改造的人Insulin蛋白表達基因及表達方法

2023-05-29 00:26:46 1

改造的人Insulin蛋白表達基因及表達方法
【專利摘要】本發明涉及一種改造的人Insulin蛋白表達基因及表達方法。在花生油體蛋白系統中易於表達的人Insulin蛋白表達基因片段，將表達人Insulin蛋白的表達基因按照花生偏好的密碼子進行優化，並進行如下改造：將表達A鏈的基因片段中表達Asn21的核苷酸變為表達Gly21的核苷酸，同時表達B鏈基因片段的末端添加表達Arg31、Arg32兩個胺基酸殘基的核苷酸。本發明採用油體蛋白系統在花生種子中表達人Insulin蛋白，利用花生種子含油量豐富的特點，使油體蛋白佔種子總蛋白的10％以上，人Insulin蛋白表達基因經過密碼子優化與花生油體蛋白融合表達實現了Insulin蛋白的高水平積累。
【專利說明】改造的人Insul in蛋白表達基因及表達方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種改造的人Insulin蛋白表達基因及表達方法,尤其涉及Insulin序列的改造、密碼子優化和利用油體蛋白表達系統在花生種子中表達人Insulin的方法，屬於生物【技術領域】。
【背景技術】
[0002]「糖尿病」是一種血液中的葡萄糖容易堆積過多的疾病，四十歲以上的中年人染患率特別高。據統計2010年我國的糖尿病患者人數居全球之冠，達到了 9240萬。Insulin是機體內唯一降低血糖的激素，在糖尿病治療中具有無可替代的作用和地位。我國有近億人的糖尿病患者，所以對Insulin的需求量巨大。
[0003]臨床用Insulin最早主要從動物胰臟中提取，存在人畜共患病原菌和朊病毒汙染的風險。隨著DNA重組技術研究深入，已成功在大腸桿菌和酵母如畢赤酵母中表達了重組Insulin，不過，原核大腸桿菌和低等真核生物酵母表達重組Insulin存在內毒素汙染和無法完成蛋白修飾等系統固有缺陷，而用植物系統表達Insulin具有易於規模化安全和低成本優勢，可以彌補原核和酵母系統的不足。
[0004]植物生物反應器成本低，不存在轉基因動物細胞或微生物發酵中存在的細胞培養困難、培養基昂貴、在規模化生產時需要嚴格的培養條件避免汙染、成本加大等問題(Liuand Jia, 2003 ；Gomord et al, 2004);安全性高，不存在病原菌的汙染的風險(Commandeuret al, 2003 ；Cai et al, 2004);生產的產品一般含有較高的生物活性及免疫活性(Daniellet al, 2001);遺傳穩定性高，通過自交和分離能很快獲得轉基因純合體(Verwoerd etal, 1995 ；Liu et al, 2000);並且植物轉基因技術成熟。利用植物反應器生產有用蛋白，即為「分子農業(molecular farming) 」 (Commandeur et al, 2003),是一種非常安全的生產方式。目前已有多種植物用作生物反應器，如菸草(McCormick et al, 1999 ；Ma et all995)、大豆(Giddings et al, 2000)、擬南芥(Potera, 1999)、玉米、油菜(Arakawa et al, 1998 ；Witcher et al, 1998).、馬鈴薯(Richter et al, 2000 ；Artsaenko et al, 1998)、番爺(Chenet al, 2009)等，其表達產物也是多種多樣的，如具有重要價值的藥物蛋白、疫苗、抗體等(Yang et al,2009)。
[0005]國際上在轉基因馬鈴薯塊莖中表達人Insulin的融合蛋白，Insulin只佔馬鈴薯塊莖中可溶性蛋白的0.022%。SemBioSys生物工程公司利用油體蛋白表達系統在紅花中表達人Insulin,每畝紅花所產的紅花籽中能提取到165克Insulin,
[0006]油體蛋白系統比其他表達系統Insulin的含量高，可能由於油體蛋白在種子中高水平表達並大量積累(Y1-hui and Sh1-rong，2003)，並且利用油體蛋白脂溶性的特點很容易將融合蛋白分離純化，長時間的忙存仍能保持結構穩定(Frandsen et al, 2001),其應用前景非常廣泛。目前利用油體蛋白系統已經成功獲得了有生物活性的水蛭素、納豆激酶、β -葡聚糖醛酸酶、木聚糖酶、表皮生長因子等多種蛋白(Zhao et al, 2009)。
[0007]花生(Arachis hypogaea)作為我國最重要的油料作物之一，既可以榨油和深加工，又可以生食，而且花生產量高，如果在花生中生產Insulin，按照每畝600斤花生，如果Insulin佔種子總蛋白的1%算，每畝花生生產的Insulin約900克,為紅花的5倍多。人Insulin蛋白具有廣闊的臨床應用前景，經檢索，目前還沒有關於在花生種子中利用油體蛋白表達系統表達人Insulin蛋白的方法的報導。

【發明內容】

[0008]本發明針對現有技術的不足，提供一種改造的人Insulin蛋白表達基因及表達方法，實現Insulin在花生種子中高水平的表達積累。
[0009]本發明技術方案如下:
[0010]—種在花生油體蛋白系統中易於表達的人Insulin蛋白表達基因片段，將表達人Insulin蛋白的表達基因按照花生偏好的密碼子進行優化，並進行如下改造:將表達A鏈的基因片段中表達Asn21的核苷酸變為表達Gly21的核苷酸，同時表達B鏈基因片段的末端添加表達Arg31、Arg32兩個胺基酸殘基的核苷酸。
[0011]根據本發明優選的，上述人Insulin蛋白表達基因片段的核苷酸序列如SEQ IDN0.1所示。
[0012]胰島素原(Insulin蛋白)是一個含21個胺基酸的A鏈和30個胺基酸B鏈以及C連接肽，共86個胺基酸，由N端至C端的連接順序為B-Arg-Arg-C-Lys-Arg-A ;將人Insulin的序列將編碼區改造成花生偏好的密碼子，並將A鏈的Asn21變為Gly21，同時B鏈末端添加Arg31、Arg32兩 個胺基酸殘基,使Insulin的結構更穩定,作用效果更持久。改造以後可以交給生物公司合成Insulin的編碼序列。
[0013]一種利用油體蛋白系統在花生種子中表達人Insulin蛋白的方法，步驟如下:
[0014](I)將上述在花生種子中易於表達的人Insulin蛋白表達基因片段進行人工合成，製得改造後表達基因片段；
[0015](2)以步驟(1)製得的改造後表達基因片段為模板進行PCR擴增，擴增引物如下:
[0016]正向引物:GGATCCATGGATTACAAGGATGATGA；
[0017]反向引物:TCTAGATTACCCGCAATAATTCTCGA；
[0018]將經測序正確的PCR產物經限制性內切酶BamH I和限制性內切酶Xba I雙酶切後，與同樣經限制性內切酶BamH I和限制性內切酶Xba I雙酶切的載體連接，製得植物表達載體；
[0019](3)步驟(2)製得的植物表達載體利用農桿菌侵染法轉化花生，獲得轉基因植株，經育繁後，收穫第二代轉基因花生純合體的花生種子，經純化，製得人Insulin蛋白。
[0020]根據本發明優選的，所述步驟(2)中，PCR反應體系如下:
[0021]模板1μ 1，2XLA Taq π?χ?ομ 1，正向引物(10μΜ)0.5μ1，反向引物(10 μ Μ)0.5 μ 1，ddH208.0 μ I。
[0022]PCR反應程序如下:
[0023]94°C預變性 5min ;94°C變性 30s，55°C退火 30s，72°C延伸 30s，30 個循環；72°C再延伸IOrnin0
[0024]根據本發明優選的，所述步驟(2)中的測序為將PCR產物連接到T載體，經人工測序正確，即得。[0025]根據本發明優選的，所述步驟⑵的載體為pCAMBIA2301-Ah01eosin載體，通過在載體PCAMBIA2301上插入序列如SEQ ID N0.2所示的花生油體蛋白啟動子及花生油體蛋白基因和序列如SEQ ID N0.3所示的終止子獲得。
[0026]根據本發明優選的，所述步驟(3)中純化的步驟如下:
[0027]將花生種子勻漿、壓榨；離心後去掉沉澱，回收上層的油相，清洗後、離心，再取上層的油相，加入腸肽酶進行酶消化反應，然後離心去掉上層的油相，回收水相，提取得到人Insulin 蛋白。
[0028]有益效果
[0029]1、本發明採用油體蛋白系統在花生種子中表達人Insulin蛋白，利用花生種子含油量豐富的特點，使油體蛋白佔種子總蛋白的10%以上，人Insulin蛋白表達基因經過密碼子優化與花生油體蛋白融合表達實現了 Insulin蛋白的高水平積累；
[0030]2、由於花生種子便於貯藏，運輸方便，而且重組蛋白在種子中的穩定性高，能在種子中長期保持活性，從而解決了人Insulin蛋白儲存、運輸的問題；
[0031]3、花生適應性強，種植面積廣，融合表達的Insulin分離純化簡單易操作，成本低，增加了農產品的附加 值，為分子農業和生物製藥的發展提供了技術支持；與微生物和動物反應器相比，植物表達系統在免疫原性、安全性、來源和成本等方面都更具有潛在的優勢。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0032]圖1、本發明構建的載體pCAMBIA2301-Aholeosin_Insulin的構建示意圖；
[0033]圖2、Western檢測轉基因花生種子中Insulin蛋白的表達結果照片；
[0034]其中:1，2:轉經優化改造的Insulin蛋白表達基因的花生，WT:野生型，3，4:轉未經優化改造的Insulin蛋白表達基因的花生；
[0035]圖3、轉基因花生Western檢測Insulin蛋白的柱狀分析圖；
[0036]其中:1，2:轉經優化改造的Insulin蛋白表達基因的花生，WT:野生型，3，4:轉未經優化改造的Insulin蛋白表達基因的花生。
【具體實施方式】
[0037]下面結合實施例對本發明的技術方案做進一步說明，但本發明所保護範圍不限於此。
[0038]實施例1、人Insulin序列進行改造和合成
[0039]根據NCBI中人Insulin的編碼序列(基因登錄號:ΒΤ006808.I)，將編碼序列改造成花生偏好密碼子，同時將Insulin A鏈的Asn21變為Gly21，同時B鏈末端添加Arg31，Arg32兩個胺基酸殘基，優化改造後的人Insulin蛋白表達基因片段核苷酸序列如SEQ IDN0.1所示，將人Insulin蛋白表達基因片段由生物公司合成。
[0040]實施例2、構建 pCAMBIA2301-Aholeosin-1nsulin 植物表達載體
[0041]構建過程如圖1所示，其中Insulin序列的擴增和獲得如下:
[0042]以正向引物 primer I: GGATCCATGGATTACAAGGATGATGA,和反向引物 primer2:TCTAGATTACCCGCAATAATTCTCGA，用合成的序列如SEQ ID N0.1所示的人Insulin蛋白表達基因片段為模板，進行PCR反應，PCR反應體系為:模板I μ 1，2XLA Taq π?χΙΟμ 1，正向引物(10 μ Μ)0.5 μ 1，反向引物(10 μ Μ)0.5 μ 1，ddH208.0 μ I。
[0043]PCR反應的程序為:94°C預變性5min ;94°C變性30s，55°C退火30s，72°C延伸30s，30個循環；72°C再延伸IOmin。
[0044]PCR產物經1.5wt%的瓊脂糖凝膠電泳，膠回收300bp左右條帶，連接到T載體上(pEASY T3,購自Transgen Biotech公司)，連接體系為:
[0045]回收產物4μ 1，T載體1μ 1，25°C連接15min，連接產物轉化大腸桿菌感受態細胞。
[0046]大腸桿菌DH5a感受態細胞的製備:
[0047](I)取-70°C冰凍E.coli DH5 a菌種，用劃線法接種細菌於LB培養基，37°C培養過夜。
[0048](2)取一環新鮮的菌落於裝有3ml LB試管中，在37°C振蕩培養約16h。
[0049](3)取Iml上述菌液轉接到裝有30ml LB三角燒瓶中(接種量按菌液濃度而定，一般在I %左右)，劇烈振蕩培養至OD6tltl值0.2-0.4。
[0050](4)將菌液冰浴IOmin,倒入冰上遇冷50ml的離心管中。4°C, 4000rpm離心5min,
棄上清，收集菌體。
[0051 ] (5)用50mmol/L預冷的CaCl2中約IOml,輕輕的懸浮細胞，冰浴IOmin, 4 V,4000rpm,離心5min,棄上清收集菌體。
[0052](6)將菌體懸浮在l_2ml的50mmol/L冷CaCl2中。置冰上作為轉化用的感受態細胞。
[0053](7)用預冷的槍頭，取100 μ I分裝到預冷的EP管中，加入等體積的30% (體積百分比)的甘油，放入液氮速凍，_70°C保存。
[0054]大腸桿菌的轉化:將上述5 μ I的連接產物加入100 μ I DH5 α感受態細胞中混勻。冰上放置30min，42°C熱激90s，冰浴5min，加入800 μ I液體LB (NaC110g/L，蛋白腖10g/L，酵母粉5g/L)，37°C IOOrpm振蕩培養lh，將菌液均勻塗抹布在含有100 μ g/ml的氨苄青黴素的固體LB培養基上(NaCl 10g/L，蛋白腖10g/L，酵母粉5g/L，瓊脂粉15g/L)，37°C培養過夜。挑取單菌落到ImL液體LB中，37°C搖菌4-6h，用primerl和primer2進行PCR檢測，對陽性克隆用通用引物進行測序驗證(見序列表SEQ ID N0.1)，得到克隆載體T-1nsulin質粒。
[0055]將人Insulin蛋白基因連接到pCAMBIA2301_Ah01eosin表達載體:
[0056]將花生油體蛋白啟動子及花生油體蛋白基因(序列如SEQ ID N0.2所示)以及tRUBP終止子(序列如SEQ ID N0.3所示)連接至Ij pCAMBIA2301 (Cambia公司有售)的植物表達載體，構建成 pCAMBIA2301-Ah01eosin。將 pCAMBIA2301_Ah01eosin 和 T-1nsulin質粒同時用Xba I和BamH I雙酶切，回收載體和Insulin蛋白表達基因片段，T4連接酶將兩個片段連接:10XT4DNA ligase buffer2y I, Insulin蛋白表達基因片段6 μ 1，pCAMBIA2301-Ah01eosin2 μ 1，T4DNA Iigasel μ 1，H209 μ 1，16°C連接過夜。
[0057]連接產物按實施例1中的方法轉化大腸桿菌DH5 α，同樣挑取單菌落PCR驗證，測序驗證表達載體構建成功。
[0058]表達載體的農桿菌轉化:
[0059]製備農桿菌LBA4404的感受態細胞:[0060](I)將_80°C保存的根癌農桿菌LBA4404劃板，28°C培養兩天；
[0061](2)挑取單克隆，接種於5ml YEP液體培養基中，28°C，220rpm振蕩培養過夜；
[0062](3)取 Iml 稀釋 50ml YEP (NaC15g/L,蛋白腖 10g/L,酵母粉 10g/L)培養基中，28 0C 250rpm 震蕩培養至 0D600 值 0.6 ;
[0063](4)將培養物置於冰上20min，並不時的輕搖，保證內容物充分的冷卻；
[0064](5)將菌液轉移至預冷的50ml離心管中，4°C，5000rpm離心10min，棄上清液；
[0065](6)菌體用 IOml 預冷的 0.15M 的 NaCl 重懸；4°C, 5000rpm 離心 IOmin ；
[0066](7)棄上清，用Iml預冷的20mM CaCl2 (含15 %的甘油)(250 μ 160 %的甘油加750 μ ICaCl2)重懸；分裝到預冷的eppendorf管中(200 μ I/管)；
[0067]重組質粒轉化農桿菌:200 μ I感受態細胞中加入I μ I重組質粒，冰浴30min ;液氮冷凍Imin ;37°C水浴融化細胞2-3min ;加入1ml YEP，28°C輕輕震蕩2_4h，低速離心lmin，用0.1ml YEP懸浮沉澱，將細胞懸浮液塗布於含50 μ g/ml卡那黴素，50 μ g/ml利福平的YEP (NaC15g/L，蛋白腖10g/L，酵母粉10g/L，瓊脂粉15g/L)平板上28°C培養2_3天，挑取單菌落，ImlYEP搖菌，菌液用primerl和primer2PCR驗證，陽性菌株_80°C保存。
[0068]實施例3、花生的遺傳轉化和轉基因花生種子的獲得:
[0069](I)花生胚軸的遺傳轉化
[0070]外植體的製備:將成熟莢果去果皮，先後浸於濃度為75%的酒精中lmin，在質量濃度為0.1% HgCl2溶液中浸泡15min，進行表面消毒，再用無菌水漂洗3次。將種皮剝離，放入MS0培養基，於光下培養。培養4天左右取胚軸作為外植體。
[0071 ] MS0培養基按如下步驟配製:
[0072]取母液I 50mL,母液 I1、II1、IV 各 5mL ；再取 2,4-D (2，4- 二氯苯氧乙酸)5mL、NAA(萘乙酸)ImL —起放入燒杯中，無菌水定容到1L。固體培養基再加入9g瓊脂。
[0073]母液I組分如表1所示:
[0074]表1
【權利要求】
1.一種在花生油體蛋白系統中易於表達的人Insulin蛋白表達基因片段，將表達人Insulin蛋白的表達基因按照花生偏好的密碼子進行優化，並進行如下改造:將表達A鏈的基因片段中表達Asn21的核苷酸變為表達Gly21的核苷酸，同時表達B鏈基因片段的末端添加表達Arg31、Arg32兩個胺基酸殘基的核苷酸。
2.如權利要求1所述的人Insulin蛋白表達基因片段,其特徵在於,上述人Insulin蛋白表達基因片段的核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示。
3.一種利用油體蛋白系統在花生種子中表達人Insulin蛋白的方法，其特徵在於，步驟如下: (1)將上述在花生種子中易於表達的人Insulin蛋白表達基因片段進行人工合成，製得改造後表達基因片段； (2)以步驟(1)製得的改造後表達基因片段為模板進行PCR擴增，擴增引物如下: 正向引物:GGATCCATGGATTACAAGGATGATGA ； 反向引物:TCTAGATTACCCGCAATAATTCTCGA ； 將經測序正確的PCR產物經限制性內切酶BamH I和限制性內切酶Xba I雙酶切後，與同樣經限制性內切酶BamH I和限制性內切酶Xba I雙酶切的載體連接，製得植物表達載體； (3)步驟(2)製得的植物表達載體利用農桿菌侵染法轉化花生，獲得轉基因植株，經育繁後，收穫第二代轉基因花生純合體的花生種子，經純化，製得人Insulin蛋白。
4.如權利要求3所述的方法，其特徵在於，所述步驟(2)中，PCR反應體系如下: 模板 1μ 1，2XLA Taq mixlO μ 1，10 μ M 正向引物 0.5 μ 1，10 μ M 反向引物 0.5 μ 1，ddH208.0 μ I ο PCR反應程序如下: 94°C預變性5min ;94°C變性30s，55。。退火30s，72。。延伸30s，30個循環;72°C再延伸IOmin0
5.如權利要求3所述的方法，其特徵在於，所述步驟(2)中的測序為將PCR產物連接到T載體，經人工測序正確，即得。
6.如權利要求3所述的方法，其特徵在於，所述步驟⑵的載體為pCAMBIA2301-Ah01eosin載體，通過在載體pCAMBIA2301上插入序列如SEQ ID N0.2所示的花生油體蛋白啟動子及花生油體蛋白基因和序列如SEQ ID N0.3所示的終止子獲得。
7.如權利要求3所述的方法，其特徵在於，所述步驟(3)中農桿菌為LBA4404。
8.如權利要求3所述的方法，其特徵在於，所述步驟(3)中純化的步驟如下:將花生種子勻漿、壓榨；離心後去掉沉澱，回收上層的油相，清洗後、離心，再取上層的油相，加入腸肽酶進行酶消化反應，然後離心去掉上層的油相，回收水相，提取得到人Insulin蛋白。
【文檔編號】C12N15/17GK104017809SQ201410247746
【公開日】2014年9月3日 申請日期:2014年6月5日 優先權日:2014年6月5日
【發明者】畢玉平, 鄭玲, 彭振英, 邊斐, 焦其慶, 陳高 申請人:山東省農業科學院生物技術研究中心