素特異性結合的形式與載體偶聯。或者，免疫抑制藥物可形成二聚體而不與大分子載體結合。例如，雷帕黴素可通過C-40位與多種連接體二聚，在雷帕黴素單受體測定中用該二聚體代替氨基葡聚糖綴合物。預計游離的雷帕黴素與這些二聚綴合物的竟爭比與典型的氛基葡聚糖綴合物的竟爭更好。在另一個實施方案中，綴合物類物質含有與檢測粒子結合的目標免疫抑制藥物，受體蛋白為將兩種或多種受體蛋白互相連接的複合物形式。在一個實施方案中，受體蛋白多聚體是由兩種受體蛋白之間形成的二聚體，這些受體蛋白對目標免疫抑制藥物有特異性。在另一個實施方案中，受體蛋白多聚體含有多種互相連接的受體蛋白，以使各連接受體蛋白維持其與免疫抑制藥物特異性結合的能力。在備選的實施方案中，檢測受體蛋白與免疫抑制藥物綴合物結合的測定步驟使用螢光或化學發光檢測系統，包括例如螢光共振能量轉移(FRET)。FRET基於供體螢光團的激發態能量到受體焚光團的距離依賴性轉移。供體螢光團通過入射光激發，如果受體在20A-60A內，可轉移供體的激發態能量。超出分子間距最佳範圍，能量轉移效率按間距的6次方的倒數下降。該轉移導致供體的螢光強度和激發態的壽命減少，和受體的發射強度增加(Selvin,P.R.,A^wre5Vn/"wra/5zo/ogy,2000,7,9,730-734)。該測定形式需要FRET螢光團對中的一個成員與受體蛋白偶聯，另一個與綴合物偶聯。供體螢光團例如銪和受體螢光團例如Cy5已在用340nm波長光激發和665nm發射光檢測中使用(Pulli,T.,et.al.,v4wa"ca/C/2em/對^y,2005,77,2637-2642)。可用幾種市售試劑盒將蛋白用供體和受體螢光團標記。例如，LANCEEu-W1024-ITC螯合物(PerkinElmer,AD0013)對於用銪共價標記具有至少一個伯脂肪胺(N-端或賴氨酸殘基)的蛋白最佳。另外，CyDyeCy5單-反應性染料包(Amersham,產品代碼PA23500)可用於用Cy5共價標記蛋白上的氨基。可用其它化學品通過M(用NHS酯染料)、巰基(用馬來醯亞胺染料)或醛基(用醯肼染料)確保標記。當用螢光共振能量轉移(FRET)螢光團對中的一個相應成員標記受體蛋白和綴合物時，受體蛋白與綴合物的結合致使兩個螢光團相互足夠接近，以致用激發光激發供體螢光團時發生螢光能量轉移。可通過檢測供體螢光團發射減少或受體螢光團發射增加，測量這種事件。當存在游離藥物時，螢光共振能量轉移^皮游離藥物與標記綴合物對標記受體上有限數目的結合位點的竟爭抑制。在本發明另一個實施方案中，螢光偏振受體法和試驗試劑盒包括利用螢光偏振原理檢測免疫抑制藥物的備用液體試劑。在該測定形式中，將免疫抑制藥物用螢光團標記，在緩衝系統中配製相應的親免素受體。在反應溶液中，含藥物-螢光團的免疫抑制藥物和樣品中的任何游離免疫抑制藥物之間發生與有限量的相應特異性親免素結合的竟爭反應。當用適當波長(激發波長)的光照射螢光分子或螢光團時，發射某種光，儘管在較長波長處發射(發射波長)。發射光是否偏振取決於螢光團在溶液中旋轉的自由度。在光發射發生前，小分子例如焚光黃可迅速旋轉，導致發射光消偏振。相反，焚光大分子例如與親免素結合的螢光黃標記的免疫抑制藥物旋轉緩慢得多。因此，在激發和發射之間的時間框，大分子僅非常輕微的旋轉，發射光會偏振。螢光偏振是藥物濃度的重現性函數，適合定量測定樣品中的藥物濃度。因此，在該測定形式中，當樣品中免疫抑制藥物水平升高時，螢光偏振量減少。在本發明中，樣品可以是據信含有免疫抑制藥物的任何水性樣品。在一個實施方案中，樣品是從患者中分離的體液，它們包括此類流體例如血液、血漿、血清、尿液、精液、腦脊液、唾液等。在一個實施方案中，樣品是全血。在一個實施方案中，將血液樣品預處理以使樣品與測定試劑接觸前釋放細胞結合的免疫抑制藥物。更尤其是，在一個實施方案中，用含曱醇和硫酸鋅水溶液的溶液萃取血樣，在將樣品與檢測試劑混合前，將細胞碎片除去。當以全血為樣品並按照微粒凝集檢測法測定時，通常在使樣品與測定試劑接觸前，將血樣預處理以便釋放細胞結合的藥物。該方法包括使全血樣品與沉澱試劑混合。沉澱試劑選自本領域中已知的那些試劑，它們包括例如硫酸銅水溶液或溶於以下溶劑的硫酸鋅溶液曱醇、乙醇、乙二醇、乙腈或類似的水混溶性有機溶劑。然後將全血混合物充分混合，離心。然後將澄清上清液轉移到樣品杯中，放在分析儀器上進行測定。在一個實施方案中，用於預處理全血樣品的組合物包含曱醇和硫酸鋅。將樣品預處理後，除去細胞碎片，然後加入測定試劑。在一個實施方案中，通過低速(約12,000rpm)離心5分鐘將細胞碎片除去。在一個實施方案中，用凝集測定檢測免疫抑制藥物，其中檢測粒子是納米殼體，在加入測定試劑前，血樣未經預處理。按照一個實施方案，定量測定存在於溶液中的免疫抑制藥物量的方法包括使樣品與免疫抑制藥物綴合物和目標免疫抑制藥物的特異性親免素混合。在一個實施方案中，綴合物包含與大分子載體結合的目標免疫抑制藥物(或免疫抑制藥物類似物)，並且親免素與檢測粒子結合，其中存在於樣品中的免疫抑制藥物與綴合物竟爭結合親免素。然後通過檢測懸浮液中出現的凝集物的量，直接測量與親免素結合的綴合物量。然後將測得的凝集量與存在於樣品中的免疫抑制藥物量進行相關性分析。按照一個實施方案，大分子栽體是氨基葡聚糖，檢測粒子是微粒或納米殼體。按照一個實施方案，將受體蛋白表達為含肽序列的重組融合蛋白，該序列代表用於使檢測粒子或其它檢測部分與受體蛋白連接的配體或標記。在一個實施方案中，融合蛋白提供與生物素分子連接的最佳位點。在該實施方案中，用鏈黴抗生物素或抗生物素蛋白標記的檢測粒子使檢測粒子與受體蛋白結合。例如，受體蛋白可以是含具有生物素化信號序列的融合伴侶的重組蛋白。在大腸桿菌(五.CO/Z)中或在無細胞系統中用生物素連接酶例如AviTag共表達該融合蛋白，該連接酶例如AviTag催化生物素部分與信號序列中的賴氨酸殘基共價加成。在一個實施方案中，用於測定的受體蛋白是AviTagged生物素標記的蛋白，其中AviTagged序列通過C-端或N-端連接。可用本文中所述方法，用那些藥物的特異性受體蛋白檢測選自以下的免疫抑制藥物環孢素、他克莫司、雷帕黴素和依維莫司。在一個實施方案中，為定量測定樣品中雷帕黴素或依維莫司的量提供凝集測定試劑。在該實施方案中，蛋白受體包括與檢測粒子結合的雷帕黴素-特異性FKBP。用標準技術包括共價結合、4支動結合或通過次級結合相互作用，使雷帕黴素-特異性FKBP與檢測粒子綴合，例如生物素/(鏈黴)抗生物素蛋白。在一個實施方案中，檢測粒子是微粒，在再一個實施方案中，檢測粒子通過生物素-鏈黴抗生物素或生物素-抗生物素蛋白鍵與親免素結合。可購買或通過用活化微粒和與一定量的鏈黴抗生物素反應，製備鏈黴抗生物素微粒。按照一個實施方案，雷帕黴素-特異性FKBP選自FKBP25和FKBP25C。含與氨基葡聚糖(AD)或備選的大分子載體即肽、蛋白和其它多糖綴合的雷帕黴素的綴合物作為其它測定試劑使用。代表性的氨基葡聚糖綴合物如圖1所示。圖2、3和4描述雷帕黴素的氨基葡聚糖綴合物的合成。用氯甲酸對硝基苯酯在吡啶中將雷帕黴素中C-40位的羥基活化。在二甲基氨基吡啶的存在下，在DMSO中，使產物與氨基葡聚糖偶聯。圖2描述氨基葡聚糖-雷帕黴素綴合物通過C-40位上的氨酯鍵的合成。也可用雷帕黴素和氨基葡聚糖之間的連接體製備氨基葡聚糖-雷帕黴素綴合物(圖3)。預計，用將免疫抑制藥物與氨基葡聚糖分子分隔的親水性PEG連接體可得到較高靈敏度(圖4)。或者，可用雷帕黴素二聚體(雷帕黴素-L-雷帕黴素，其中L為連接體)或其它合適的雷帕黴素多聚體代替雷帕黴素-氨基葡聚糖(圖5)。在綴合物的存在下發生粒子凝集，並糹皮存在於樣品中的游離雷帕黴素抑制。在一個示範性測定形式中，使FKBP25與聚苯乙烯微粒共價偶聯。先用活化劑例如EDC/NHS(l-乙基-3(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺/N-羥基琥珀醯亞胺)將羧基改性的微粒活化，然後使其與FKBP25反應，實現FKBP25共價連接。在雷帕黴素-氨基葡聚糖綴合物存在下，粒子凝集，存在於待分析樣品中的游離雷帕黴素抑制該凝集。在0-200ng/mL範圍內完成雷帕黴素測定(見圖7)。也可使親水性連接體與粒子共價連接，然後與FKBP25偶聯。該設計在測定中得到較好的靈敏度並保留較好的蛋白活性，儘管與聚苯乙烯微粒共價連接。在文獻中，已知聚乙二醇(PEG)作為親水性間隔基使用並減少非特異性結合。如上所述，也可用鏈黴抗生物素微粒和生物素標記的受體蛋白使蛋白與微粒連接。可將FKBP25化學單生物素化，並用其與鏈黴抗生物素微粒反應。可用適噹噹量的生物素馬來醯亞胺或生物素NHS酯完成FKBP25單生物素化。在另一種測定形式中，使雷帕黴素與微粒共價偶聯。這先通過使雷帕黴素的活化酯與BSA(牛血清白蛋白)反應，然後通過共價偶聯，使BSA與羧基改性的微粒連接來實現。它也可通過將雷帕黴素生物素化(圖6)和與鏈黴抗生物素微粒反應，得到雷帕黴素-微粒試劑來實現。在另一個實施方案中，為定量測定樣品中他克莫司量提供凝集測定試劑。在該實施方案中，蛋白受體包括與檢測粒子結合的他克莫司-特異性FKBP。更尤其是，在一個實施方案中，他克莫司-特異性FKBP包含經修飾對他克莫司有選擇性的FKBP12突變體(參見M.T.DeCenzoetal,iVod"5"g&eeh"g9，173-180,1996)。在另一個實施方案中，他克莫司-特異性FKBP是FKBP14。用標準技術包括共價結合、被動結合或通過次級結合相互作用，使他克莫司-特異性FKBP與檢測粒子綴合，例如生物素/(鏈黴)抗生物素蛋白。在一個實施方案中，檢測粒子是微粒，在再一個實施方案中，使檢測粒子通過生物素-鏈黴抗生物素或生物素-抗生物素蛋白鍵與受體蛋白結合。含與氨基葡聚糖(AD)或另外的大分子載體即肽、蛋白和其它多糖綴合的他克莫司的綴合物用作其它測定試劑。也可用他克莫司和氨基葡聚糖之間的親水性連接體製備氨基葡聚糖-他克莫司綴合物。本發明還預計產生對母體藥物選擇性增加的受體突變體。按照一個實施方案，用位點定向誘變產生FKBP12肽突變體，以便增加對雷帕黴素母體藥物測定的專屬性。使受體蛋白突變以便增加受體複合物對雷帕黴素母體藥物的特異性的概念可應用於本文中公開的任何受體蛋白。因此，為檢測免疫抑制藥物他克莫司，使用FK506結合蛋白(FKBP)突變體，為檢測免疫抑制藥物環孢素，使用親環蛋白突變體。可用^^布的晶體結構幫助誘變研究。可通過本領域熟知的重組方法得到結合蛋白突變體，且可用也是本領域中熟知的方法，通過重組方法加入親和性標記，幫助它們的純化。因此並參閱下表，預計通過將以下胺基酸殘基修飾可增強雷帕黴素受體蛋白的特異性FKBP12的54位上的穀氨酸和87位上的組氨酸。下表中列出測得的雷帕黴素代謝物和FKBP12之間的C-C間距。用RCSBPDB(ProteinDataBase)公布的晶體結構lfap測量雷帕黴素代謝物的C-C間距。tableseeoriginaldocumentpage19黴素按照另一個實施方案，提供檢測樣品中免疫抑制藥物存在或量的方法，其中檢測試劑包括免疫抑制藥物的特異性蛋白受體和含與檢測粒子結合的免疫抑制藥物的綴合物。在該實施方案中，蛋白受體為多聚體形式例如受體蛋白的二聚體。將測定試劑與樣品混合，形成懸浮液，其中綴合物和免疫抑制藥物竟爭結合受體結合位點。通常將作為獨立組分的兩種試劑(即蛋白受體和綴合物)加入樣品；但是，在一個實施方案中，將兩種試劑作為單一組合物加入。按照測量凝集的方法檢測，通過直接測量所述懸浮液中與受體蛋白結合的綴合物量，可確定樣品中目標免疫抑制藥物的濃度。在一個實施方案中，檢測粒子是微粒或納米殼體，在一個實施方案中，檢測粒子是聚苯乙烯膠乳微粒。在再一個實施方案中，樣品是從給予免疫抑制藥物的患者中得到的血樣，其中用含甲醇和硫酸鋅水溶液的溶液萃取該血樣，將細胞碎片除去，然後將樣品與測定試劑混合。在再一個實施方案中，待測免疫抑制藥物是雷帕黴素，且親免素是FKBP25的二聚體或更高級多聚體。在另一個實施方案中，待測免疫抑制藥物是他克莫司，親免素是他克莫司-特異性FKBP12突變體或FKBP14的二聚體或更高級多聚體。可用技術人員已知的標準連接體，用不同連接體長度將單一受體蛋白連接在一起形成受體蛋白二聚體和多聚體複合物。本發明還包括試驗試劑盒，該試劑盒含測量樣品中免疫抑制藥物的測定試劑。該試劑盒可還包含各種容器例如小瓶、試管、瓶等。優選，該試劑盒還包含使用說明書。在一個實施方案中，試劑盒包含目標免疫抑制藥物的特異性蛋白受體和綴合物，其中蛋白受體與檢測粒子結合，綴合物包含多聚體形式的目標免疫抑制藥物。更尤其是，在一個實施方案中，多聚體形式的免疫抑制藥物包含藥物的二聚體或與大分子載體結合的多種藥物化合物。在備選的實施方案中，試劑盒包含目標免疫抑制藥物的特異性蛋白受體和綴合物類物質，其中提供蛋白受體的二聚體或更高級多聚體，綴合物包含與檢測粒子結合的目標免疫抑制藥物。在一個實施方案中，提供檢測雷帕黴素的試劑盒，其中所述試劑盒包含雷帕黴素的特異性蛋白受體和綴合物類物質，其中蛋白受體與檢測粒子結合，綴合物包含與大分子載體結合的雷帕黴素。更尤其是，在一個實施方案中，雷帕黴素的特異性蛋白受體選自FKBP25和FKBP25C。在另一個實施方案中，雷帕黴素的特異性蛋白受體是FKBP25。在另一個實施方案中，提供檢測他克莫司的試劑盒，其中所述試劑盒包含他克莫司的特異性蛋白受體和綴合物類物質，其中蛋白受體與檢測粒子結合，綴合物包含與大分子載體結合的他克莫司。更尤其是，在一個實施方案中，他克莫司的特異性蛋白受體是FKBP14。為更容易地理解本發明，參考以下實施例，它們用於舉例說明本發明，但不限制本發明的範圍。具體實施方案實施例l:雷帕黴素40-O-對硝基苯基碳酸酯(l)的製備在-78。C下，向100mg(0.109mmol)雷帕黴素加入2.5mL新蒸二氯甲烷(經CaH2蒸餾)、33pL(0.40mmol)無水吡啶和33mg(0.16mmol)氯曱酸對硝基苯酯。在-78。C下，將反應混合物攪拌lh，並在室溫下攪拌1h。在室溫下，將反應用50mL水淬滅，將得到的混合物用4x50mL二氯曱烷萃取。將有機部分乾燥(無水Na2S04)，濃縮。殘渣經製備HPLC純化，用含0.1%三氟乙酸的乙腈和水梯度洗脫。將含產物的流分合併，在旋轉蒸發儀中濃縮，然後凍幹，得到82mg(0.074mmol,69%)雷帕黴素對硝基苯基碳酸酯(1)，為白色固體。LC-MS:M+H1101.5。實施例2:40-O-氨酯連接的雷帕黴素-氬基葡聚糖綴合物(2)的製備向50mg(1.25xl(T3mmol)氨基葡聚糖(40，000)(按US6，653,456製備)中加入2mL無水DMS0，將混合物在室溫下攪拌5分鐘。向反應混合物中依次加入10.7mg(0.087mmol)4-二曱基氨基吡咬、20mg(0.018mmol)雷帕黴素對硝基苯基碳酸酯的0.5mL無水DMF溶液。將反應物在室溫下攪拌2天。將得到的黃色溶液置入Spectrapor透析管(mwcut-off2000)，通過以下條件透析90%DMSO的DI水溶液(2x3h)、70%DMSO的DI水溶液(lx3h)、50%DMSO的DI水溶液(lx3h)、30%DMSO的DI水溶液(lx3h)和10%DMSO的DI水溶液(lx3h)。然後通過DI水(6x6h)透析，將得到的溶液凍幹，得到39mg雷帕黴素-氨基葡聚糖綴合物(2)，為白色固體。通過280nmUV光(s=56,522)測量與氨基葡聚糖結合的雷帕黴素衍生物，得到與每分子M葡聚糖結合的雷帕黴素為3.8摩爾。實施例3:雷帕黴素40-0-戊二酸NHS酯(3)的製備將150mg(0.164mmol)雷帕黴素的4mL二氯甲烷溶液(經CaH2新蒸鎦的)冷卻至-78。C。向反應混合物中加入61mg(0.25mmol)琥銷醯亞胺基-氧基羰基-丁醯氯、15mg(0.12mmol)4-二甲基氨基吡啶和50吡啶。按照Antonian等，EP0503454製備琥珀醯亞胺基-氧基羰基-丁醯氯即5-(2,5-二氧代-l-吡咯烷基-氧基)-5-氧代-戊醯氯。將反應混合物在-78。C下攪拌2h,粗反應混合物的LC-MS表明反應不完全。在-78。C下，向反應混合物中再加入61mg(0.25mmol)琥珀醯亞胺基-氧基羰基-丁醯氯和50jLiL(0.60mmol)p比咬。將得到的反應混合物在-78。C下攪拌2h，然後用50mL水淬滅。將水層用5x50mL二氯曱烷萃取，將有機層合併，乾燥(無水Na2S04),減壓濃縮。將得到的無色油狀物溶於5mL4:l的乙腈水，經製備RPHPLC純化，用由含0.1%三氟乙酸的乙腈和水組成的溶劑系統梯度洗脫。將含產物的流分合併，在旋轉蒸發儀中濃縮，凍幹，得到70mg(0.062mmol,38%)雷帕黴素NHS酯(3)，為白色固體。LR-ES;M+Na1147.2。實施例4:40-O-戊二醯雷帕黴素氨基葡聚糖綴合物(4)的製備向50mg(2.5x10-5mmol)氨基葡聚糖(40,000)和7.5mg(0.062mmol)4-二曱基氨基吡啶中加入2mL無水DMSO(二甲基亞碸)，在室溫下攪拌15分鐘。向反應混合物中滴加20mg(0.017mmol)雷帕黴素40-O-戊二酸NHS酯(3)的1mL無水DMF溶液，將反應混合物在室溫下攪拌2天。將得到的反應混合物置入Spectrapor透析管(mwcutoff2000)中，通過以下條件透析90%DMSO的DI水溶液(2x3h)、70%DMSO的DI水溶液(lx3h)、50%DMSO的DI水溶液(lx3h)、30%DMSO的DI水溶液(lx3h)和10%DMSO的DI水溶液(lx3h)。然後通過DI水(6x6h)透析，將得到的溶液凍幹，得到49mg氨基葡聚糖綴合物(4)，為白色固體。通過280nmUV光(s-56,522)測量與氨基葡聚糖結合的雷帕黴素衍生物，得到與每分子氨基葡聚糖結合的雷帕黴素為5.4摩爾。實施例5:N-琥珀絲-NH-(PEG)2-NH-三笨甲基(6)的製備向100mg(0.21mmol)N-三苯曱基-4,7，10-三氧雜-l,13-三癸烷-二胺[Trt-NH-(PEG)2-NH2，NOVABiochem](5)的3mL新蒸二氯甲烷溶液中加入35(0.42mmol)吡啶、13.2mg(0.108mmol)4-二甲基氨基吡啶和32.4mg(0.32mmol)琥珀酸酐。將反應混合物在室溫下攪拌18h，濃縮。殘渣經製備RPHPLC純化，用由乙腈和水組成的梯度洗脫。將含需要產物的流分合併,凍幹，得到119mg(0.21mmol,99%)N-琥珀醯基-NH-(PEG)2-NH-三苯甲基(6)，為無色油狀物。LC-MS:M+H563.3。實施例6:三苯曱基-NH-(PEG)2-N-琥珀醯基-N-羥基琥珀醯亞胺酯(7)的製備向115mg(0.20mmol)N-琥珀醯基-NH-(PEG)2-NH-三苯甲基(6)加入5mL新蒸THF、114pL(0.64mmol)N,N-二異丙基乙胺和192mg(0.63mmol)O-(N-琥珀醯亞胺基)-N,N，N',N'-四甲基脲鏡四氟硼酸鹽。將反應混合物在室溫下攪拌3h,濃縮。向殘渣加入15mL水，將含水反應混合物用2xl5mL二氯甲烷萃取。將有機層合併，依次用2x15mL飽和NaHC03溶液、1x15mL水洗滌。將有機層乾燥(無水Na2S04),濃縮，得到90mg(0.136mmol，67。/。)三苯甲基-NH-(PEG)2-N-琥珀醯基-N-鞋基琥珀醯亞胺酯(7),為無色油狀物。立即在下一步中使用該油狀物，無須進一步純化。LC-MS:M+H660.3。實施例7:三苯曱基-NH-(PEG)2-N-琥珀醯基-氨基葡聚糖綴合物(8)的製備向200mg(5xl(T3mmol)氨基葡聚糖(40,000)加入10mLDMSO，在室溫下攪拌以便溶解，加入280pL(1.9mmol)三乙胺。向反應混合物中加入90mg(0.136mmol)三苯甲基-NH(PEG》-N-琥珀醯基-N國羥基琥珀醯亞胺酯(7)的5mL無水DMSO溶液，將得到的反應混合物在室溫下攪拌3天。將得到的反應混合物置入Spectrapor透析管(mwcutoff2000),通過以下條件透析90。/。DMSO的DI水溶液(2x3h)、70%DMSO的DI水溶液(lx3h)、50%DMSO的DI水溶液(lx3h)、30%DMSO的DI水溶液(lx3h)和10%DMSO的DI水溶液(lx3h)。然後通過DI水(6x6h)透析，將得到的溶液凍幹，得到180mg白色固體。通過230nmUV光(s=2727)測量與氨基葡聚糖結合的三苯曱基PEG衍生物，得到與每分子氨基葡聚糖結合的Trit-PEG為9.6摩爾。實施例8:氨基-(PEG)2-N-琥珀醯基-氨基葡聚糖綴合物(9)的製備向180mg三苯曱基-NH-(PEG)2-N-琥珀醯基-氨基葡聚糖綴合物(8)加入10mL二氯曱烷，在室溫下攪拌15分鐘。向反應混合物中加入10mL三氟乙酸，在室溫下攪拌45分鐘。將反應混合物濃縮；加入lOmL二氯甲烷，減壓濃縮。將加入二氯甲烷和濃縮的過程再重複兩次。向殘渣加入10mL水，將得到的反應混合物置入Spectrapor透析管中(mwcutoff2000)，通過以下條件透析90%DMSO的DI水溶液(2x3h)、70%DMSO的DI水溶液(lx3h)、50%DMSO的DI水溶液(lx3h)、30%DMSO的DI水溶液(lx3h)、10%DMSO的DI水溶液(lx3h)。然後通過DI水(6x6h)透析，將得到的溶液凍幹，得到140mg氨基-(PEG)2-N-琥珀醯基-氨基葡聚糖綴合物三氟乙酸鹽(9)，為白色固體。實施例9:雷帕黴素-(PEG)2-N-琥珀醯基-氨基葡聚糖綴合物(10)的製備向50mg(1.25X10-3mmol)M-(PEG)2-N-琥珀醯基-氨基葡聚糖綴合物三氟乙酸鹽(9)加入2mL無水DMSO，攪拌5分鐘，溶解。向反應混合物中加入20mg(0.018mmol)雷帕黴素對硝基苯基碳酸酯(l)的含7.6mg(0.062mmol)4-二甲基#^吡咬的1mL無水DMF溶液，在室溫下攪拌2天。將得到的反應混合物置入Spectrapor透析管(mwcutoff2000),通過以下條件透析90。/。DMSO的DI水溶液(2x3h)、70%DMSO的DI水溶液(lx3h)、50%DMSO的DI水溶液(lx3h)、30%DMSO的DI水溶液(lx3h)和10%DMSO的DI水溶液(lx3h)。然後通過DI水(6x6h)透析，將得到的溶液凍幹，得到52mg雷帕黴素-(PEG)2-N-琥珀醯基-氨基葡聚糖綴合物(10)，為白色固體。通過280nmUV光(e=56,522)測量與氨基葡聚糖結合的雷帕黴素衍生物，得到與每分子氨基葡聚糖結合的雷帕黴素為2.9摩爾。實施例10:雷帕黴素生物素綴合物(ll)的製備向59mg(0.052mmol)雷帕黴素40-O-戊二酸NHS酉旨(3)的2.5mL無水N,N-二甲基甲醯胺溶液中依次加入30mg(0.09mmol)EZ-連接5-(生物素醯氨基)戊胺(Pierce)、10mg(0.081mmol)4-二曱基氨基吡咬和23pL(0.27mmol)無水吡啶。將得到的反應混合物在室溫下攪拌2h，濃縮。殘渣經製備RPHPLC純化，用由含0.1。/。三氟乙酸的乙腈和水組成的梯度洗脫。將含需要產物的流分濃縮，凍幹，得到23mg(0.017mmol,33%)雷帕黴素生物素綴合物(11),為白色固體。LC-MS:M+Na1361.7。實施例ll:雷帕黴素二聚體(12)的製備製備2.0mg對苯二曱二胺在6mL新蒸THF中的貯備液。將混合物在室溫下攪拌10分鐘，然後加入20mg4-二甲基氨基吡啶。在另一個燒瓶中，製備30mg(0.026mmol)雷帕黴素40-O-戊二酸NHS酉旨(3)的5mL新蒸THF溶液。在4。C下，向反應混合物中加入2.5mL對苯二曱二胺(6.1xl(T3mmol)/4-二曱基氨基吡啶(0.068mmol)貯備液，將反應混合物在4。C下攪拌18h。將反應混合物減壓濃縮，經製備薄層層析純化，用乙酸乙酯作洗脫液，得到20mg(9.27x10-3mmol,35%)雷帕黴素二聚體(12),為白色固體。HR-MS(+)C120H178N4O30[M+2Na產理論值1100.6155;實測值1100.6151。實施例12:FKBP25微粒的製備向羧基含量0.216mEq/g的5ml10%羧基化改性聚苯乙烯微粒(0.302mm)(Seradyn,Indianapolis)中加入45mLDI水。在4。C下，按14,000rpm，將該混合物離心45分鐘，將上清液傾去。將沉澱再懸浮於50mMMES緩衝液(pH6.3)，離心。將該過程重複兩次，將^:粒濃度調至1%(w/v)。通過COBASMIRA分析儀(RocheDiagnostics,Indianapolis)測量濃度。在室溫下，向45mL1%羧基化微粒製劑的懸浮液中加入939mgEDC和563mgN-幾基琥珀醯亞胺的45mL50mMMES緩衝液(pH6.3)溶液。將反應混合物在室溫下攪拌18h。將反應混合物傾入離心管中，在4。C下，按14,000rpm離心45分鐘，將固體懸浮於50mMMOPS(pH7.9)緩衝液，如上離心。將該過程重複兩次，在50mMMOPS(pH7.9)中，將活化微粒製劑濃度調至l%(w/v)。在室溫下，向8ml1%活化微粒製劑的50mMMOPS緩沖劑(pH7.9)溶液中一次性加入lmgFKBP25的4mL50mMMOPS緩衝液。將反應混合物在室溫下攪拌2h，將反應混合物用5mL1M乙醇胺水溶液(pH9)淬滅。將反應物在室溫下攪拌18h。將該反應物轉移到離心管中，在4。C下，按14,000rpm離心45分鐘，將固體再懸浮於50mMMOPS(pH7.9)緩衝液，如上離心。將該過程重複兩次，在50mMMOPS(pH7.9)中，將活化微粒製劑濃度調至0.14%(w/v)。得到總計38mL0.14%(w/v)FKBP25微粒製劑。在開發以下實施例14中所述雷帕黴素測定方法中，該FKBP25微粒製劑用作R2試劑。實施例13:PEG-改性的FKBP25微粒的製備向10ml1%(w/v)活化微粒(按實施例12所述製備)的50mMMOPS緩衝劑(pH7.9)溶液中加入10mL21mg(0.047mmol)dPEG8(QuantaBiodesign)的50mM磷酸鉀溶液(pH9)。將反應混合物在室溫下攪拌18h。將該混合物轉移到離心管中，在4。C下，按14,000rpm離心45分鐘，將固體再懸浮於50mMMES(pH6.3)緩沖液，如上離心。將該過程重複兩次，在50mMMES緩沖液(pH6.3)中，將PEG-改性的微粒製劑濃度調至0.9%。得到總計10mL0.9%(w/v)PEG-微粒製劑。向以上所有製劑中加入10mL187mgEDC和112mgNHS的50mMMES緩衝劑(pH6.3)溶液。將反應混合物在室溫下攪拌18h。將反應混合物傾入離心管中，在4。C下，按14,0000rpm離心45分鐘，將固體再懸浮於50mMMOPS(pH7.9)緩衝液，如上離心。將該過程重複兩次，在50mMMOPS(pH7.9)中，將活化微粒濃度調至0.88%(w/v)。得到總計10mL0.88%(w/v)濃度活化PEG連接的微粒製劑的50mMMPOS緩沖劑(pH7.9)溶液。向4mL0.88%(w/v)活化PEG-微粒中加入424嗎FKBP25的2mL50mMMOPS(pH7.9)溶液。將反應混合物在室溫下攪拌2h，將反應用5mL1M乙醇胺(pH9)淬滅。將該混合物轉移到離心管中，在4°C下，按14,000rpm離心45分鐘，將固體再懸浮於50mMMOPS(pH7.9)緩衝液，如上離心。將該過程重複兩次，在50mMMOPS(pH7.9)中，將活化微粒濃度調至0.14%(w/v)。得到總計16mL0.14%(w/v)FKBP25-PEG微粒製劑。在開發雷帕黴素測定方法中，該FKBP25-PEG微粒製劑用作R2試劑。實施例14:FKBP25微粒和雷帕黴素-氬基葡聚糖的劑量-反應曲線(雷帕黴素測定)通過製備175mMPIPES緩衝液(pH7.4)製備第一工作試劑(Rl試劑)。向該試劑加入雷帕黴素-氨基葡聚糖綴合物，得到濃度400ng/mL。向該溶液中也加入聚丙烯酸，得到濃度1.3%。按實施例12中所述製備第二工作試劑(R2試劑)，溶於pH7.9的50mMMOPS緩沖液，按終濃度0.14%(w/v)使用。在DMSO中製備雷帕黴素貯備液(100|xg/mL)。通過在0.9%鹽水溶液中製備50、100和200ng/mL雷帕黴素溶液，從貯備液製備校正曲線。用35體積樣品、180pL第一工作試劑和80第二工作試劑；用Hitachi917自動分析儀(RocheDiagnosticsCorporation,Indianapolis)進行測定(在800nm測量OD)。結果見圖7所示。然後同上測定他克莫司的已知量。通過將得到的雷帕黴素曲線中的觀測讀數與淨皮測樣品中他克莫司的實際量進行對比，在該測定中測得他克莫司的交叉反應性為7%。即含1000ng/ml他克莫司的樣品給出70ng/ml雷帕黴素曲線的讀數。因此交叉反應性為(70/1000)><100%=7%。已經詳細闡述了本發明和參考其具體實施方案，可以進行修改和變化而不偏離權利要求中限定的本發明範圍是顯而易見的。更尤其疋，個T估個久Y個及明的呆S1萬囬確J&刀但期望本發明無須限於本發明的這些優選的方面權利要求1.一種測定樣品中免疫抑制藥物的存在或量的方法，所述方法包括以下步驟提供可能含有免疫抑制藥物的樣品，使該樣品與所述免疫抑制藥物的綴合物和特異性親免素受體混合，形成懸浮液或溶液，其中所述綴合物包含外源性免疫抑制藥物或藥物類似物，其中存在於樣品中的所述免疫抑制藥物和所述外源性藥物或藥物類似物競爭結合所述親免素受體，測量與所述親免素受體結合的免疫抑制藥物的量或仍然是游離的免疫抑制藥物的量，和將測得的免疫抑制藥物的量與樣品中免疫抑制藥物的存在或量進行相關性分析。2.權利要求1的方法，其中所述親免素受體與檢測粒子結合，且所述綴合物與大分子載體結合。3.權利要求1的方法，其中所述綴合物與檢測粒子結合，且所述親免素受體為多聚體形式，優選二聚體形式。4.權利要求2或3的方法，其中測量懸浮液中的粒子凝集的量。5.權利要求1的方法，其中通過使用螢光或化學發光檢測系統測量與所述親免素受體結合的免疫抑制藥物的量，或仍然是游離的免疫抑制藥物的量。6.權利要求1的方法，其中所述樣品是從給予免疫抑制藥物的患者中得到的血液樣品。7.權利要求2的方法，其中所述大分子載體選自肽、蛋白和多糖。8.權利要求1的方法，其中所述免疫抑制藥物選自環孢素、他克莫司、雷帕黴素和依維莫司。9.權利要求1的方法，其中所述免疫抑制藥物是雷帕黴素或依維莫司，且所迷親免素受體是雷帕黴素-特異性FK結合蛋白。10.權利要求l的方法，其中所述免疫抑制藥物是雷帕黴素，且所述親免素受體是選自以下的雷帕黴素-特異性FK結合蛋白FKBP25和FKBP25C。11.權利要求l的方法，其中所述免疫抑制藥物是他克莫司，且所述親免素受體是他克莫司-特異性FK結合蛋白。12.權利要求l的方法，其中所述免疫抑制藥物是他克莫司，且所述親免素受體是選自以下的他克莫司-特異性FK結合蛋白他克莫司-特異性FKBP12突變體或FKBP14。13.權利要求l的方法，其中所述親免素受體與螢光共振能量轉移對的第一個成員結合，且所述綴合物與螢光共振能量轉移對的第二個成員結合，且所述親免素蛋白與外源性免疫抑制藥物或藥物類似物的結合按螢光能量轉移關係安排螢光共振能量轉移對的成員，產生可檢測信號，測量溶液中產生的信號的量，和將測得的信號的量與樣品中免疫抑制藥物的存在或量進行相關性分析。14.權利要求l的方法，其中將所述外源性免疫抑制藥物或藥物類似物用螢光團標記，且所述親免素蛋白與所述外源性免疫抑制藥物或藥物類似物的結合使所述焚光團的螢光偏振發生變化，測量溶液中產生的螢光偏振變化，和將螢光偏振變化的量與樣品中免疫抑制藥物的存在或量進行相關性分析。15.權利要求l的方法，其中測定樣品中雷帕黴素的存在或量，所述方法包括以下步驟提供可能含有雷帕黴素的樣品，使所述樣品與雷帕黴素二聚體和雷帕黴素的特異性親免素受體混合，形成懸浮液，其中所述親免素受體與檢測粒子結合，其中所述樣品中的雷帕黴素和所述雷帕黴素二聚體竟爭結合所述親免素受體，且當所述親免素受體與所述雷帕黴素二聚體結合後，所述檢測粒子凝集，測量懸浮液中粒子凝集的量，和將測得的凝集的量與所述樣品中雷帕黴素的存在或量進行相關性分析。16.—種用於測定樣品中免疫抑制藥物的存在或量的試劑盒，所述試劑盒包含所述藥物的特異性親免素受體，包含外源性免疫抑制藥物或藥物類似物的綴合物，和進行測定的說明書。17.權利要求16的試劑盒，其中所述親免素受體與檢測粒子結合，且所述綴合物與大分子栽體結合。18.權利要求16的試劑盒，其中所述親免素受體為多聚體形式，且所述綴合物與檢測粒子結合。19.權利要求16的試劑盒，其中所述免疫抑制藥物是雷帕黴素或依維莫司，且所述親免素受體是雷帕黴素-特異性FK結合蛋白。20.權利要求16的試劑盒，其中所述免疫抑制藥物是雷帕黴素，且所述親免素受體是選自以下的雷帕黴素-特異性FK結合蛋白FKBP25和FKBP25C。21.權利要求16的試劑盒，其中所述免疫抑制藥物是他克莫司，且所述親免素受體是他克莫司-特異性FK結合蛋白。22.權利要求16的試劑盒，其中所述免疫抑制藥物是他克莫司，且所述親免素受體是選自以下的他克莫司-特異性FK結合蛋白他克莫司-特異性FKBP12突變體或FKBP14。23.權利要求16的試劑盒，其中所述免疫抑制藥物是雷帕黴素或依維莫司，且所述親免素受體是雷帕黴素-特異性FK結合蛋白。24.權利要求16的試劑盒，其中所述親免素受體與螢光共振能量轉移對的第一個成員結合，且所述綴合物與螢光共振能量轉移對的第二個成員結合。25.權利要求16的試劑盒，其中所述外源性免疫抑制藥物或藥物類似物用螢光團標記。26.權利要求16的試劑盒，所述試劑盒包含雷帕黴素的特異性親免素受體，所述親免素受體與檢測粒子結合，雷帕黴素二聚體，和進行測定的說明書。全文摘要本發明提供用親免素測定免疫抑制藥物的單受體形式的高特異性均相測定方法。在該最簡單形式中，使用類似於競爭性免疫測定的單受體，其中用親免素代替抗體，藥物綴合物和藥物分析物之間對有限數目的親免素結合位點產生競爭。在微粒凝集測定形式中，親免素與粒子結合或為溶液形式。在其中親免素與粒子結合的情況下，提供藥物分析物的多價綴合物溶液。文檔編號C12Q1/533GK101300492SQ200680041024公開日2008年11月5日申請日期2006年9月6日優先權日2005年9月7日發明者A·多爾恩,G·西格勒,M·戈沙爾,S·拉施德申請人:霍夫曼-拉羅奇有限公司