二聚噬菌體溶素的製作方法

2023-06-28 00:48:51

二聚噬菌體溶素的製作方法【專利摘要】本發明提供分離的二聚鏈球菌屬(streptococcus)-特異性噬菌體溶素具有彼此共價連接的2個鏈球菌屬(streptococcus)-特異性噬菌體溶素單體，及針對一種或更多鏈球茵屬(streptococcus)細菌具有殺滅活性。也提供二聚溶素的藥物組合物和它們用於治療性治療或緩和感染或細菌定居的用途。二聚溶素也可用於淨化多孔和非-多孔表面或裝置。【專利說明】二聚嗤菌體溶素【【
技術領域：
】】[0001]本發明涉及用於檢測及殺滅鏈球菌屬（Streptococcus)細菌的二聚溶素的產生和使用，尤其是突變體溶素，其能二聚化為具有增強的活性和/或穩定性的二聚溶素。本發明涉及用於細菌，特別鏈球菌屬（Streptococcus)細菌株，及相關的病情的預防性和治療性改善，去定居和處理的方法。本發明的方法利用二聚噬菌體溶素，特別二聚肺炎球菌噬菌體溶素，包括Cpl-1裂解性酶和其變體。【【
背景技術：
】】[0002]隨著更多抗生素用於廣泛的病和其他病情，藥物抗性細菌的出現已是醫學中的主要問題。醫院感染是美國死亡的第8號主導原因，大多由於耐藥的和新出現的病原體。更多抗生素使用和顯示抗性的細菌數提示了更長治療時間。此外，現在更頻繁地使用廣譜非特異性抗生素，其中一些對患者具有有害效應。隨此增加的使用的相關的問題是許多抗生素不容易穿透粘液襯。此外，對抗生素過敏的人數呈現增加。因此，對新抗細菌方法，尤其經新模式操作或提供殺滅病原性細菌的新手段的那些有商業需求。[0003]革蘭氏陽性細菌被含有多肽和多糖的細胞壁圍裹。革蘭氏陽性細胞壁呈現為廣泛密壁，其20?80nm厚及由多個肽聚糖互連層組成。60%和90%之間的革蘭氏陽性細胞壁是肽聚糖，提供細胞形狀，剛性結構，及對滲透休克的抗性。細胞壁不排斥革蘭氏染色結晶紫，允許細胞染成紫色，由此稱為"革蘭氏陽性"。革蘭氏陽性細菌包括但不限於放線菌屬（Actinomyces),芽孢桿菌屬（Bacillus),利斯特菌屬（Listeria),乳球菌屬(Lactococcus)，葡萄球菌屬（Staphylococcus)，鏈球菌屬（Streptococcus)，腸球菌屬(Enterococcus)，分枝桿菌屬（Mycobacterium)，棒桿菌屬（Corynebacterium)和梭菌屬(Clostridium)。醫學上關聯物種包括釀膿鏈球菌（Streptococcuspyogenes),肺炎鏈球菌（Streptococcuspneumoniae)，金黃色葡萄球菌（Staphylococcusaureus)和奠腸球菌(Enterococcusfaecalis)〇[0004]抑制細胞壁合成的抗細菌劑，諸如青黴素和頭孢菌素，幹擾肽聚糖肽間連接及減弱革蘭氏陽性和革蘭氏陰性細菌的細胞壁。因為革蘭氏陽性細菌的肽聚糖被暴露，革蘭氏陽性細菌是更敏感於這些抗生素。有利地，缺乏細胞壁的真核生物細胞及不敏感於這些藥物或其他細胞壁劑。[0005]已嘗試通過使用噬菌體治療細菌疾病。但是，噬菌體直接導入動物來預防或抵禦疾病具有特定缺點。特別是，細菌和噬菌體需處於用於噬菌體附著的正確及同步的生長循環。此外，必需有正確數量的噬菌體以附著於細菌；如果有太多或太少噬菌體，會無附接或無裂解酶產生。噬菌體必需也有足夠活性。噬菌體也被許多物質抑制，包括來自其欲攻擊的生物的細菌碎片。使直接使用噬菌體治療細菌感染變得更複雜的是致使噬菌體非-功能性的免疫學反應的可能性。[0006]新抗微生物治療方法包括基於酶的抗生素（"酶抗生素"）諸如噬菌體溶素。噬菌體使用這些溶素消化它們的細菌宿主的細胞壁，通過低滲裂解釋放病毒後代。當純化的、重組溶素被外部添加到革蘭氏陽性細菌時，導致類似結果。針對革蘭氏陽性病原體的溶素的高致死活性使得它們成為作為治療劑開發的有吸引力的候選體。噬菌體溶素起初被建議用於根除病原性鏈球菌的鼻咽集落（Loeffler，J.M.etal(2001)Science294:2170-2172;Nelson,D.etal(2001)ProcNatlAcadSciUSA98:4107-4112)。溶素是雙鏈DNA(dsDNA)噬菌體用以使宿主裂解與完成病毒組裝配合而使用的裂解性機理的部分（Wang，I.N.等人(2000)AnnuRevMicrobiol54:799-825)。噬菌體編碼在細菌膜打開孔隙的穿孔素，及被稱為使細菌壁中的鍵斷裂的溶素的肽聚糖水解酶。在感染後期，溶素轉位進細胞壁基質中，其中其快速水解對於肽聚糖完整性必要的共價鍵，導致細菌裂解和相伴的後代噬菌體釋放。[0007]溶素家族成員呈現模塊設計，其中催化性結構域融合到特異性或結合結構域(Lopez，R.等人（1997)MicrobDrugResist3:199_211)。溶素可從細菌基因組之內的病毒原噬菌體序列克隆，並用於治療（Beres，S.B.等人（2007)PL〇S0NE2(8):1-14)。當外部添加時，溶素能接近革蘭氏陽性細胞壁的鍵（圖1)(Fischetti，V.A.(2008)CurrOpinionMicrobiolll:393-400)。溶素已顯示針對多種革蘭氏陽性病原體（尤其克隆它們的細菌）展示高致死活性，提起它們作為治療劑開發的可能性（Fischetti，V.A.(2008)CurrOpinionMicrobiol11:393-400;Nelson，D.L.等人（2001)ProcNatlAcadSciUSA98:4107-4112)。[0008]噬菌體裂解性酶已建立為在評定和通過各種施用途徑特定治療各種類型的受試者感染中有用。例如，美國專利5,604,109(Fischetti等人）涉及通過酶促消化（通過半-純化的組C鏈球菌噬菌體關聯的溶素酶）而快速檢測臨床樣本中的組A鏈球菌。此酶工作成為另外的研究的基礎，導致治療疾病的方法。Fischetti及Loomis專利（美國Patents5,985,271，6,017,528和6,056,955)公開了由用C1噬菌體感染的組C鏈球菌細菌產生的溶素酶的使用。美國專利6,248,324(Fischetti和Loomis)公開了用於皮膚病學感染的組合物，其使用在由在適合局部應用於真皮組織的載體中的裂解性酶。美國專利6,254,866(Fischetti和Loomis)公開了治療消化道細菌感染的方法，包括施用特異於感染細菌的裂解性酶。用於遞送至少一種裂解性酶至消化道的載體選自：栓劑灌腸劑，糖漿或腸包被的丸劑。美國專利6,264,945(Fischetti和Loomis)公開了由腸胃外導入（肌內，皮下或靜脈內）由用特異於該細菌的噬菌體感染的細菌產生的至少一種裂解性酶和用於將裂解性酶遞送進患者的適當的載體來治療細菌感染的方法和組合物。[0009]已自各種噬菌體鑑定及克隆噬菌體關聯的裂解性酶，各顯示在殺滅特定細菌株中有效。美國專利7,402,309,7,638,600及公開的？(：1'申請冊2008/018854提供作為治療或減少炭疽芽孢桿菌（Bacillusanthracis)感染的抗細菌劑有用的不同噬菌體-關聯的裂解性酶。美國專利7,569,223描述肺炎鏈球菌（Streptococcuspneumoniae)的肺炎球菌噬菌體裂解性酶Pal。對於腸球菌屬（^Enterococcus)(糞腸球菌(B.faecalis)及屎腸球菌（E.faecium)，包括萬古黴素抗性株）有用的溶素描述於美國專利7,582291。US2008/0221035描述在殺滅組B鏈球菌中高度有效的突變PlyGBS溶素。表示為ClyS的嵌合溶素，其具有針對葡萄球菌屬（Staphylococci)細菌，包括金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)的活性，詳述於W02010/002959。[0010]肺炎鏈球菌（Streptococcuspneumoniae)(肺炎鏈球菌（S.pneumoniae))，革蘭氏陽性包裹的雙球菌，是人病諸如菌血症，腦膜炎，肺炎，中耳炎及鼻竇炎的主要病原因子。此細菌負責每年世界上>1百萬5歲以下兒童的死亡（English，M(2000)PaediatrRespirRevl:21-5)和社區-獲取的肺炎是USA中死亡的第6大最常見原因（File，TM(2004)AmJMedll7Suppl3A:39S?50S)。而且，肺炎鏈球菌（S.pneumoniae)是世界上急性中耳炎的主要原因，每年在USA影響多於5百萬兒童的疾病（⑶C(2009)Pneumococcaldiseases,p.217-30.Inff.Atkinson,etal(ed.),Epidemiologyandpreventionofvaccine-preventablediseases(11thed),PublicHealthFoundation,WashingtonDC)〇最後，流感大流行病所致的繼發感染佔>90%的死亡，其中肺炎鏈球菌（S.pneumoniae)是這些死亡的主導原因（Brundage，JFShanksGD(2008)EmergInfectDisl4:1193_9;Brundage,JFShanksGD(2007)JInfectDisl96:1717-8；Morens,DMetal(2009)NEnglJMed361:225-9;Morens,DMetal(2009)PublicHealthRepl24:22-5)。肺炎球菌感染常常用抗生素治療，但由於就大環內酯，氟喹諾酮和頭孢菌素報導的增加的抗性發生率（Reinert，RR(2009)ClinMicrobiolInfectl5Suppl3:l_3)而細菌學地被確認治療失敗（Mandell，LAetal(2002)ClinInfectDis35:721-7)。治療百萬中耳炎病例所致的抗生素的過度使用和誤用僅貢獻於抗性株的出現（Goossens，H(2009)ClinMicrobiolInfectl5Suppl3:12-5)。總之，這些觀察促使了對於由完全不同機理的發揮作用，用於治療和預防肺炎球菌關聯的疾病的新藥物的需求。[0011]在發現抗生素之前，噬菌體，細菌的天然主要捕食者，被視為控制病原性細菌的可能的方法。那時公開了成功的使用噬菌體治療感染的幾則報導（SulakVelidze，AandBarrow,P(2005)Phagetherapyinanimalsandagribusiness,p.335-71.InE.KutterandA.Sulakvelidze(ed.),Bacteriophages:BiologyandApplications,CRCPress,USA；Sulakvelidze,AandKutter,E(2005)Bacteriophagetherapyinhumans,p.381-426.InE.KutterandA.Sulakvelidze(ed.),Bacteriophages:BiologyandApplications,CRCPress,USA)，但40年代抗生素的出現導致西方世界噬菌體治療研究的快速減少。過去的幾十年見到對噬菌體治療和噬菌體來源的抗-細菌化合物的新興趣（Borysowski，J等人(2006)ExpBiolMed231:366-77；Fischetti,VA(2008)CurrOpinMicrobiolll:393-400)〇[0012]這些產品之一，噬菌體內溶素或溶素，已被開發用於它們對革蘭氏陽性細菌的快速殺滅作用（Borysowski，J等人（2006)ExpBiolMed231:366_77;Fischetti，VA(2008)CurrOpinMicrobiolll:393-400)。這些特定酶在噬菌體後代要逃脫細菌宿主時產生。肺炎球菌噬菌體Cp-Ι產生溶素Cpl-l，37kDa酶。此溶素如全部此類內溶素一樣構成，具有2個由柔性的接頭連接的良好定義的結構域。催化性活性局限於N-端結構域，而含有6個膽鹼-結合重複子（ChBR)和13個氨基-酸的C-端尾的C-端部分，在肺炎球菌細胞壁中的底物結合中需要。Cpl-1屬於靶向肽聚糖中的N-乙醯胞壁酸和N-乙醯-D-葡萄糖胺殘基之間的β1，4連接的溶菌酶的家族（PereZ-D〇rad〇，INEetal(2007)JBiolChem282:24990-9)。其膽鹼-依賴性活性使Cpl-1高度特異於肺炎鏈球菌（S.pneumonia)(Garcia,JL等人（1987)JVirol61:2573-80)。Cpl-1基因已被克隆進高表達載體pinlllAn，然後被過表達及純化（Loeffler，JMetal(2003)InfectImmun71:6199-204)。[0013]純化的Cpl-1已成功地在齧齒動物模型中被測試用於治療肺炎球菌膿毒症（Jado，Ietal(2003)JAntimicrobChemother52:967-73;Loeffler，JMandFischetti，VA(2003)AntimicrobAgentsChemother47:375_7)，心內膜炎（Entenza，JMetal(2005)AntimicrobAgentsChemother49:4789_92)，肺炎球菌腦膜炎（Grandgirard，Detal(2008)JInfectDisl97:1519-22),及肺炎（Witzenrath，M等人（2009)CritCareMed37:642-9)。然而，蛋白通常快速體內清除，而在至今實施的許多研究中需要Cpl_l的重複的注射或甚至連續輸注（Entenza，JMetal(2005)AntimicrobAgentsChemother49:4789-92.31；ffitzenrath,Metal(2009)CritCareMed37:642-9)〇[0014]這些結果可為Cpl-1和類似溶素的臨床開發的缺點。本領域需要具有殺滅活性且增強的臨床-關聯參數，諸如更長半衰期或減少的體內清除的可用於治療肺炎球菌疾病的改良的溶素。[0015]【發明概述】[0016]在總的方面，本發明提供突變體溶素，突變得具有容易二聚化的能力，由此產生具有增強的活性或細菌殺滅活性，及更大穩定性，包括在動物或哺乳動物中更長期穩定性和在臨床學相關的或生物學相關的環境中更久發揮細菌殺滅能力的二聚溶素。[0017]一方面，本發明提供分離的二聚抗-細菌噬菌體溶素，其包含2個特異於細菌的彼此共價連接的噬菌體溶素單體，其中所述二聚體針對一種或更多特定細菌具有殺滅活性。一方面，本發明提供分離的二聚鏈球菌屬（Streptococcus)-特異性噬菌體溶素，其包含彼此共價連接的2個鏈球菌屬（Streptococcus)-特異性噬菌體溶素單體，其中所述二聚體針對一種或更多鏈球菌屬（Streptococcus)細菌具有殺滅活性。在特定實施方式中，溶素單體與圖1和6和SEQIDNO:1中所示未突變的Cpl-1溶素具有至少80%，至少90%，至少95%胺基酸序列同一性。在特定實施方式中，溶素單體與圖7和SEQIDN0:5中所示未突變的Pal溶素具有至少80%，至少90%，至少95%胺基酸序列同一性。[0018]在特定實施方式中，溶素單體彼此化學交聯。在一該實例中，單體可經反應性基團或經單體序列中的胺基酸，包括修飾的，改變的或突變胺基酸化學交聯。溶素單體可彼此由-硫鍵共價連接。在特定例不實施方式中，各溶素單體在緊鄰於C-端，特別在自C-端14和20個胺基酸之間具有Cys殘基。在特定實施方式中，溶素單體在頭45個殘基中不具有Cys殘基。例示突變Cpl-1溶素在本文提供，包括在圖6和表1中。在一特定實施方式中，溶素單體具有圖6中所示或表1中提供的胺基酸序列。在另一實施方式中，溶素單體具有圖7所示的胺基酸序列。在特定實施方式中，溶素單體包含第1鏈球菌屬（Streptococcus)-特異性噬菌體溶素的催化性結構域和第2鏈球菌屬（Streptococcus)-特異性噬菌體溶素的結合結構域。[0019]本發明提供通過施用包含治療有效量的包含彼此共價連接的2個鏈球菌屬（Streptococcus)-特異性噬菌體溶素單體的二聚溶素的組合物來治療由鏈球菌感染導致的哺乳動物患疾病或病情的方法，其中所述二聚體針對一種或更多鏈球菌屬（Streptococcus)細菌具有殺滅活性。在特定實施方式中，感染由肺炎鏈球菌(Streptococcuspneumoniae)導致。由月市炎鏈球菌（Streptococcuspneumoniae)感染導致的疾病或病情可為菌血症，腦膜炎，肺炎，中耳炎，或鼻竇炎中的至少一種。[0020]本發明提供通過施用包含治療有效量的包含彼此共價連接的2個鏈球菌屬(Streptococcus)-特異性噬菌體溶素單體的二聚溶素的組合物來抑制或去定居哺乳動物中的鏈球菌感染的方法，其中所述二聚體針對一種或更多鏈球菌屬（Streptococcus)細菌具有殺滅活性。在特定實施方式中，感染由肺炎鏈球菌（Streptococcuspneumoniae)導致。由肺炎鏈球菌（Streptococcuspneumoniae)感染導致的疾病或病情可為菌血症，腦膜炎，肺炎，中耳炎，或鼻竇炎中的至少一種。[0021]在本發明的一方面，提供殺滅革蘭氏陽性細菌的方法，包括使細菌與包含一定量的對於殺滅革蘭氏陽性細菌有效的突變二聚溶素多肽的組合物接觸的步驟，其中單體溶素被修飾或改變為包含彼此共價連接的2個抗細菌性噬菌體溶素單體和對於殺滅革蘭氏陽性細菌有效的二聚溶素多肽。在特定該方面，提供殺滅鏈球菌屬（Streptococcus)細菌的方法，包括使細菌與包含一定量的對於殺滅鏈球菌屬（Streptococcus)細菌有效的突變二聚溶素多肽的組合物接觸的步驟，其中單體鏈球菌屬（Streptococcus)溶素被修飾或改變為包含彼此共價連接的2個鏈球菌屬（Streptococcus)噬菌體溶素單體和對於殺滅鏈球菌屬（Streptococcus)細菌有效的二聚溶素多肽。[0022]由此，提供殺滅鏈球菌屬（Str印tococcus)細菌的方法，包括使細菌與包含一定量的對於殺滅鏈球菌屬（Streptococcus)細菌有效的分離的二聚鏈球菌屬（Streptococcus)Cpl-1溶素多肽（含有包含彼此共價連接的2個Cpl-1溶素單體的突變Cpl-1溶素的分離的溶素多肽）的組合物接觸的步驟。在特定方面，提供殺滅鏈球菌屬（Streptococcus)細菌的方法，包括使細菌與包含一定量的對於殺滅鏈球菌屬（Streptococcus)細菌有效的分離的溶素多肽（包含SEQIDN0:3的胺基酸序列或與SEQIDN0:3的多肽具有至少80%同源性，85%同源性，90%同源性或95%同源性和對於殺滅革蘭氏陽性細菌有效的其變體的分離的溶素多肽）的組合物接觸的步驟。[0023]還提供殺滅鏈球菌屬（Streptococcus)細菌的方法，包括使細菌與包含一定量的對於殺滅鏈球菌屬（Streptococcus)細菌有效的分離的二聚鏈球菌屬（Streptococcus)Pal溶素多肽（含有包含彼此共價連接的2個Pal溶素單體的突變Pal溶素的分離的溶素多肽）的組合物接觸的步驟。在特定方面，提供殺滅鏈球菌屬（Streptococcus)細菌的方法，包括使細菌與包含一定量的對於殺滅鏈球菌屬（Streptococcus)細菌有效的分離的溶素多肽（包含SEQIDN0:6的胺基酸序列或與SEQIDN0:6的多肽具有至少80%同源性，85%同源性，90%同源性或95%同源性和對於殺滅革蘭氏陽性細菌有效的其變體的分離的溶素多肽）的組合物接觸的步驟。[0024]本發明提供藥物組合物，其包含治療有效量的包含彼此共價連接的2個鏈球菌屬(Streptococcus)-特異性噬菌體溶素單體的二聚溶素，其中所述二聚體針對一種或更多鏈球菌屬（Streptococcus)細菌具有殺滅活性，及藥學可接受的載體。[0025]本發明提供藥物組合物，其包含治療有效量的包含彼此共價連接的2個鏈球菌屬（Streptococcus)-特異性噬菌體溶素單體的二聚溶素，其中所述二聚體針對一種或更多鏈球菌屬（Streptococcus)細菌具有殺滅活性，且其中所述殺滅活性大於鏈球菌屬(Streptococcus)-特異性噬菌體溶素單體中的任何一種的殺滅活性，及藥學可接受的載體。[0026]在另外的方面，本發明提供用於清潔或淨化多孔或非-多孔表面的抗-微生物組合物，其包含包含彼此共價連接的2個鏈球菌屬（Streptococcus)-特異性噬菌體溶素單體的二聚溶素，其中所述二聚體針對一種或更多鏈球菌屬（Streptococcus)細菌具有殺滅活性。[0027]本發明的組合物可針對一種或更多鏈球菌屬（Streptococcus)細菌株特別展示或具有殺滅活性，特別選自：豬鏈球菌（Streptococcussuis)，馬鏈球菌（Streptococcusequi),無乳鏈球菌（Streptococcusagalactiae)(GBS),釀胺鏈球菌（Streptococcuspyogenes)(GAS),血鏈球菌（Streptococcussanguinis),格氏鏈球菌（Streptococcusgordonii)，停乳鏈球菌（Streptococcusdysgalactiae)，鏈球菌屬（Streptococcus)GES和月市炎鏈球菌（Streptococcuspneumonia)〇[0028]本發明提供淨化懷疑含有感染性細菌的無生命的表面的方法，包括用殺細菌地或抑細菌地有效量的包含包含彼此共價連接的2個鏈球菌屬（Str印tococcus)-特異性噬菌體溶素單體的二聚溶素的清潔或淨化多孔或非-多孔表面的抗-微生物組合物處理所述表面，其中所述二聚體針對一種或更多鏈球菌屬（Streptococcus)細菌具有殺滅活性。[0029]本發明包括包含彼此共價連接的2個鏈球菌屬（Streptococcus)-特異性噬菌體溶素結合結構域的二聚蛋白。本發明提供包含彼此共價連接的2個鏈球菌屬(Streptococcus)-特異性噬菌體溶素結合結構域的二聚蛋白，其中所述噬菌體溶素結合結構域中的至少一個還綴合標記物。標記物可為產生，或可被誘導產生，可檢測的信號的任何分子。標記物的非限制性例包括放射性同位素，酶，酶片段，酶底物，酶抑制物，輔酶，催化齊U，螢光團，染料，化學發光劑，發光劑或敏化劑；非-磁或磁粒子，固體支持物，脂質體，配體，或受體。[0030]本發明的診斷實用性延伸至將本溶素多肽用於篩選革蘭氏陽性細菌的存在，篩選易感的革蘭氏陽性細菌的存在，或測定細菌對由本發明的一種或更多溶素多肽殺滅或裂解的易感性的測定。[0031]在本文涵蓋及提供被修飾及嵌合或是融合蛋白，或被標記的溶素多肽。在嵌合或融合蛋白中，本發明的溶素多肽可共價附接於可提供另外的功能或增強溶素多肽的用途或應用的實體，包括例如標籤，標記物，祀向部分或配體，細胞結合或細胞識別基序或試劑，抗細菌劑，抗體，抗生素。例示標記物包括放射性標記物，諸如同位素3H，14C，32P，35S，36C1，51Cr，57C〇,58C〇,59Fe，9°Y，125I，131I和186Re。標記物可為酶，標記的溶素多肽的檢測可由本領域知道的任何目前利用的或接受的比色，分光光度計測量，螢光分光光度計測量，電流測定或氣體定量技術實現。[0032]本領域技術人員參看以下說明，參照以下例示圖而明晰其他目的和優勢。【【專利附圖】【附圖說明】】[0033]圖l.Cpl-l(SEQIDN0:1)和肺炎鏈球菌（S.pneumoniae)LytA(SEQIDN0:2)胺基酸序列的ClustalW比對。2個催化性殘基（D10和E94)以紅色顯示。lytA的天然的二聚化中涉及的13個胺基酸及Cpl-1中的對應胺基酸通過加下劃線顯示。殘基D324以藍色顯不。[0034]圖2A?2C描繪（A)純化的Cpl-1的考馬斯染色的非-還原SDS-PAGE凝膠。泳道1，分子量標誌物，及泳道2,由在DEAE-瓊脂糖上親和純化獲得的純化的Cpl-1。（B)純化的Cpl-嚴5S'D324e突變體的考馬斯染色的非-還原SDS-PAGE凝膠。泳道1，分子量標誌物。泳道2,由在DEAE-瓊脂糖上親和純化獲得的純化的Cpl-1G45S'D324G，及泳道3,用10mM的DTT還原的Cpl-le45S，D324e。（C)在S印hadexGlOO上凝膠過濾之後純化的Cpl-le45S，D324e突變二聚體富集物的考馬斯染色的非-還原SDS-PAGE凝膠。泳道1，分子量標誌物。泳道2,由在S印hadexG100上凝膠過濾獲得的純化的Cpl-1G45S'D324G二聚體（第1純化），及泳道3,由在S印hadexG100上凝膠過濾獲得的純化的Cpl-1G45S'D324G二聚體（第2純化）。[0035]圖3顯示於37°C溫育15分鐘之後Cpl-1對肺炎鏈球菌（S.pneumoniae)DCC1490的5.108CFU/ml懸浮液的體外抗-細菌活性。Cpl-lwt(實心圓形），ImMDTT中的Cpl-lc45S，D324c單體形式（空心矩形），及〇?1-1^'1)324°二聚體（開環）。對於各酶和條件11=4。[0036]圖4.小鼠中酶抗生素的血漿清除。給Balb/c小鼠注射100μ1PB50mM，pH7.4中的12.16nmol的Cpl-1(實心圓形）或Cplle45S'D324e二聚體（開環），對於各時間點η=3。[0037]圖5.於37°C，幾種純化的Cpl-1突變二聚體對肺炎鏈球菌（S.pneumoniae)DCC1490的5.108CFU/ml懸浮液的體外抗-微生物活性。Cpl-lwt(實心圓形），Cpl-le45S，Q85C二聚體（實心菱形），Cpl-le45S'D194e二聚體（實心三角形），Cpl-嚴s'N214e二聚體（實心矩形），Cpl-1G45S'G216G二聚體（空心三角形），Cpl-1G45S'D256G二聚體（菱形），Cpl-1G45S'S269G二聚體（開環），Cpl-le45S'D324e二聚體（空心矩形）。以0.5mg/ml的濃度測試全部酶。各點表示3次實驗的平均值。[0038]圖6描繪（未突變的）Cpl-1(SEQIDN0:1)，及突變體溶素C45S(SEQIDN0:4)和C45S，D324C(SEQIDN0:3)的對齊的胺基酸序列。突變體中的胺基酸變化加了下劃線。[0039]圖7描繪Cpl-1(SEQIDNO:1)，Pal(SEQIDN0:5)和肺炎鏈球菌（S.pneumoniae)LytA(SEQIDN0:2)胺基酸序列的對齊的胺基酸序列。在全部3個序列之中相同的胺基酸由星號*表示。LytA的天然的二聚化中涉及的13個胺基酸和Cpl-1及Pal中的類似胺基酸通過加下劃線及加粗指示。框住Cpl-1(殘基D324)和Pal(殘基D280)的例示二聚體突變體中突變的對應胺基酸。[0040]【發明詳述】[0041]在本文描述針對肺炎鏈球菌（S.pneumoniae)具有殺滅活性的二聚鏈球菌屬(Streptococcus)-特異性噬菌體溶素。一般而言，二聚噬菌體溶素含有彼此共價連接的2個鏈球菌屬（Streptococcus)-特異性噬菌體溶素單體，其中所述二聚體針對一種或更多鏈球菌屬（Streptococcus)細菌具有活性。溶素二聚體的溶素單體可與未突變的Cpl-1(圖1，SEQIDN0:1)具有至少80%，85%，90%，95%，97%，98%，99%或甚至至少99.5%胺基酸序列同一性。溶素二聚體的溶素單體可與未突變的Pal(圖7,SEQIDN0:5)具有至少80%，85%，90%，95%，97%，98%，99%或甚至至少99.5%胺基酸序列同一性。本文提供的穩定化的二聚溶素展示增加的細菌殺滅活性，原單體分子的大致兩倍體外抗-細菌活性。二聚溶素也在感染後5分鐘和5小時之間顯示接近10倍降低的血漿清除，在血漿或動物中具有降低的血漿清除或增加的穩定性。[0042]圖1展示LytA的C-端區的胺基酸序列和鏈球菌屬（Streptococcus)溶素Cpl-1同源（73/142相同殘基，及55/69個殘基是保守性取代）。C-端13個胺基酸負責肺炎鏈球菌（Streptococcuspneumoniae)自溶素LytA的二聚化。有趣的是，在此區內，Cpl-1和LytA之間10/13胺基酸是同一的。完全有活性的LytA是由通過膽鹼相互作用起始的2個LytA單體的尾尾關聯組成的膽鹼-結合同源二聚體。二聚化的主驅動力由C-端膽鹼結合區6和7中的幾個殘基之間的分子間疏水相互作用產生的疏水核心提供（8)。LytA的13個C-端殘基負責有活性的同源二聚體的形成，其活性顯著地大於天然單體。實際上，缺少此13個胺基酸延伸物的LytA的重組單體形式（27)保留小於10%的酶的催化效率（24)。Cpl-1和LytA的序列比對揭示的延伸的相似性，尤其在LytA二聚化中涉及的酶的C-端尾之內（圖1)。人中被估計大致60?65kDa的血管球過濾閾值的存在（17)提示Cpl-1的二聚形式（74kDa的MW)可顯示相比單體系統性清除顯著減小。由共價鍵連接及由二硫鍵穩定化的2個單體組成的Cpl-1二聚體由此已在本文加工及檢查其相比Cpl-1的單體形式的體外活性和體內血漿清除。而且，及因為幾種其他噬菌體溶素已顯示或懷疑二聚化（25,26)，此代表增加特定噬菌體溶素的活性和/或藥代動力學的一般方式。[0043]根據本發明可採用本領域技術人員的技能之內的常規分子生物學，微生物學和重組DNA技術。該技術在文獻中完全解釋。見，例如，Sambrook等人，"MolecularCloning:ALaboratoryManual"（1989)；^CurrentProtocolsinMolecularBiology〃VolumesI-III[Ausubel，R.M.，ed.(1994)];"CellBiology:ALaboratoryHandbook"VolumesI_III[J·E.Celis,ed.(1994))]/'CurrentProtocolsinImmunology^VolumesI-III[Coligan，J.E.，ed.(1994)];"01igonucleotideSynthesis"(M.J.Gaited.1984);''NucleicAcidHybridization^[B.D.Hames&S.J.Higginseds.(1985)];〃TranscriptionAndTranslation^[B.D.Hames&S.J.Higgins,eds.(1984)];〃AnimalCellCulture"[R.I.Freshney,ed.(1986)]/'ImmobilizedCellsAndEnzymes"[IRLPress,(1986)]；B.Perbal,〃APracticalGuideToMolecularCloning"（1984)〇[0044]因此，如果在本文出現，以下術語應具有如以下及此部分提供及給出的定義。[0045]術語〃鏈球菌屬（Streptococcus)二聚體溶素〃，〃Cpl_l二聚溶素〃，〃Cpl_l二聚體"，"二聚Cpl-Γ'和未特別列出的任何變體，可在本文互換使用，及如貫穿本申請和權利要求使用指稱包括單或多個蛋白，及特別二聚體蛋白的蛋白性物質，及延伸至具有本文所述的及圖6和表1，及SEQIDN0:3中顯示的胺基酸序列數據，及本文及權利要求中所述的活性特徵的那些蛋白。因此，同樣涵蓋顯示基本上相當或改變的活性的蛋白。這些修飾可為有意的，例如，諸如通過定點誘變獲得的修飾，或可為意外的，諸如通過作為複合物或其命名的亞基的生產者的宿主中突變獲得的那些。而且，術語〃鏈球菌屬（Streptococcus)二聚體溶素〃，〃Cpl-l二聚溶素〃，〃Cpl-l二聚體"，"二聚Cpl-Γ'旨在包括在本文特別引用的蛋白以及全部基本上同源類似物，片段或截短，及等位基因變異的範圍之內。[0046]術語〃鏈球菌屬（Streptococcus)二聚體溶素〃，〃pal二聚溶素〃，〃pal二聚體"，"二聚Pal"和未特別列出的任何變體，可在本文互換使用，及如貫穿本申請和權利要求使用指稱包括單或多個蛋白，及特別二聚體蛋白的蛋白性物質，及延伸至具有本文所述及圖7中，及SEQIDN0:5中顯示的胺基酸序列數據，及本文及權利要求中所述的活性特徵的那些蛋白。因此，蛋白顯示基本上相當體或改變的活性同樣涵蓋。這些修飾可為有意的，例如，諸如通過定點誘變獲得的修飾，或可為意外的，諸如通過作為複合物或其命名的亞基的生產者的宿主中突變獲得的那些。而且，術語〃鏈球菌屬（Str印tococcus)二聚體溶素〃，"pal二聚溶素〃，〃pal二聚體"，"二聚Pal"旨在包括在本文特別引用的蛋白以及全部基本上同源類似物，片段或截短，及等位基因變異的範圍之內。[0047]【多肽和裂解性酶】[0048]〃裂解性酶〃包括在適合的條件下及在關聯時期期間殺滅一種或更多細菌的任何細菌細胞壁裂解性酶。裂解性酶的例包括，無限制地，各種醯胺酶細胞壁裂解性酶。[0049]〃鏈球菌屬（Streptococcus)裂解性酶〃包括能在適合的條件下及在關聯時期期間殺滅至少一種或更多鏈球菌屬（Streptococcus)細菌的裂解性酶。[0050]"噬菌體裂解性酶"指稱自噬菌體提取的或分離的裂解性酶或具有維持裂解性酶功能性的類似蛋白結構的合成的裂解性酶。[0051]裂解性酶能特別切割存在於細菌細胞的肽聚糖的鍵而破壞細菌細胞壁。目前也假定細菌細胞壁肽聚糖在多數細菌之中高度保守，及僅少個鍵合的切割可破壞細菌細胞壁。噬菌體裂解性酶可為醯胺酶，儘管其他類型的酶是可能的。切割這些鍵的裂解性酶的例是各種醯胺酶諸如胞壁質酶，氨基葡萄糖苷酶，內肽酶或N-乙醯-胞壁醯-L-丙氨酸醯胺酶。Fischetti等人（2008)報導C1鏈球菌噬菌體溶素酶是醯胺酶。Garcia等人（1987,1990)報導來自Cp-Ι噬菌體的來自肺炎鏈球菌（S.pneumoniae)的Cpl溶素是溶菌酶。Caldentey及Bamford(1992)報導來自phi6假單胞菌屬（Pseudomonas)噬菌體的裂解性酶是分裂由間-二氨基庚二酸和D-丙氨酸形成的肽橋的內肽酶。大腸埃希氏菌（E.coli)Tl和T6噬菌體裂解性酶是如來自利斯特菌屬（Listeria)噬菌體（ply)的裂解性酶的醯胺酶（Loessner等人，1996)。也有本領域知道的能切割細菌細胞壁的其他裂解性酶。[0052]〃由噬菌體遺傳編碼的裂解性酶〃包括能例如通過具有針對宿主細菌的至少一些細胞壁裂解性活性殺滅宿主細菌的多肽。多肽可具有包括天然序列裂解性酶和其變體的序列。多肽可從各種來源，諸如自噬菌體（"噬菌體"）分離，或由重組或合成方法製備，諸如由Garcia等人描述的那些和也如在本文提供。多肽可在羧基末端側包含膽鹼結合部分和可特徵在於在氨基末端側能切割細胞壁肽聚糖的酶活性（諸如作用於肽聚糖中的醯胺鍵的醯胺酶活性）。已描述包括多種酶活性，例如2個酶促結構域的裂解性酶，諸如PlyGBS溶素。一般而言，裂解性酶的分子量可在25,000和35,000Da之間及包含單個多肽鏈；但是，此可依賴於酶鏈改變。分子量可通過在變性十二烷基硫酸鈉凝膠電泳上測定和與分子量標誌物比較來最便利地測定。[0053]"天然序列噬菌體關聯的裂解性酶"包括與源於細菌的酶具有相同的胺基酸序列的多肽。該天然序列酶可是分離的或可由重組或合成手段產生。[0054]術語〃天然序列酶〃包括酶的天然存在的形式（例如，替代性地剪接的或改變的形式）和天然存在的變體。在本發明的一實施方式中，天然序列酶是由來自特異於鏈球菌屬（Streptococcus)的噬菌體的基因遺傳編碼，及特別是天然Cpl-Ι溶素或天然Pal溶素的成熟或全長多肽。當然，許多變體是可能的及知道的，如在出版物諸如Lopezetal.,MicrobialDrugResistance3:199-211(1997)；Garciaetal.,Gene86:81-88(1990)；Garciaetal.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA85:914-918(1988)；Garciaetal.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA85:914-918(1988)；Garciaetal.,StreptococcalGenetics(J.J.FerrettiandCurtiseds.,1987)；Lopezetal.,FEMSMicrobiol.Lett.100:439-448(1992)；Romeroetal.,J.Bacterio1.172:5064-5070(1990)；Rondaetal.,Eur.J.Biochem.l64:621-624(1987)andSanchezetal.,Gene61:13-19(1987)中公認的。各這些參考文獻的內容，特別序列表及比較序列的關聯的文本，包括關於序列同源性的聲明，特別通過引用以它們的整體併入本文。[0055]"變體序列裂解性酶"包括由不同於裂解性酶的多肽序列，但保留功能活性表徵的裂解性酶。裂解性酶可，在一些實施方式中，由特異於鏈球菌屬（Streptococcus)的噬菌體遺傳編碼，其與本裂解性酶序列，如圖1，圖6和圖7中提供的，包括SEQIDN0:3,4和5的變體裂解性酶具有特定胺基酸序列同一性。例如，在一些實施方式中，有功能活性的裂解性酶可通過破壞細菌的細胞壁殺滅鏈球菌屬（Streptococcus)細菌，及其他敏感的細菌，如在本文提供，或如之前描述及本領域技術人員知道的。有活性的裂解性酶（如圖1，圖6和圖7中提供的，包括SEQIDNO:3,4和5的變體裂解性酶）可與本裂解性酶序列具有60，65,70,75,80,85,90,95,97,98,99或99.5%胺基酸序列同一性。該噬菌體關聯的裂解性酶變體包括，例如，包括在本裂解性酶序列的序列N或C末端改變或添加或刪除一個或更多胺基酸殘基的裂解性酶多肽。在特定方面，噬菌體關聯的裂解性酶會與天然噬菌體關聯的裂解性酶序列具有至少約80%或85%胺基酸序列同一性，特別至少約90%(例如90%)胺基酸序列同一性。最特別噬菌體關聯的二聚裂解性酶變體會與本天然噬菌體關聯的裂解性酶序列（如在圖1，圖6和圖7或表1中提供的或包括SEQIDNO:1或5的本序列，或SEQIDN0:3,4或6的突變體序列）具有至少約95%(例如·95%)胺基酸序列同一性。[0056]關於本文鑑定的噬菌體關聯的裂解性酶序列的〃百分率胺基酸序列同一性〃在本文被定義為，在相同的閱讀框對齊序列及，如果必需，導入間隔而達到最大百分率序列同一性，及不考慮作為序列同一性的部分的任何保守性取代之後，與噬菌體關聯的裂解性酶序列中的胺基酸殘基同一的候選序列中的胺基酸殘基的百分率。[0057]關於本文鑑定的噬菌體關聯的裂解性酶序列的〃百分率核酸序列同一性〃在本文定義為，在對齊序列及，如果必需，導入間隔而達到最大百分率序列同一性之後，與噬菌體關聯的裂解性酶序列中的核苷酸同一的候選體序列中的核苷酸的百分率。[0058]為了測定2個核苷酸或胺基酸序列的百分率同一性，為最佳比較目的對齊序列(例如，可在第1核苷酸序列的序列中導入間隔）。然後比較在對應核苷酸或胺基酸位置的核苷酸或胺基酸。當第1序列中的位置被與第2序列中的對應位置的相同的核苷酸或胺基酸佔據，則分子在該位置同一。2個序列之間的百分率同一性是由序列共享的同一位置數的函數（即，％同一性=同一位置#/位置總#X100)。[0059]2個序列之間的百分率同一性的測定可通過使用數學算法實現。用於比較2個序列的數學算法的優選的，非限制性例是Karlin等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:5873-5877(1993)的算法。該算法將合入NBLAST程序，其可用於鑑定與本發明的核苷酸序列具有期望的同一性的序列。為了比較目的而獲得帶空位的比對，可如描述於NucleicAcidsRes,25:3389-3402(1997)使用空位BLAST。當利用BLAST和空位BLAST程序時，可使用相應程序（例如，NBLAST)的默認參數。見由NationalCenterforBiotechnologyInformation,NationalLibraryofMedicine,NationalInstitutesofHealth提供的程序。在一實施方式中，用於序列比較的參數可設置為W=12。參數也可改變（例如，W=5或W=20)。值"W〃決定對於將2個序列鑑定為含有同一性區的程序而言，多少連續核苷酸必需是同一的。[0060]〃多肽〃包括聚合物分子由以線性方式接合的多個胺基酸組成。多肽可，在一些實施方式中，對應於由天然存在的多核苷酸序列編碼的分子。多肽可包括保守性取代，其中天然存在的胺基酸被具有類似性質的胺基酸取代，其中該保守性取代不改變多肽的功能(見，例如，Lewin〃GenesV〃0xfordUniversityPress第1章，ρρ·9-131994)。[0061]術語〃改變的裂解性酶〃包括改組的和/或嵌合裂解性酶。[0062]特異於用特定噬菌體感染的細菌的噬菌體裂解性酶已發現有效和高效破壞目標細菌的細胞壁。裂解性酶被認為缺乏蛋白水解酶促活性，因此當在細菌細胞壁的消化期間存在時對於哺乳動物蛋白和組織是非-毀壞性的。如由科學期刊在線公開的Loeffler等人，''RapidKillingofStreptococcuspneumoniaewithaBacteriophageCellWallHydrolase,"Science,294:2170-2172(2001年12月7日）和其補充性材料（其通過引用以它們的整體併入本文）顯示，純化的肺炎球菌噬菌體裂解性酶，諸如Pal,能殺滅各種肺炎球菌。Loeffler等人通過這些實驗顯示，在接觸之後數秒內，裂解性酶Pal能體外殺滅肺炎鏈球菌（S.pneumoniae)的15個臨床染色斑，包括最常分離的血清群和青黴素抗性染色斑。用Pal治療小鼠也能以劑量-依賴性方式消除或顯著減少血清型14的鼻集落。此夕卜，因為已發現Pal的作用（像其他噬菌體裂解性酶，但不像抗生素），更特異於靶向病原體，正常菌群會保持基本上完整是可能的（M.J.Loessner,G.wendlinger,S.scherer,MolMicrobioll6，1231-41。（1995)通過引用在本文合併）。如在本文展示，例如，突變Cpl-1溶素，特別是二聚溶素，二聚Cpl-1溶素，在殺滅鏈球菌屬（Streptococcus)株，包括肺炎鏈球菌（Streptococcuspneumonia)中有效。[0063]本發明的裂解性酶或多肽可作為為預防已暴露於由得病而具有感染症狀的其他的那些的預防性治療，或作為為已成為由感染患病的那些的治療性治療，用特定噬菌體感染後由細菌生物產生。在本文提供越多溶素多肽序列和編碼溶素多肽的核酸，裂解性酶/多肽可優選經來自噬菌體基因組的分離的裂解性酶的基因產生，將基因放入轉移載體，及將所述轉移載體克隆進表達系統，使用本領域標準方法，如本文例示包括。裂解性酶或多肽可為截短，嵌合，改組的或〃天然的〃，且可為這些的組合。關聯美國專利No.5,604,109以其整體通過引用併入本文。〃改變的〃裂解性酶可以許多方式產生。在優選的實施方式中，將來自噬菌體基因組的改變的裂解性酶基因投入轉移或可移動的載體，優選質粒，及將質粒克隆進表達載體或表達系統。用於產生本發明的溶素多肽或酶的表達載體可適宜於大腸埃希氏菌（E.coli)，芽孢桿菌屬(Bacillus)或許多其他適合的細菌。載體系統也可為無細胞的表達系統。表達基因或基因組合的全部這些方法為本領域所知。裂解性酶也可通過用特異於鏈球菌屬（Streptococcus)的噬菌體感染鏈球菌屬（Streptococcus)來產生，其中所述至少一種裂解性酶唯獨裂解對其他，例如天然的或共生的，存在的細菌菌群具有至多最小效應的所述鏈球菌屬（Streptococcus)的細胞壁。[0064]"嵌合蛋白"或"融合蛋白"包含可操作地連接至異源多肽的本發明的多肽的全部或（優選有生物學活性的部分或結構域）部分。嵌合蛋白或肽，例如，通過組合具有2個或更多活性位點的2種或更多蛋白來產生。嵌合蛋白和肽可獨立地作用於相同的或不同分子，及因此具有同時治療2種或更多不同細菌感染的潛力。嵌合蛋白和肽也可用於通過在多於一個位置切割細胞壁來治療細菌感染，由此潛在地提供由單溶素分子或嵌合肽更快速或有效（或協同）殺滅。[0065]DNA構建體或肽構建體的〃異源〃區是未發現性質上與更大分子關聯的更大DNA分子之內的DNA或更大肽分子之內的肽的可鑑定的段。由此，當異源區編碼哺乳動物基因時，基因側翼通常會有在源生物基因組中不側接哺乳動物基因組DNA的DNA。異源編碼序列的另一例是編碼序列本身未在自然中發現的構建體（例如，基因組編碼序列含有內含子的cDNA，或具有不同於天然基因的密碼子的合成序列）。等位基因變異或天然存在的突變事件不產生本文定義的DNA或肽的異源區。[0066]術語〃可操作地連接的〃是指公開的多肽和異源多肽是框內融合的。異源多肽可融合到公開的多肽的N-端或C-端。嵌合蛋白由化學合成，或由重組DNA技術酶學地產生。許多嵌合裂解性酶已被產生及研究。使分別自噬菌體phiX174和MS2裂解蛋白E和L構建的基因E-L，嵌合裂解經歷內部缺失，以產生具有改變的裂解或殺滅性質的一系列新E-L克隆。在此研究中研究親本基因E，L，E-L，及E-L的內部截短的形式的裂解性活性，以基於不同跨膜結構域的體系結構的差異表徵不同裂解機理。電子顯微鏡檢和用於細胞質和周質空間的標誌物酶的釋放揭示，2種不同裂解機理可依賴於大腸埃希氏菌（E.coli)的內膜或內和外膜的蛋白的穿透區別（FEMSMicrobiol,lett。（1998)164(1):159-67(通過引用在本文合併）。有用的融合蛋白的一例是公開的多肽融合到GST序列的C-端的GST融合蛋白。該嵌合蛋白可輔助公開的重組多肽的純化。[0067]在另一實施方式中，嵌合蛋白或肽在其N-端含有異源信號序列。例如，公開的多肽的天然信號序列可去除及被來自另一蛋白的信號序列取代。例如，可將杆狀病毒包膜蛋白的gp67分泌序列用作異源信號序列（CurrentProtocolsinMolecularBiology,Ausubeletal.，eds·，JohnWiley&Sons,1992，通過引用在本文合併）。真核生物異源信號序列的其他例包括蜂毒肽和人胎盤鹼性磷酸酶的分泌序列（Stratagene;LaJolla,Calif.)。在仍另一例中，有用的原核生物異源信號序列包括phoA分泌信號(Sambrook等人，見上）和蛋白A分泌信號（PharmaciaBiotech;Piscataway,N.J.)。[0068]融合蛋白可組合溶素多肽與具有不同能力，或給溶素多肽提供另外的能力或添加的特徵的蛋白或多肽。融合蛋白可為公開的多肽的全部或部分融合到源於免疫球蛋白家族成員的序列的免疫球蛋白融合蛋白。免疫球蛋白可為抗體，例如針對敏感的或靶向細菌的表面蛋白或表位的抗體。可將免疫球蛋白融合蛋白摻入藥物組合物，並施用於受試者而抑制（可溶性或膜結合）配體和細胞表面上的蛋白（受體）之間的相互作用，由此抑制體內信號轉導。免疫球蛋白融合蛋白可改變公開的多肽的同源配體的生物利用度。配體/受體相互作用的抑制可為有用的治療，二者用於調節（即促進或抑制）細胞存活的治療細菌-關聯的疾病和病症。而且，可將公開的免疫球蛋白融合蛋白用作免疫原來在受試者中產生針對公開的多肽的抗體，純化配體及在篩選測定中鑑定抑制受體與配體的相互作用的分子。公開的嵌合和融合蛋白和肽可由標準重組DNA技術產生。[0069]融合基因可由常規技術，包括自動化的DNA合成儀合成。或者，基因片段的PCR擴增可使用在隨後可退火及再擴增而產生嵌合基因序列的2個連續基因片段之間引起互補懸伸的錨定引物實施（見，即，Ausubel等人，見上）。而且，許多表達載體是已編碼融合部分（即，GST多肽）的可商購品。編碼本發明的多肽的核酸可克隆進該表達載體使得融合部分框內連接至本發明的多肽。[0070]如本文所用，已隨機切割用於多於一種相關的噬菌體蛋白或蛋白肽片段的改組的蛋白或肽，基因產物，或肽及重組裝為更有活性的或特異性蛋白。選擇或篩選改組的寡核苷酸，肽或肽片段分子來鑑定具有期望的功能性質的分子。此方法描述於，例如，Stemmer，美國專利No.6,132,970.(改組多核苷酸的方法）；Kauffman，美國專利No.5,976,862(經基於密碼子的合成演化）和Huse，美國專利No.5,808,022(直接密碼子合成）。這些專利的內容通過引用併入本文。改組可用於產生更有活性的蛋白，例如有達模板蛋白的10?100倍活性的蛋白。在不同種溶素蛋白之中選擇模板蛋白。改組的蛋白或肽構成，例如，一個或更多結合結構域及一個或更多催化性結構域。各結合或催化性結構域源於相同的或不同噬菌體或噬菌體蛋白。改組的結構域是基於寡核苷酸的分子，如單獨或與其他可翻譯成肽片段的基因或基因產物組合的基因或基因產物，或它們是基於肽的分子。基因片段包括DNA，RNA，DNA-RNA雜交體，反義RNA，核酶，EST，SNIP和其他基於寡核苷酸的分子的任何分子，其單獨或與其他分子組合而產生能或不能翻譯成肽的寡核苷酸分子。[0071]如在本文公開的溶素蛋白或肽和肽片段的二聚形式包括化學合成的或由重組DNA技術製備的，或兼二者得到的蛋白或肽和肽片段。這些技術包括，例如，嵌合及改組。當蛋白或肽由化學合成產生時，其優選基本上無化學前體或其他化學品，即，其從涉及蛋白的合成的化學前體或其他化學品分離。因此該蛋白製備物具有少於約30^,20^,10^,5%(以乾重計）的非目標多肽的化學前體或化合物。[0072]多肽的信號序列可輔助公開的蛋白和肽和肽片段跨膜移動至黏膜及自黏膜跨膜移動，以及輔助目標分泌的蛋白或其他蛋白的分泌和分離。信號序列一般特徵在於在一次或更多切割事件中，在分泌期間通常自成熟蛋白切割的疏水胺基酸核心。該信號肽含有允許信號序列隨它們經過通過分泌通路自成熟蛋白切割的加工位點。由此，公開可屬於具有信號序列的描述的多肽，以及屬於信號序列本身及屬於缺失信號序列的多肽（即，切割產物）。公開的編碼信號序列的核酸序列可在表達載體中可操作地連接於目標蛋白，諸如通常不分泌的或難分離的蛋白。信號序列指導蛋白，諸如自轉化進表達載體的真核生物宿主分泌，及信號序列隨後或同時被切割。蛋白可然後由領域認可的方法容易自細胞外培養基純化。或者，可將信號序列使用輔助純化的序列，諸如用GST結構域連接到目標蛋白。[0073]本發明也屬於本發明的多肽的其他變體。該變體可具有可發揮激動劑（模仿物）或拮抗劑功能的改變的胺基酸序列。變體可由誘變，即，離散點突變或截短產生。激動劑可保留基本上相同的，或子集的蛋白的天然存在的形式的生物學活性。蛋白的拮抗劑可通過，例如，與包括目標蛋白的細胞信號傳導級聯的下遊或上遊成員競爭性地結合來抑制一種或更多蛋白的天然存在的形式的活性。由此，特定生物學效應可通過用具有有限的功能的變體處理來引發。相對於用蛋白的天然存在的形式處理，用具有蛋白的天然存在的形式的子集的生物學活性的變體處理受試者可在受試者中具有更少副作用。發揮激動劑（模仿物）或拮抗劑功能的公開的蛋白變體可通過就激動劑或拮抗劑活性篩選公開的蛋白的突變體，即，截短突變體的組合庫來鑑定。在一實施方式中，變體雜庫由在核酸水平組合的誘變產生及由雜基因庫編碼。變體雜庫可產生由，例如，將合成寡核苷酸的混合物酶學地連接進基因序列，使得簡併組的潛在蛋白序列可作為個體多肽，或替代性地，作為一組更大融合蛋白（即，為噬菌體展示）表達。有可用於自簡併寡核苷酸序列產生公開的多肽的潛在變體庫的各種方法。用於合成簡併寡核苷酸的方法為本領域所知（見，即，似四叩（1983)丁61:四116(11'〇1139:3;1七&1〇1四6七&1.(1984)八111111.1^￥.13;[0(3116111.53:323;Itakuraetal.(1984)Sciencel98:1056;Ikeetal.(1983)NucleicAcidRes.11:477，全部通過引用在本文合併）。[0074]此外，公開的多肽的編碼序列的片段庫可用於產生多肽用於篩選及隨後選擇變體，活性片段或截短的雜群。例如，編碼序列片段庫可通過在切割以僅約每分子一次發生的條件下用核酸酶處理目標編碼序列的雙鏈PCR片段，變性雙鏈DNA，自不同切割的產物復性DNA而形成可包括正義/反義對的雙鏈DNA，由用S1核酸酶處理而從改性的雙聯體移出單鏈部分，及將得到的片段庫連接進表達載體來產生。由此方法，可衍生編碼各種尺寸的目標蛋白的N-端和內部片段的表達庫。用於篩選由點突變或截短製造的組合庫的基因產物，及就具有選擇的性質的基因產物篩選cDNA庫的幾種技術為本領域所知。服從高通量分析，用於篩選大基因庫的最廣泛使用的技術一般包括將基因庫克隆進可複製的表達載體，用得到的載體庫轉化適當的細胞，及在期望的活性的檢測輔助編碼檢測其產物的基因的載體的分離的條件下表達組合的基因。遞歸總體誘變（REM)，增強庫中功能突變體頻度的技術，可與篩選測定組合使用來鑑定公開的蛋白的變體（ArkinandYourvan(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:7811-7815;Delgraveetal.(1993)ProteinEngineering6(3):327-331)蛋白或肽片段的有免疫學活性的部分包括與識別噬菌體酶的抗體結合的區。在此情景中，蛋白(或編碼蛋白的核酸）的最小部分根據實施方式是可識別為特異於製造溶素蛋白的噬菌體的表位。因此，可被預期結合抗體和對於一些實施方式有用的最小多肽（及編碼多肽的關聯的核酸）可為8,9,10,11，12,13,15,20,25,30,35,40,45,50,55,60,65,75,85或100個胺基酸長。儘管短至8,9,10,11，12或15個胺基酸長的小序列可靠地包含足夠的結構而發揮表位的作用，5,6或7個胺基酸長的更短序列可在一些條件呈現表位結構及在一實施方式中具有價值。[0075]實施方式的蛋白或肽片段的有生物學活性的部分，如本文所述，包括包含足夠同一於或源於公開的噬菌體蛋白的胺基酸序列的胺基酸序列的多肽，其相比噬菌體蛋白的全長蛋白包括更少胺基酸及呈現對應全長蛋白的至少一種活性。一般而言，有生物學活性的部分包含具有對應蛋白的至少一種活性的結構域或基序。公開的蛋白或蛋白片段的有生物學活性的部分可為例如，長度少於或多於10,25,50,100個胺基酸的多肽。而且，刪除，或添加其他蛋白區的其他有生物學活性的部分，可由重組技術製備及就一種或更多實施方式的多肽的天然形式的功能活性進行評價。[0076]本領域技術人員會同意可製備與該小蛋白和/或核酸（或更大分子的蛋白和/或核酸區）共享功能性的同源蛋白和核酸。可同源的更大分子的該小分子和短區特別旨在包括在實施方式中。優選地，該有價值的區與本文提供的溶素多肽（包括圖1和6所示的多肽）具有至少50%，65%，75%，80%，85%和優選至少90%，95%，97%，98%或至少99%的同源性。這些百分率同源性值不包括由於保守性胺基酸取代所致的改變。[0077]當至少約70%的胺基酸殘基（優選至少約80%，至少約85%，及優選至少約90或95%)相同，或表示保守性取代時，2個胺基酸序列是"基本上同源的"。當溶素多肽的一個或更多，或幾個，或達10%，或達15%，或達20%的胺基酸被類似或保守性胺基酸取代取代時，相當的溶素，諸如相當的Cpl-1溶素，或相當的鏈球菌屬（Streptococcus)溶素的序列是基本上同源的，且其中相當的溶素具有在本文公開的溶素，諸如Cpl-1溶素的活性特徵，抗-細菌效應和/或細菌特異性。[0078]本文所述的胺基酸殘基優選為〃L"異構體形式。但是，可用〃D"異構體形式的殘基代替任何L-胺基酸殘基，只要多肽保留免疫球蛋白-結合的期望的功能性質。NH2指游離的氨基存在於多肽的氨基末端。C00H指游離的羧基存在於多肽的羧基末端。與標準多肽命名法保持一致，J.Biol.Chem.,243:3552-59(1969)，胺基酸殘基的縮寫顯示於以下對應表：[0079]【對應表】[0080]【胺基酸符號】[0081]【權利要求】1.分離的二聚鏈球菌屬（streptococcus)-特異性噬菌體溶素，其包含彼此共價連接的2個鏈球菌屬（Streptococcus)-特異性噬菌體溶素單體，其中所述二聚體針對一種或更多鏈球菌屬（Streptococcus)細菌具有殺滅活性。2.權利要求1的溶素，其中所述溶素單體是與未突變的Cpl-1(SEQIDN0:1)具有至少90%胺基酸序列同一性的Cpl-1單體，或是與未突變的Pal(SEQIDN0:5)具有至少90%胺基酸序列同一性的Pal單體。3.權利要求1的溶素，其中所述溶素單體彼此化學交聯。4.權利要求2的溶素，其中所述溶素單體彼此由二硫鍵共價連接。5.權利要求4的溶素，其中各單體具有在自C-端14和20個胺基酸之間的Cys殘基。6.權利要求5的溶素，其中所述溶素單體在頭45個殘基中不具有Cys殘基。7.權利要求5的溶素，其中所述溶素單體選自：包含圖6所示的胺基酸序列的突變Cpl-1溶素（SEQIDNO:3)和包含圖7所示的胺基酸序列的突變Pal溶素（SEQIDNO:5)。8.權利要求1的溶素，其中所述溶素單體包含第1鏈球菌屬（Streptococcus)-特異性噬菌體溶素的催化性結構域和第2鏈球菌屬（Streptococcus)-特異性噬菌體溶素的結合結構域。9.權利要求8的溶素，其中第1鏈球菌屬（Streptococcus)-特異性噬菌體溶素的催化性結構域是突變Cpl-1(SEQIDNO:3)，突變Pal(SEQIDNO:5)或另一鏈球菌噬菌體溶素。10.權利要求8的溶素，其中第2鏈球菌屬（Str印tococcus)-特異性噬菌體溶素的結合結構域是突變Cpl-1(SEQIDNO:3)，突變Pal(SEQIDNO:5)或另一鏈球菌噬菌體溶素。11.權利要求1?10之任一項的溶素，其針對肺炎鏈球菌（Streptococcuspneumoniae)具有殺滅活性。12.通過施用包括治療有效量的權利要求1?11之任一項的溶素的組合物治療患由鏈球菌感染導致的疾病或病情的哺乳動物的方法。13.權利要求12的方法，其中所述感染由肺炎鏈球菌（Streptococcuspneumoniae)導致。14.權利要求12的方法，其中所述疾病或病情是選自下列的一種或更多疾病或病情：菌血症，腦膜炎，肺炎，中耳炎及鼻竇炎。15.通過施用包括治療有效量的權利要求1?11之任一項的溶素的組合物使患由鏈球菌感染導致的疾病或病情或處於由鏈球菌感染導致的疾病或病情風險的哺乳動物中的鏈球菌去定居的方法。16.權利要求15的方法，其中所述感染由肺炎鏈球菌（Streptococcuspneumoniae)導致。17.藥物組合物，其包含治療有效量的權利要求1?11之任一項的二聚溶素，及藥學可接受的載體。18.抗-微生物組合物，其用於清潔或淨化多孔或非-多孔表面，所述組合物包含權利要求1的溶素。19.淨化懷疑含有感染性細菌的無生命的表面的方法，包括用殺細菌地或抑細菌地有效量的權利要求17的組合物處理所述表面。【文檔編號】C12N7/00GK104114695SQ201280057094【公開日】2014年10月22日申請日期:2012年10月4日優先權日:2011年10月5日【發明者】V·A·菲謝蒂,G·雷施申請人:洛克菲勒大學