具有促生作用的鐵皮石斛內生菌及其用途的製作方法

2023-06-27 21:04:11 3

專利名稱：具有促生作用的鐵皮石斛內生菌及其用途的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種天然藥用植物內生細菌一鐵皮石斛內生菌及其用途。
背景技術：
鐵皮石斛屬蘭科(Orchidaceae)植物中的第二大屬——石斛屬(Dendrobium Sff.)，是石斛中的極品，屬氣生蘭科草本植物，它因表皮呈鐵綠色而得名，具有滋陰清熱、生 津益胃、潤肺止咳、明目強身、鎮痛消炎等功效；現代藥理研究表明，石斛還具有抗腫瘤、抗 衰老、增強機體免疫力、擴張血管及抗血小板凝集等作用。由於其極大的藥用價值，使其成 為全國涉及用到石斛類的製藥廠和保健品加工企業原料命脈。但鐵皮石斛的生長條件十分 苛刻，因此自然產量極為稀少，更因民間長期過度採挖，致使野生資源瀕臨絕種。據統計我國每年用石斛為原料的藥品、保健品產值超過幾百億元，市場需求的數 量每年均在幾百萬公斤以上，而且逐年呈上升趨勢。目前市場上生產的鐵皮石斛大部分都 來自人工培育，即先經過組培的方式擴繁鐵皮石斛，再經煉苗移栽田間。然而人工培育鐵皮 石斛仍存在繁殖育苗難、移栽成活難和生長緩慢三大難題，這無疑是對鐵皮石斛的開發利 用的一個嚴重的阻礙。植物內生菌是能從經過表面消毒的植物組織中分離或者從植物內部的汁液中獲 得，並且對植物表觀上無危害即不導致明顯病症的微生物。植物內生菌包括互惠共利的 (mutualistic)和中性的(neutral)內共生微生物。目前已經從很多植物的各種器官(根、莖、葉、花、果實、種子)中分離到內生菌。它 們在植物體內的普遍性、豐富的生物多樣性及功能多樣性方面已有不少文獻報導。內生菌 經過長期的與植物發生相互作用，它們之間形成較複雜的關係。現已發現內生菌對宿主植 物有以下幾個方面的作用(1)促進宿主植物生長，提高宿主的生產力，可增強宿主對病、蟲的抗性，因而在農 業生產、生物控制和生物防治方面有著重要意義；(2)、增強宿主植物對環境脅迫的抗性。如對乾旱、全球氣溫上升、鹽鹼、重金屬及 其它有毒物質汙染等的抗性；(3)、內生菌產生新的生物活性物質。植物內生菌作為一種特殊生境下的微生物， 在植物體內能產生豐富多樣、具有多種生物活性的次生代謝產物，目前人們已從內生菌中 找到許多具有各種生物活性的新物質在醫藥業、農業方面顯示的重要的應用價值。據國內外研究報導，在植物幼苗中引入微生物必將對幼苗的發育、代謝產生積極 影響，可增強對生物和非生物脅迫因子的抗性。接入內生菌也可對植株生長和生理代謝進 行綜合調節，使之較快適應外界複雜環境。J Nowak將這種技術稱為「biotizafion」，諸如 菌根化(mycorrhization)、細菌化(bacterization)。將有益微生物與微繁苗進行共培養， 是生產高抗優質種苗的嶄新途徑，這對於中藥材的大規模高效優質栽培具有很好的應用前景。目前，國際上關於蘭科植物的內生真菌研究較多，但內生細菌的研究較少，更沒有鐵皮石斛內生細菌用於促長鐵皮石斛組培面的研究報告。

發明內容
本發明要解決的技術問題是提供一種鐵皮石斛內生細菌——鞘氨醇單胞菌株，該 菌株用於鐵皮石斛種苗促生長，有助於解決目前鐵皮石斛種苗生產過程中組培苗生長緩 慢、生產周期長、成本較高的技術難題。為了解決上述技術問題，本發明提供一種鞘氨醇單胞菌株，該鞘氨醇單胞菌 (Sphingomonas sp.)菌株保藏名稱為鞘氨醇單胞菌SHl，保藏單位中國典型培養物保藏 中心，保藏地址中國武漢大學，保藏日期2010年2月4日，保藏號CCTCC NO :M2010041。本發明還同時提供了上述鞘氨醇單胞菌株的用途用於鐵皮石斛種苗促生長。作為本發明的鞘氨醇單胞菌株的用途的改進將鞘氨醇單胞菌CCTCC NO M2010041發酵原液或發酵液接種於鐵皮石斛組培苗的基部，從而促進鐵皮石斛組培苗生 長。本發明的鐵皮石斛內生菌是發明人從鐵皮石斛植株中分離到的一株細菌， 經傳統方法鑑定和分子鑑定表明它屬於鞘氨醇單胞菌，將其命名為鞘氨醇單胞菌 SHl (Sphingomonas sp. SHl)。具體為該鐵皮石斛內生菌分離自野生的鐵皮石斛植株的根，可通過如下方法從野生的鐵 皮石斛植株分離培養得到1)、將野生鐵皮石斛的根經表面消毒處理後，切成小塊，接種於特製NA培養基平 板，於28 32°C下培養1 3天；該特製的NA培養基由基礎NA培養基和研磨後的新鮮鐵皮石斛組成，基礎NA培養 基的成分組成為蛋白腖10g，牛肉膏3g，NaCl 5g，瓊脂15-20g* H2OlOOOml,在上述基礎 NA培養基上添加5g研磨後的新鮮鐵皮石斛，並用lmol/L的NaOH調節pH = 7. 4 7. 6，得 特製的NA培養基。2)、挑取單菌落於同上述步驟1)的特製NA培養基平板劃線純化分離，置於28 32°C下培養1 3天；3)、重複多次分離純化培養，直至獲得純培養物。本發明的鐵皮石斛內生菌——鞘氨醇單胞菌菌SHl (Sphingomonas sp. SHl)已於 2010年2月4號保藏在中國典型微生物保藏中心(CCTCC)，保藏號CCTCC NO =M 2010041。本發明的鐵皮石斛內生菌一一鞘氨醇單胞菌SHl(以下簡稱為鞘氨醇單胞菌 CCTCCN0 :M 2010041)具有如下生物學特徵1.菌落形態特徵在基礎NA培養基上生長良好，細菌菌落特徵菌落呈圓形，黃 色，光滑，邊緣整齊，菌落中心突起脊狀。2.菌體形態特徵球狀，直徑為0. 5 1. 5 μ m，革蘭氏陰性。3.主要生理生化特徵該菌可在基礎NA培養基上，在生長溫度為20 40°C、pH 值為6. 0 8. 0的環境中生長良好。4.遺傳學特徵根據《常見細菌系統鑑定手冊》(東秀珠，蔡妙英，科學出版社， 2001)，本發明的鞘氨醇單胞菌CCTCC NO =M 2010041的形態特徵上，與國內命名的解聚乙 二醇鞘氨醇單胞菌(Sphingomonas macrogoltabidus)最接近；經該鞘氨醇單胞菌CCTCCM2010041的16S rDNA序列分析表明，鞘氨醇單胞菌CCTCC M 2010041應屬於鞘氨醇單胞菌
jM ο本發明的鐵皮石斛內生細菌SHl對鐵皮石斛組培苗有促生長作用，可促進組培苗 的平均根長增加10% 25%，增加植株的高度10% 30%，增加植株的鮮種和乾重5% 20%，可縮短鐵皮石斛組培苗的生產時間10 20天；對人畜無毒無害，對環境不造成汙染。 可在鐵皮石斛組培苗的生產中得到應用，產生一定的經濟效益。本發明的鐵皮石斛內生細菌用於促進鐵皮石斛生長時，只需將該鐵皮石斛內生細 菌一鞘氨醇單胞菌CCTCC NO =M 2010041的發酵原液或發酵液接種於鐵皮石斛組培苗基 部，即可獲得促進鐵皮石斛組培苗生長的效果。
具體實施例方式實施例1、鞘氨醇單胞菌CCTCC NO =M 2010041的分離培養方法，依次進行以下步 驟1、於浙江桐廬採集野生的健康的鐵皮石斛植株的根樣品，用自來水充分清洗， 25KHz超聲波處理5分鐘；2、在無菌條件下，對步驟1所得的供試材料用無菌水衝洗2次，然後依次用體積 濃度75%的酒精和飽和漂白粉溶液對供試材料進行表面消毒，從而殺滅供試材料表面微生 物；3、在無菌環境中，將步驟2所得的供試材料用無菌水衝洗3次，取100 μ 1最後1 次衝洗所產生的無菌水衝洗液塗布接種於基礎NA培養基中，30°C培養24h後，觀察有無菌 落產生。據此驗證此消毒方法是否全部殺死供試材料表面微生物。如果觀察結論為沒有菌落產生，則進行下述的步驟4 ；如果觀察結論為有菌落 產生，則返回步驟2。4、將處理好的根樣品切成0. 5 Icm小段，接入特製NA培養基平板中，放置於 30°C培養1 3天；該特製NA培養基由基礎NA培養基和新鮮鐵皮石斛研磨料渣組成；基礎NA培養基 的成分組成為蛋白腖10g，牛肉膏3g，NaCl 5g，瓊脂18g和H2OlOOOml,在上述基礎NA培 養基上添加5g研磨後的新鮮鐵皮石斛，並用lmol/L的NaOH調節pH = 7. 4 7. 6，得特製
NA培養基。5、挑取上述步驟4所得的特製NA培養基平板上長出的菌種於特製NA培養基平板 劃線純化分離，置於30°C培養1 3天，挑取單菌落；重複上述操作，直至得到單菌落為止。6、將步驟5挑取所得的單菌落接於特製NA培養基斜面保存於4°C冰箱中。所得的一種單菌落為鐵皮石斛內生菌——鞘氨醇單胞菌SHl (Sphingomonas sp. SHl)，已於2010年2月4號保藏在中國典型微生物保藏中心(CCTCC)，保藏地址中國武 漢大學，保藏日期2010年2月4日，保藏號CCTCC NO =M 2010041。其序列如SEQID NO 1 所示。實施例2、鞘氨醇單胞菌CCTCC NO =M 2010041的培養制種方法，依次進行以下步 驟
5
1、將鞘氨醇單胞菌CCTCC NO =M 2010041轉接到基礎NA培養基斜面，30°C培養2 天；得斜面種子；基礎NA培養基斜面配方為蛋白腖10g，牛肉膏3g，NaCl 5g，瓊脂18g和 H2OlOOOml, ρΗ = 7. 4 7. 6。2、用接種環挑取0. 5g步驟1所得斜面菌種，接種於裝有100ml LB液體培養基的 250ml三角瓶中，於28°C以200r/m轉速振蕩培養30h，得鞘氨醇單胞菌CCTCC NO :M2010041 發酵原液；LB液體培養基配方為蛋白腖10g，酵母膏10g，NaCl 58和H201000ml，pH = 7. 4 7. 6。實施例3、鞘氨醇單胞菌CCTCC NO =M 2010041對鐵皮石斛組培苗生長的促進實 驗下述實驗均用已在改良的鐵皮石斛組培培養基中進行培養的鐵皮石斛組培苗作 為實驗對象。改良的鐵皮石斛組培培養基的配方為採用1/2MS為基本培養基，添加香蕉汁 10% /L，瓊脂7g/L，蔗糖20g/L，用lmol/L的NaOH調整ρΗ值為5.8。即在每L的1/2MS 中添加0. IL香蕉汁、7g瓊脂和20g蔗糖，並調整ρΗ值為5. 8。實驗1、鞘氨醇單胞菌CCTCC NO =M 2010041發酵原液對鐵皮石斛組培苗促生長試
驗一利用上述實施例2所得的鞘氨醇單胞菌CCTCC NO =M 2010041發酵原液，用無菌水 將發酵原液進行稀釋，使其菌液濃度調整為103CFU/ml，將該稀釋後發酵原液接種於已在改 良的鐵皮石斛組培培養基中培養了 15天的25株鐵皮石斛組培苗基部，作為實驗組；具體 為在每株鐵皮石斛組培苗基部加入50 μ 1的稀釋後發酵原液。將相同體積的無菌水代替上述稀釋後發酵原液，其餘內容相同，作為空白對照組。上述實驗組和空白對照組均在25°C恆溫、全天IOOOIx的光照強度條件下進行培養。培養結果如下60天後可見，實驗組的鐵皮石斛組培苗的平均生長狀況明顯優於空白對照組， 實驗組中組培苗平均根長比空白對照組增加了 20.5%，植株高度比空白對照組增加了 17. 8%，組培苗植株鮮重和乾重分別比空白對照組增加了 16. 3%和15. 9%。實驗2、鞘氨醇單胞菌CCTCC NO =M 2010041發酵原液對鐵皮石斛組培苗促生長試
驗二將稀釋後的菌液濃度由103CFU/ml改成lOtFU/ml，以在改良的鐵皮石斛組培培養 基中培養了 30天的鐵皮石斛組培苗作為實驗對象；其餘等同實驗1。培養結果如下60天後可見，實驗組的鐵皮石斛組培苗的平均生長狀況均明顯優於空白對照組， 實驗組中組培苗平均根長比空白對照組增加了 11.3%，植株高度比空白對照組增加了 14. 7%，組培苗植株鮮重和乾重分別比空白對照組增加了 10. 2%和9. 7%。實驗3、鞘氨醇單胞菌CCTCC NO =M 2010041發酵液對鐵皮石斛組培苗促生長試驗
將上述實施例2所得的鞘氨醇單胞菌CCTCC NO =M 2010041發酵原液用孔徑為 0. 45 μ m的濾膜過濾，得無菌發酵液。取該無菌發酵液接種於已在改良的鐵皮石斛組培培養 基中培養了 15天的25株鐵皮石斛組培苗，作為實驗組；具體為在每株鐵皮石斛組培苗基 部加入50 μ 1的無菌發酵液；15天後，再在每株鐵皮石斛組培苗基部加入50 μ 1的無菌發 酵液。將相同體積的無菌水代替上述無菌發酵液，其餘內容相同，作為空白對照組。上述實驗組和空白對照組均在同實驗1的條件下進行培養，培養結果如下60天後可見，實驗組的鐵皮石斛組培苗的平均生長狀況優於空白對照組，實驗組 中組培苗平均根長比空白對照組增加了 7.8%，植株高度比空白對照組增加了 7.3%，組培 苗植株鮮重和乾重分別比空白對照組增加了 6. 6%和6. 3%。實驗4、鞘氨醇單胞菌CCTCC NO =M 2010041發酵液對鐵皮石斛組培苗促生長試驗將上述實施例2所得的鞘氨醇單胞菌CCTCC NO =M 2010041發酵原液用孔徑為 0. 45 μ m的濾膜過濾，得無菌發酵液。取該無菌發酵液接種於已在改良的鐵皮石斛組培培養 基中培養了 30天的25株鐵皮石斛組培苗，作為實驗組；具體為在每株鐵皮石斛組培苗基 部加入100 μ 1的無菌發酵液。將相同體積的無菌水代替上述無菌發酵液，其餘內容相同，作為空白對照組。上述實驗組和空白對照組均在同實驗1的條件下進行培養，培養結果如下60天後可見，實驗組的鐵皮石斛組培苗的平均生長狀況優於空白對照組，實驗組 中組培苗平均根長平均根長比空白對照組增加了 4.5%，植株高度比空白對照組增加了 5. 3%，實驗組中組培苗植株鮮重和乾重分別比空白對照組增加了 6. 和5. 3%。最後，還需要注意的是，以上列舉的僅是本發明的若干個具體實施例。顯然，本發 明不限於以上實施例，還可以有許多變形。本領域的普通技術人員能從本發明公開的內容 直接導出或聯想到的所有變形，均應認為是本發明的保護範圍。
權利要求
一種鞘氨醇單胞菌株，其特徵是該鞘氨醇單胞菌(Sphingomonas sp.)菌株保藏名稱為鞘氨醇單胞菌SH1，保藏單位中國典型培養物保藏中心，保藏地址中國武漢大學，保藏日期2010年2月4日，保藏號CCTCC NOM 2010041。
2.如權利要求1所述的鞘氨醇單胞菌株的用途，其特徵是用於鐵皮石斛種苗促生長。
3.根據權利要求2所述的鞘氨醇單胞菌株的用途，其特徵是將鞘氨醇單胞菌CCTCC NO =M 2010041發酵原液或發酵液接種於鐵皮石斛組培苗的基部，從而促進鐵皮石斛組培 苗生長。
全文摘要
本發明公開了一種鞘氨醇單胞菌株，該鞘氨醇單胞菌(Sphingomonas sp.)菌株保藏名稱為鞘氨醇單胞菌SH1，保藏單位中國典型培養物保藏中心，保藏地址中國武漢大學，保藏日期2010年2月4日，保藏號CCTCC NoM 2010041。本發明還同時公開了上述鞘氨醇單胞菌株的用途用於鐵皮石斛種苗促生長；具體為將鞘氨醇單胞菌CCTCC NoM2010041發酵原液或發酵液接種於鐵皮石斛組培苗的基部，從而促進鐵皮石斛組培苗生長。
文檔編號C12N1/20GK101921718SQ201010125409
公開日2010年12月22日 申請日期2010年3月16日 優先權日2010年3月16日
發明者俞婕, 張珊珊, 胡秀芳, 董飛, 趙凱鵬, 陳集雙 申請人:浙江理工大學