一種耐高溫耐強鹼的木聚糖酶改良基因及其基因工程菌株及其製備方法

2023-06-27 12:15:06

專利名稱：：一種耐高溫耐強鹼的木聚糖酶改良基因及其基因工程菌株及其製備方法
技術領域：
：本發明屬於基因工程和蛋白質工程領域，涉及一種編碼高溫強鹼下具有木聚糖酶活性的改良基因、含有該改良基因的載體、基因工程菌株，該基因的製備和表達方法和菌株的製備方法。
背景技術：
：木聚糖酶[EC.3.1.2.8]以內切方式水解木聚糖分子中e-1.4-糖苷鍵，其水解產物主要是木二糖和木寡糖，在紙漿造紙、動物飼料、食品工業和能源工業具有很大的應用前景。木聚糖酶在造紙工業中可作為紙漿漂白助劑，不僅可以提高紙張的白度和強度，更可以減少傳統漂白劑氯化物和次氯化物的排放，大大減少環境汙染；在動物飼料中加入木聚糖酶，可以降解木聚糖，提高非反芻類動物對飼料的利用率；木聚糖酶能分解製備酒類和飲料的原料中所含有的一些非澱粉類多糖物質，達到澄清飲料和酒類的目的；木聚糖酶用於加工麵包食品時，可以分解部分麩質物質，改變麵包的鬆軟度，大大提高口感；同時，木聚糖酶分解木聚糖所產生的低聚木糖是很有效的雙歧因子，在人體的大腸中可以促進雙歧桿菌等益生菌的增殖，調整菌群平衡，改善腸道功能，抑制腸道腐敗，降低血脂膽固醇，增強機體的免疫功能。目前人們已經從真菌、放線菌、細菌等多種微生物中分離克隆了大量木聚糖酶的編碼基因。這些天然來源的木聚糖酶的最適反應溫度大多在50-60。C左右，最適反應pH值大多在4.0-6.O(劉亮偉eta丄，河南農業科學，2006,Vol6，14-18)，其酶學特性往往不能滿足工業生產和應用的需要。例如在紙漿和造紙工業中，要求木聚糖酶在較高的溫度(60-65°C)和較高的pH值(10-11)下對木材進行處理(PickersgillR.W.eta丄，Proteins，1997，Vol29，77-86),這就對木聚糖酶的物理化學的穩定性提出了更高的要求。
發明內容本發明的第一個目的是獲得一種耐高溫耐強鹼的木聚糖酶改良基因。本發明的第二個目的是獲得表達上述木聚糖酶改良基因的基因工程菌株。本發明的第三個目的是提供上述木聚糖酶改良基因和菌株的製備方法。本發明利用分子定向進化技術獲得了一種木聚糖酶改良基因(Xyn-CDBFV-G201C)，其胺基酸序列如SEQIDNO2所示，其核苷酸編碼序列如SEQIDNO1所示。本發明獲得了一種耐高溫耐強鹼的木聚糖酶改良基因。作為改良基礎的木聚糖酶C(Xyn-CDBFV)(EMBLAccNo.AF123252)來源於牛瘤胃真菌(psWcisr咖)(Xiu"s丄，Can.J.Microbiol.1999,Vol45,970-974)，該木聚糖酶基因最適反應溫度是62X,最適反應pH值6.0(Chen"s丄，Can.J.Microbiol.2001，Vol47,1088-1094)。本發明將原木聚糖酶(Xyn-CDBFV)的601位的核苷酸由鳥嘌呤突變為胸腺嘧啶，相應的，201位的胺基酸殘基由甘氨酸突變為半胱氨酸。分子動力學模擬以及定點突變實驗結果均顯示出在改良木聚糖酶中，201位與50位半胱氨酸形成二硫鍵(見圖1和2)，該二硫鍵導致改良木聚糖酶熱穩定性較原始木聚糖酶高。本發明提供了一種含有上述木聚糖酶改良基因的核苷酸編碼序列的質粒。該質粒可以是原核或者真核質粒。將含有本發明的木聚糖酶改良基因編碼序列通過常規方法克隆至載體的多克隆位點，即可形成重組載體質粒。本發明的質粒可以是原核質粒，例如大腸桿菌表達質粒，例如PET21a，PET30a等。該質粒也可以是真核表達質粒，例如酵母表達質粒。例如，該質粒可以是畢赤氏酵母表達質粒。比如pPIC9k,pPIC9等。本發明還提供了一種含有上述表達質粒的酵母基因工程菌株。該菌株可以採用畢赤氏酵母基因工程菌株。例如，PichiapastroisGS115,SMD1168等，用電轉化等常規方法將含有本發明的木聚糖酶改良基因編碼序列導入酵母菌株，通過篩選可以獲得含有目的基因的菌株。該菌株在搖瓶中發酵、分泌表達木聚糖酶，表達水平可以達到5000-10000U/ml。本發明還提供了上述木聚糖酶改良基因的製備方法，即以Xyn-CDBFV基因為模板，將其核苷酸編碼序列第601位由鳥嘌呤突變為胸腺嘧啶。也可以以Xyn-CDBFV基因為模板，進行隨機突變，通過篩選較高溫度(65-80°C)條件下，耐受性最佳即殘餘活性最高的突變體而得。本發明還提供了基因工程菌株的製備方法，木聚糖酶改良基因的核苷酸編碼序列的酵母表達質粒轉化酵母菌即可。該菌株可以採用畢赤氏酵母基因工程菌株。例如，PichiapastroisGS115,SMD1168等。轉化可以採用常規方法，如電轉化等。本發明的實施例中，通過常規基因克隆技術將該改良木聚糖酶基因克隆至畢赤氏酵母表達載體pPIC9k(也可以是pPIC9)中，獲得含有該改良木聚糖酶基因的重組畢赤氏酵母表達質粒和重組畢赤氏酵母工程菌株。該重組畢赤氏酵母表達質粒為pPIC9k-Xyn-CDBFV-G201C，重組畢赤氏酵母工程菌株是含有pPIC9k-Xyn-CDBFV-G201C質粒的GS115工程菌株。本發明獲得了一種耐高溫耐強鹼的木聚糖酶改良基因。改良後的木聚糖酶較原木聚糖酶具有更好的熱穩定性，在75。C處理10min後，原始木聚糖酶的殘餘相對活性為15%左右，而改良木聚糖酶達到了80%。同時，改良木聚糖酶在高溫強鹼的環境下的酶活是原木聚糖酶的1.5-2倍，並能在高溫下長時間分解木聚糖。本發明還提供了上述木聚糖酶改良基因的表達質粒及其酵母基因工程菌株。該工程菌株的表達產物分泌到胞外，有利於木聚糖酶的提取。本發明的木聚糖酶改良基因能夠在紙漿造紙、動物飼料、食品工業和能源工業中，更好的滿足工業化生產需要。圖1是木聚糖酶及其突變體經DTT處理後殘餘活性比較圖。"+"為DTT(二硫蘇糖醇，是一種還原劑，可以打開蛋白中存在的二硫鍵)存在情況，"-"為不使用DTT。圖中殘餘相對活性代表了75。C處理10min後與處理前的比值，即以未進行熱處理的酶測得的活性作為100%。該圖表明，G201C突變體可以大大增加殘餘相對活性。由圖判斷，改良的木聚糖酶201位與50位半胱氨酸形成二硫鍵，而不是201與60位半胱氨酸形成二硫鍵，也不是50與60位半胱氨酸形成二硫鍵。其中，C60A即原始木聚糖酶胺基酸序列60位的半胱氨酸變為丙氨酸的突變體蛋白；G201C是原始木聚糖酶胺基酸序列201位的甘氨酸變為半胱氨酸的突變體蛋白，即本發明的改良木聚糖酶；C60A-G201C是原始木聚糖酶胺基酸序列60位的半胱氨酸變為丙氨酸並且201位的甘氨酸變為半胱氨酸的突變體蛋白。圖2是三個可能存在的蛋白模擬結構與各自模擬的初始結構的均方根偏差(RootMeanSquareDeviation)比較結果圖。條件為60°C。該圖顯示，201位與50位半胱氨酸形成二硫鍵的蛋白模型的模擬結構與其初始結構的均方根偏差值最小，表明該模型的結構最穩定。橫坐標為時間，以ps(即10—e秒)為單位。50ss201表示50位和201位半胱氨酸形成二硫鍵，其它的依次類推。圖3:在pH4.0的50mM檸檬酸緩衝液中，大腸桿菌重組表達製備的原始木聚糖酶(Xyn-CDBFV)和改良木聚糖酶(Xyn-CDBFV-G201C)在不同溫度下的相對活性的比較結果圖。以各自最高的酶活作為100%，原始木聚糖酶以67T測得的酶活作為100%，改良木聚糖酶以77"C測得的酶活作為100%。圖4:在pH5.0的50mM擰檬酸緩衝液中，大腸桿菌重組表達製備的原始木聚糖酶(Xyn-CDBFV)和改良木聚糖酶(Xyn-CDBFV-G201C)在不同溫度下的相對活性的比較結果圖。以各自最高的酶活作為100%，原始木聚糖酶以67"C測得的酶活作為100%,改良木聚糖酶以67X測得的酶活作為100%。圖5:在pH6.0的50mM檸檬酸緩衝液中，大腸桿菌重組表達製備的原始木聚糖酶(Xyn-CDBFV)和改良木聚糖酶(Xyn-CDBFV-G201C)在不同溫度下的相對活性的比較結果圖。以各自最高的酶活作為100%，原始木聚糖酶以62X測得的酶活作為100%,改良木聚糖酶以67"C測得的酶活作為100%。圖6:在pH4.0的50mM檸檬酸緩衝液中，畢赤氏酵母重組表達製備的原始木聚糖酶(Xyn-CDBFV-Y)和改良木聚糖酶(Xyn-CDBFV-G201C-Y)在不同溫度下的相對活性的比較結果圖。以各自最高的酶活作為100%，原始木聚糖酶以67°C測得的酶活作為100%，改良木聚糖酶以67T測得的酶活作為100%。後綴Y表示酵母畢赤氏分泌表達的蛋白。圖7:在pH5.0的50mM擰檬酸緩衝液中，畢赤氏酵母重組表達製備的原始木聚糖酶(Xyn-CDBFV-Y)和改良木聚糖酶(Xyn-CDBFV-G201C-Y)在不同溫度下的相對活性的比較結果圖。以各自最高的酶活作為100%，原始木聚糖酶以72T測得的酶活作為100%，改良木聚糖酶以77。C測得的酶活作為100%。後綴Y表示畢赤氏酵母分泌表達的蛋白。圖8:在pH6.0的50mM檸檬酸緩衝液中，畢赤氏酵母重組表達製備的原始木聚糖酶(Xyn-CDBFV-Y)和改良木聚糖酶(Xyn-CDBFV-G201C-Y)在不同溫度下的相對活性的比較結果圖。以各自最高的酶活作為100%，原始木聚糖酶以67"C測得的酶活作為100%，改良木聚糖酶以72。C測得的酶活作為100%。後綴Y表示畢赤氏酵母分泌表達的蛋白。圖9:60。C，在不同pH值環境中，大腸桿菌重組表達製備的原始木聚糖酶(Xyn-CDBFV)和改良木聚糖酶(Xyn-CDBFV-G201C)的相對活性的比較結果圖。以各自最高的酶活作為100%，原始木聚糖酶以在pH5.2的檸檬酸緩衝液中測得的酶活作為100%,改良木聚糖酶以在pH5.2的檸檬酸緩衝液中測得的酶活作為100%。圖10:65。C，不同pH值環境中，畢赤氏酵母重組表達製備的原始木聚糖酶(Xyn-CDBFV-Y)和改良木聚糖酶(Xyn-CDBFV-G201C-Y)的相對活性的比較結果圖。以各自最高的酶活作為100%,原始木聚糖酶以在pH6.2的磷酸鈉緩衝液中測得的酶活作為100。i，改良木聚糖酶以在pH6.2的磷酸鈉緩衝液中測得的酶活作為100%。後綴Y表示畢赤氏酵母分泌表達的蛋白。圖11:75°C，在pH5.0的50mM檸檬酸緩衝液中，大腸桿菌重組表達製備的原始木聚糖酶(Xyn-CDBFV)和改良木聚糖酶(Xyn-CDBFV-G201C)持續分解木聚糖能力的比較結果圖。以最初5分鐘所產生的產物量作為100%。圖12:80°C，在pH5.0的50mM檸檬酸緩衝液中，畢赤氏酵母重組表達製備的原始木聚糖酶(Xyn-CDBFV-Y)和改良木聚糖酶(Xyn-CDBFV-G201C-Y)持續分解木聚糖能力的比較結果圖。以最初5分鐘所產生的產物量作為100%。後綴Y表示畢赤氏酵母分泌表達的蛋白。具體實施例方式所用實驗材料和相關操作方法如下(未詳述處可以參考冷泉港實驗室的《分子克隆》)1:菌株，載體和基因大腸桿菌菌株E.coliB121(DE3)和ToplO，質粒PET21a，酵母菌株PichiapastroisGS115,酵母表達載體pPIC9k，木聚糖酶基因(Xyn—CDBFV)(EMBLAccNo.AF123252)(Cheneta丄，Can.J.Microbiol.2001，Vol47,1088-1094)均為本室保存，與現有文獻中相應物質的性質相同。2:酶與試劑盒限制性內切酶，連接酶購自TaKaRa公司，隨機突變PCR試劑盒GeneMorphII購自Stratagene公司，質粒提取試劑盒和凝膠回收試劑盒購自博大公司(上海)。3:培養基大腸桿菌培養基為LB(1%Polyp印tone，1%NaCl,0.5%YeastExtract,pH7.0，氨苄選擇性的培養基中Ampicillin終濃度為100fig/mL，固體培養基添加1.5%瓊脂)，酵母完全培養基為YEPD(1%YeastExtract,2%Polyp印tone，2%Glucose,固體培養基添加1.5%瓊脂)，酵母轉化培養基為MD(1.34%YNB，2%Glucose,0.4mg/L生物素，固體培養基添加1.5%瓊脂)酵母誘導培養基BMGY(1%YeastExtract,2%Polyp印tone，1.34%YNB，0.4mg/L生物素，1%甘油)和BMMY(1°/。YeastExtract,2%Polyp印tone，1.34YNB,0.4mg/L生物素，0.5%甲醇)4:生化試劑引物購自Invitrogen公司，IPTG購自Sigma公司，TEMED、過硫酸銨、丙烯醯胺以及甲叉雙丙烯醯胺購自Premega公司，DNS(3，5-二硝基水楊酸)試劑(甲液溶解6.9克結晶酚於15.2ml10MNa0H中，用蒸餾水稀釋至69ml，再加入6.9克NaHS03;乙液255克酒石酸鉀鈉加至300ml10%Na0H中，再加入880ml1%3，5-二硝基水楊酸溶液；將甲液與乙液相混合即得到黃色DNS試劑，儲於棕色瓶中，在室溫下放置7-10天後使用)5:酶蛋白在大腸桿菌系統的表達及純化將含有酶基因的PET21a質粒轉化至大腸桿菌表達菌BL21(DE3)中，塗布於LA平板，37X倒置培養至轉化子出現，用牙籤挑取一個單克隆轉化子接種至3mlLA(LB培養液+100^g/ml氨節黴素)培養液中，37°C,220rpm培養過夜，次日取0.5ml過夜菌至50mlLA+1%Glucose中，37°C，220rpm培養,當菌密度(OD.600)達到0.4-0.6，加入終濃度為0.lmM的IPTG，22度，220rpm繼續培養10小時。離心收集菌體，用pH7.4,50mMTris-HC1重懸菌體，超聲破碎大腸桿菌細胞，高速離心收集上清，Ni-NTA柱結合C端含有6*His標籤的酶蛋白，用梯度濃度的咪唑洗脫結合在Ni-NTA柱上的酶蛋白。實施例l通過定向進化技術獲得改良木聚糖酶基因設計PCR引物XynFl和XynRl如下XynFl:GGCGGATCCATGCAAAGTTTCTGTAGTTCAGCTTCTCAC(正向引物，下劃線的序列為BamHI酶切識別序列)，即SEQIDNO3。XynRl:GCGGCGGCCGCATCACCAATGTAAACCTTTGCGTAT(反向引物，下劃線的序列為NotI酶切識別序列，不含終止密碼子，利用載體上的終止密碼子終止表達)，即SEQIDNO4。以Xyn-CDBFV基因為模板，以上述引物用GeneMorphII隨機突變PCR試劑盒(Stratagene)進行PCR擴增，膠回收PCR產物，BamHI和Notl進行酶切處理後與經過同樣酶切後的PET21a載體連接，轉化至大腸桿菌BL21(DE3)中，塗布於LA平板(LB培養基+100Pg/ml氨苄黴素)，37°C倒置培養，待轉化子出現後，用牙籤逐個挑至96孔平板的每個小孔中(其中有一個小孔挑入含有原始木聚糖酶基因的轉化子)，每個小孔裡加入150ul含有0.lmMIPTG的LA培養基(LB培養基+100l^g/ml氨苄黴素)，將平板於22。C,220rpm培養至菌密度(OD.600)達到1.0左右，離心去除上清液，用100ulpH5.0的50mM檸檬酸緩衝液重懸菌體，反覆凍融，獲得含有木聚糖酶的大腸桿菌細胞裂解液。分別取出30ul裂解液至兩塊新的96孔平板，其中一塊平板於75度處理10分鐘後，兩塊平板都加入30ul的2%的木聚糖溶液，於60X反應10分鐘後，DNS法(Miller,G丄，Anal.Chem.1995，Vol31，426-428)測定生成的還原糖，對高溫處理後依然保持高活性的突變子進行DNA測序分析，獲得一株熱穩定性高(75。C處理10min後，殘餘酶活為80%，而原酶僅為15%)，但酶活卻沒有降低的改良木聚糖酶基因，即Xyn-CDBFV-G201C。該改良木聚糖酶與原木聚糖酶相比，存在一個核苷酸的差異，其601位的鳥嘌呤變為胸腺嘧啶，與之相對應，其編碼胺基酸由原來201位的甘氨酸突變為半胱氨酸。實施例2:改良木聚糖酶中201位與50位半胱氨酸形成了二硫鍵改良的木聚糖酶熱穩定性的提高的原因是由於201位與50位半胱氨酸形成了一個新的二硫鍵。改良木聚糖酶(Xyn-CDBFV-G201C)在SWISS-MODEL(http:〃swissmode1.expasy.org/)進行了同源建模，可以看到50，60和201位的半胱氨酸在空間上相互接近，彼此都有可能形成二硫鍵，但201位與50位半胱氨酸的空間位置使它們更容易形成二硫鍵，於是對原始和改良木聚糖酶進行了定點突變，將60位的半胱氨酸突變為丙氨酸。將原始和改良木聚糖酶基因以及它們的C60A突變體基因分別克隆至PET21a中，大腸桿菌重組表達製備了這四種酶蛋白。DTT是還原劑，能夠打開這些酶蛋白中可能存在的二硫鍵。首先在不含DTT的pH5.0的檸檬酸緩衝液對這四種蛋白進行熱穩定試驗(75度處理10min)，原始木聚糖酶和其C60A突變體的熱穩定性是一致的，殘餘活性均為15%，同時改良木聚糖酶和其C60A突變體的熱穩定性也是一致的，殘餘活性均為80%;其次在含有2mMDTT的pH5.0的檸檬酸緩衝液對這四種蛋白進行熱穩定試驗，原始木聚糖酶和其C60A突變體的熱穩定性在DTT存在的情況下並沒有發生變化；而改良木聚糖酶和其C60A突變體的熱穩定性在DTT存在的情況下發生了明顯的降低，殘餘活性均從80%下降到了50%(圖1)，由此可以推斷，在原始木聚糖酶中沒有二硫鍵，而在改良木聚糖酶中，201位與50位半胱氨酸形成了二硫鍵，而不是201與60位半胱氨酸形成二硫鍵，也不是50與60位半胱氨酸形成二硫鍵。另一方面，利用了分子動力學模擬間接證明201位與50位半胱氨酸形成了二硫鍵。201，50，60位的半胱氨酸彼此有可能形成二硫鍵，於是建立了三個蛋白模型，50與201位半胱氨酸形成二硫鍵(50ss201)，50與60位半胱氨酸形成二硫鍵(50ss60)，60與201位半胱氨酸形成二硫鍵(60ss201)，利用namd2程序對這三個蛋白結構在一個大氣壓單位下，60°C進行分子動力學模擬。將蛋白結構放入一個邊長為10埃的水盒子中，離子濃度為50mM,cut-off距離為8埃，particle-meshEwald(PME)處理的周期邊界條件計算長距離電磁作用，CHARMM27力場，SHAKE運算法則限制包括氫鍵的共價鍵，Timest印為lfs，模擬時間為7ns，每5ps記錄蛋白結構。模擬結束後，進行均方根偏差(RootMeanSquareDeviation)的計算，均方根偏差的含義是比較兩個結構的差異，均方根偏差越小，表明兩個結構越相近。計算均方根偏差的對比結構是三個蛋白模型結構動力學模擬的初始結構，由圖2可以看到，在7ns的模擬過程中，50ss201與初始結構的均方根偏差在三個可能存在二硫鍵的蛋白模型中是最小的，表明這個結構是最穩定的結構，也是實際上最有可能存在的結構。實施例3含有改良基因的重組酵母表達載體的構建以及重組酵母基因工程菌株的獲得用於構建酵母表達載體的質粒是pPIC9K(帶有alpha因子分泌信號)，設計PCR引物XynF2和XynR2如下XynF2:GGCGAATTCATGCAAAGTTTCTGTAGTTCAGCTTCTCAC(正向引物，劃線的序列為EcoRI酶切識別序列)，即SEQIDNO5。XynR2:GCGGCGGCCGC[^VTCACCAATGTAAACCTTTGCGTAT(反向引物，劃線的序列為Notl酶切識別序列，方框內的序列為終止密碼子)，即SEQIDNO6。以PET21a-Xyn-CDBFV-G201C質粒DNA為模版，利用高保真Pfu聚合酶擴增出Xyn-CDBFV-G201C片段，克隆至pPIC9k，形成重組質粒pPIC9k-Xyn-CDBFV-G201C,酶基因在A0X1啟動子下遊。用同樣的方法獲得重組質粒pPIC9k-Xyn-CDBFV。過量的pPIC9k-Xyn-CDBFV-G201C質粒DNA經BglII酶切，乙醇沉澱後，70%乙醇洗兩次，冷凍乾燥後用無菌水溶解DNA，取2-3化DNA電擊轉化至畢赤氏酵母GS115中，塗布於MD平板，30X倒置培養至轉化子出現。受體菌GS115是組氨酸缺陷型，目的基因通過體內同源重組將整合至酵母基因組中，重組轉化子能在不含His的MD平板上生長。用牙籤從轉化平板上挑取轉化子劃線至含有3mg/ml的G418的YETO平板，只有目的基因高拷貝重組的轉化子能在高濃度G418下生長。挑取生長良好的重組轉化子在以甘油為碳源的培養基(BMGY)中，30T搖瓶培養至細胞密度(0.D.600)達到20，離心後棄上清，酵母細胞再轉接到誘導培養基(BMMY)(甲醇終濃度0.5%)中30°C誘導培養72個小時，在外源甲醇的誘導下，A0X1啟動子可以啟動下遊基因的表達，並且信號肽可以指導表達產物分泌至酵母細胞胞外，SDS-PAGE檢測發酵上清液，從300株重組酵母中初步篩選到28株表達木聚糖酶的重組轉化子，其中表達量最高的一株重組酵母基因工程菌株，定義為GS115/Xyn-CDBFV-G201C，按照同樣方法獲得含有原始木聚糖酶基因的重組酵母基因工程菌株，定義為GS115/Xyn-CDBFV。實施例4:改良木聚糖酶的酶學性質分析對改良和原始木聚糖酶進行酶學性質的比較研究，其中包括酶的比活，最適反應溫度，最適反應pH值，持續分解木聚糖酶的能力以及酶動力學性質。酶活測定方法如下100ul相應pH緩衝液稀釋的酶液與100ul2%的木聚糖溶液混合，於相應的溫度反應10min後，加入DNS顯色液，100度沸水浴顯色10min，570nm分光光度計測定吸光度，以D-木糖作為標準物，通過測定酶促反應所生成的還原性木糖來定量的計算酶活性。木聚糖酶活性單位(U)定義為在一定條件下，lmg(或lml發酵液)木聚糖酶每分鐘能分解木聚糖產生lumol的木糖。(李彩霞Wa丄，紙和造紙，2001，Vol1,60-61)以下所用原始木聚糖酶和改良木聚糖酶分別採用統一的發酵液。(1)改良木聚糖酶在高溫下具有更高的活性。在pH4.0、5.0、6.050mM檸檬酸緩衝液中，測定42，47，52，57,62，67，72，77，82，87T中改良和原始木聚糖酶的酶活。結果見圖3-5(大腸桿菌重組表達製備的酶蛋白)和圖6-8(畢赤氏酵母重組表達製備的酶蛋白)，在三個pH值的緩衝液中，改良木聚糖酶的最適反應溫度提高了0-10度，在低於最適反應溫度的低溫中，兩種木聚糖酶的酶活是一致的，而在高於最適反應溫度的高溫中，改良木聚糖酶的酶活是原始木聚糖酶1.5-2倍。在pH6.0下，大腸桿菌重組表達製備的原始木聚糖酶的最適反應溫度為62°C，酶比活為3729U/mg，而改良木聚糖酶的最適反應溫度為67。C，酶比活為5004U/mg，在72X中，原木聚糖酶的酶比活下降到1948U/mg，而改良木聚糖酶只下降到4446U/mg;畢赤氏酵母重組表達製備的原始木聚糖酶的最適反應溫度是67"C，比活為6872U/ml發酵液；而改良木聚糖酶的最適反應溫度是72。C，比活為9282U7ml發酵液，在77°C中，原始木聚糖酶的酶比活為3335U/ml發酵液，而改良木聚糖酶的酶比活達到了6802U/ml發酵液。由此可見，改良木聚糖酶在高溫下具有更高的活性。(2)改良木聚糖酶在強鹼下具有更高的活性在65T，在3種不同pH範圍的緩衝體系(pH4.3-6.25為50mM檸檬酸緩衝液，pH5.8-7.81為50mM的磷酸鈉緩衝液，pH7.31-9.19為50mMTris-Hcl緩衝液)中測定改良和原始木聚糖酶的酶活。結果見圖9(大腸桿菌重組表達製備的酶蛋白)和圖10(畢赤氏酵母重組表達製備的酶蛋白)，兩種木聚糖酶的最適pH值是一致的，大腸桿菌重組表達製備的酶蛋白在5.2左右，畢赤氏酵母重組表達製備的酶蛋白在6.2左右。在pH4.3-6.2中，這兩種木聚糖酶的酶活是一致的，但在pH7-9.2中，改良木聚糖酶的酶活要大於原始木聚糖酶。在pH8.2的50mMTris-Hcl下，大腸桿菌重組表達製備的原木聚糖酶的酶活是最高酶活的34%，而改良木聚糖酶達到了48%;畢赤氏酵母重組表達製備的原木聚糖酶的酶活只是最高酶活的21%，而改良木聚糖酶達到了61%，由此可見，改良木聚糖酶在強鹼下具有更高的活性。(3)改良木聚糖酶在高溫下能夠在較長時間內持續分解木聚糖在75。C和80°C，pH5.0，50mM擰檬酸緩衝液中，測定5-60min內改良和原始木聚糖酶催化產生的還原糖的產量。結果見圖11(大腸桿菌重組表達製備的酶蛋白)和圖12(畢赤氏酵母重組表達製備的酶蛋白)。在75T下，大腸桿菌表達的改良木聚糖酶催化反應40min後，產物量是5min反應產物量的4倍，而原始木聚糖酶只有2倍；在8(TC下，畢赤氏酵母表達的改良木聚糖酶催化反應35min後，產物量是5min反應產物量的2.5倍，而原始木聚糖酶只有1.5倍，表明改良木聚糖酶能夠在35-40min內持續分解木聚糖，而原始木聚糖酶的持續分解時間只有10min左右。(4)改良木聚糖酶的酶動力學常數在65°C，pH5.050mM檸檬酸緩衝液中，以木聚糖為底物，利用Lineweaver-Burk雙倒數法測定改良和原始木聚糖酶的i^和《^值，同時計算kcat/km值。結果見表1(大腸桿菌重組表達製備的酶蛋白)和表2(畢赤氏酵母重組表達製備的酶蛋白)。大腸桿菌重組表達製備的改良木聚糖酶和畢赤氏酵母重組表達製備的改良木聚糖酶的《/^值都為原木聚糖酶的1.5倍左右，表明改良木聚糖酶具有更高的催化效率。表1大腸桿菌表達製備的原始木聚糖酶和改良木聚糖酶的動力學常數tableseeoriginaldocumentpage13序歹U表復旦大學—種耐高溫耐強鹼的木聚糖酶改良基因及其基因工程菌株516Patentlnversion3.11675DNA人工合成CDS(1)…(675)1C33sgtGinSerttctgtagttcsgettctcacPheCysSerSerAlaSerHistctggacaaagtgtaaaggtaSerGlyGinSerValLysVal1015483ccggcThrGly33C33gAsn!Lys203ttggasetsttlieGlyThrlieggtGly25ggtGlygttValggtGlyt3CTyrgssttsGluLeu30tggT:rp96getgstagtggt33t33CagtgetaictttctsttctgatggttecttcAlaAspSerGlyAsnAsnSerAlaThrPheTyrSerAspGlySerPhe354045144teatgtactttcess33tgetggggsttsctt3tgtcgtsgtggtcttSerCysThrPheGinAsnAlaGlyAspTyrLeuCysArgSerGlyLeu505560192tctttcgatagtactaag3ccccatctcaaattggtcgtatgasggetSerPheAspSerThrLysThrProSerGinlieGlyArgMetLysAla657.07580240gatttc333cttgtcssscaa33tsgttecastgttggtt3ttectst288AspPheLysLeuValLysGinAsnSerSerAsnValGlyTyrSerTyr859095gttggtValGlygtttacValTyr100ggtGlytggsetTrpThragaagtccaArgSerPro105cttgtcLeuValg33GlutscTyr110t3CTyr3ttlie336gtcgstValAsp33ttggAsnTrp115cttLeu3gtCC3SerProttcccaccsPheProPro120ggtgstGlyAsptggTrp125gttValggtGlyAsn38433g33gLysLys130catggtHisGlytctSerttcsetPheThr135attgatggtlieAspGlygetC33AlaGin140t3CTyrsetThrgttValTyr432g3333CGluAsn145setcgtThrArgsetThrggtCC3GlyPro150tct3ttgstSerlieAspggtgstGlyAsp1553CCThr3CCThrttcPhe33tAsn160480t3CGinTyrtttsgtPheSer3ttCgtC33lieArgGin165essgetcgtGinAlaArg170gattgtAspCysggtGlysecThratt工le175Asp5283tttctlieSergetC3CAlaHis180tttgatessPheAspGintgggassagcttggtstgset3tgggtTrpGluLysLeuGlyMetThrMetGly185190576333tt3LysLeucatgasHisGlu195gecsaggttAlaLysValttatgtgsagecggtsscgttsscggtLeuCysGluAlaGlyAsnValAsnGly200205624ggtgecGlyAla210sgtggtSerGlysecgetgstThrAlaAsp215ttcccstacgc333ggtttscsttggtPheProTyrAlaLysValTyr工leGly220672gst675Asp2252225PRT人工合成2GinSerPheCysSerSerAlaSerHisSerGlyGinSerValLysVal151015ThrGlyAsnLyslieGlyThrlieGlyGlyValGlyTyrGluLeuTrp202530AlaAspSerGlyAsnAsnSerAlaThrPheTyrSerAspGlySerPhe354045SerCysThrPheGinAsnAlaGlyAspTyrLeuCysArgSerGlyLeu505560SerPheAspSerThrLysThrProSerGinlieGlyArgMetLysAla65707580AspPheLysLeuValLysGinAsnSerSerAsnValGlyTyrSerTyr859095ValGlyValTyrGlyTrpThrArgSerProLeuValGluTyrTyrlie100105110ValAspAsnTrpLeuSerProPheProProGlyAspTrpValGlyAsn115120125LysLysHisGlySerPheThrlieAspGlyAlaGinTyrThrValTyr130135140GluAsnThrArgThrGlyProSerlieAspGlyAspThrThrPheAsn145150155160GinTyrPheSerlieArgGinGinAlaArgAspCysGlyThrlieAsp165170175lieSerAlaHisPheAspGinTrpGluLysLeuGlyMetThrMetGly180185190LysLeuHisGluAlaLysValLeuCysGluAlaGlyAsnValAsnGly195200205GlyAlaSerGlyThrAlaAspPheProTyrAlaLysValTyrlieGly210215220Asp225339DNA人工合成3ggcggatccatgcsasgtttctgtsgttcsgcttctcsc436DNA人工合成4gcggcggccgc3tc3cc33tgtasscctttgcgtst539DNA人工合成5ggcgaattcatgcaaagtttctgtagttcagcttctcac639DNA人工合成6gcggcggccgctcsstcsccsaitgtssacctttgcgtst權利要求1.一種耐高溫耐強鹼的木聚糖酶改良基因，其特徵在於，該木聚糖酶改良基因的胺基酸序列如SEQIDNO2所示。2.如權利要求1所述的木聚糖酶改良基因，其特徵在於，該木聚糖酶改良基因的核苷酸編碼序列如SEQIDNOl所示。3.—種含有權利要求1或者2所述木聚糖酶改良基因的核苷酸編碼序列的質粒。4.如權利要求3所述的質粒，其特徵在於，該質粒是原核或者真核表達質粒。5.如權利要求4所述的質粒，其特徵在於，該質粒是酵母表達質粒。6.如權利要求5所述的質粒，其特徵在於，該質粒是畢赤氏酵母表達質粒。7.—種含有權利要求5所述表達質粒的酵母基因工程菌株。8.如權利要求7所述基因工程菌株，其特徵在於，該菌株是畢赤氏酵母基因工程菌株。9.如權利要求1所述基因的製備方法，其特徵在於，以Xyn-CDBFV基因為模板，將其核苷酸編碼序列第601位突變為胸腺嘧啶。10.如權利要求7所述基因工程菌株的製備方法，其特徵在於，用權利要求5所述的質粒轉化酵母菌即可。全文摘要本發明提供了一種編碼高溫強鹼下具有高活性的木聚糖酶的改良基因、其重組質粒、含有該基因的重組酵母基因工程菌株及其製備方法。改良後的木聚糖酶和原始木聚糖酶相比，由原始木聚糖酶胺基酸序列的201位的甘氨酸突變為半胱氨酸。改良木聚糖酶較原始木聚糖酶具有更高的熱穩定性，在75℃處理10分鐘後，改良木聚糖酶的殘餘活性達到了80％，而原始木聚糖酶只有15％。改良木聚糖酶在高溫強鹼的環境下的活性是原木聚糖酶活性的1.5-2倍，並能在高溫下長時間分解木聚糖。本發明還提供了含有該改良基因的重組畢赤氏酵母基因工程菌株。本發明的改良木聚糖酶可以廣泛應用於造紙，飼料以及食品工業。文檔編號C12N1/19GK101392266SQ200810200060公開日2009年3月25日申請日期2008年9月18日優先權日2008年9月18日發明者紅呂,淳遊,強黃申請人:復旦大學;武漢新華揚生物有限責任公司