一種利用DNA探針配體電化學檢測STAT3蛋白活化水平的方法和應用與流程
2023-05-29 10:16:21 3
本發明屬於分子診斷與產科高危妊娠檢測領域，涉及一種利用dna探針配體電化學檢測stat3蛋白活化水平的方法和應用。
背景技術：
目前，對於蛋白質活化水平的檢測分析主要依靠的仍然是傳統的免疫學方法如westernblotting和elisa等；stat3蛋白活化水平的檢測也主要是通過這兩種方法。但這些依賴於抗原抗體識別機制的經典方法存在著不同程度的局限性，如抗體高度複雜的化學結構、繁複的製備工藝和昂貴价格、操作繁瑣，費時且需要接觸放射性物質等。隨著對疾病相關的蛋白質標記物特異性檢測興趣的與日俱增，除了基於抗原-抗體結合的免疫分析，另一類基於核酸適配體化學合成配基的蛋白質生物傳感器也得到了巨大的關注，儘管兩者互相補充相輔相成，但對蛋白質標記物活化水平的檢測在靈敏度、選擇性、響應速度等諸多方面仍面臨新的挑戰：其一，單一配體如抗體和靶蛋白之間僵硬的一比一結合作用容易造成信號的衰減，影響新型信號放大策略的進一步引入；其二，利用兩種不同配體分別識別靶蛋白上不同結構域而設計的「三明治」檢測體系普適性較差，應用範圍比較局限，因為並非所有靶蛋白均可以具備滿意的「三明治」結合位點。基於現有的蛋白質分析檢測技術普遍存在靜態、低效、低時空分辨等缺點，難以滿足生命科學研究及臨床醫學檢驗的需求。
技術實現要素：
本發明的目的是針對現有技術的上述不足，提供一種新穎的不依賴於抗體、對stat3蛋白活化水平進行檢測和分析的電化學方法。
本方法的目的是通過下列技術措施實現的：
選用可以與stat3特異性結合的「誘餌寡核苷酸序列」(decoyoligonucleotide,decoyon)取代傳統的抗體，與一條互補dna序列一起作為識別捕獲靶標stat3蛋白的dna探針自組裝於電極表面，所述的dna探針與活化後的stat3蛋白結合；通過dna工具酶切除未與stat3蛋白結合的dna探針，再選用特殊磷酸化肽ac-(py)lpqtv-nh2結合靶標蛋白stat3釋放dna探針，之後加入zr4+以及磷酸化納米石墨烯複合信標，通過zr4+與磷酸基團間穩定的配位交聯作用將磷酸化納米石墨烯複合信標與釋放dna探針相連接，標記在電極表面，最後利用納米石墨烯裝載的大量磷酸基團配位大量三價鐵離子催化鄰苯二胺(o-phenylenediamine,opd)氧化產生大量電化學活性分子2,3-二氨基吩嗪(2,3-diaminophenazine,dap)，實現電極表面信號的多重放大。
所述的誘餌寡核苷酸序列修飾於電極上，其序列的5』端均修飾有巰基基團，與它們相互補的dna序列的5』端有磷酸基團修飾。序列如下：捕獲探針stat3decoyon：5』-sh-spacer18-catttcccgtaaatc-3』，和它的互補序列：5』-hpo4-gatttacgggaaatg-3』，該dna探針是一段與stat3靶基因啟動子順式作用元件序列相一致，又比後者具有更卓越親和力的雙鏈短核苷酸，可以和stat3蛋白活化二聚體特異性結合。
所述的dna探針自組裝於電極表面的方法為誘餌寡核苷酸序列在10mm三氯乙基磷酸酯溶液中室溫孵育1小時，以去除探針dna分子間或分子內的二硫鍵，將誘餌寡核苷酸序列及其互補dna序列在95℃水浴鍋中加熱5分鐘，後緩慢退火降至室溫，將金電極浸入到含0.2μm退火所得雙鏈dna的dna固定緩衝液中，再通過au-s鍵的共價作用，使dna探針自組裝在金電極表面形成一個緻密的單分子層；所述的dna固定緩衝液配方為10mmtris-hcl，1mmedta，0.1mnacl，10mmtcep，0.2μm退火所得雙鏈dna，ph7.4。
將金電極浸入到活化後的stat3蛋白溶液中溫育，電極上dna探針可以捕獲結合活化的stat3二聚體，stat3蛋白和電極上的dna捕獲探針間的溫育時間不少於120分鐘。
所述的dna工具酶即dnaseⅰ內切酶，對雙鏈dna具有切割活性，將沒有結合有stat3蛋白活化二聚體的、仍然裸露於電極上的過量dna探針全部從電極界面上切除。dnaseⅰ酶切反應時間定為不少於30分鐘。
所述的磷酸化肽ac-(py)lpqtv-nh2，結合靶標蛋白stat3釋放dna探針，即磷酸化肽ac-(py)lpqtv-nh2與stat3蛋白的sh2活化區特異性結合，使有活性的stat3二聚體構象發生改變，重新解聚成為無活性的無法與dna探針結合的單體，已被捕獲的stat3蛋白從電極上洗脫下來，原本與stat3蛋白質結合的dna探針得以完全暴露於電極上，使靶標蛋白的濃度轉換成為dna探針量的多少。磷酸化肽對stat3和dna探針間結合的有效逆轉和抑制(ic50＝150nm)，將金電極浸入到多肽反應溶液中(1μmac-(py)lpqtv-nh2，10mmtcep，10mmtbs，ph7.4)，衝洗電極時加入含有0.5％tween-20的tris-hcl緩衝液防止stat3解離後在電極表面的非特異性吸附。捕獲有靶標蛋白的電極與特殊磷肽孵育時間不少於60分鐘。
所述的磷酸化納米石墨烯複合信標由修飾有磷酸基團的1-芘甲胺鹽酸鹽(1-pyrenemethylamine-tyr(p)-oh,1mm)(購自上海科肽生物有限公司)與氧化石墨烯混勻製備而成。製備方法如下：石墨烯使用離心純化的方式進行處理。首先將石墨烯溶解到雙蒸水中並超聲60min。隨後離心去除較大片層。之後，取上清，通過離心洗滌的方式(16,000rcf,20min)進一步純化三次。最後，獲得的沉澱在80℃的烘箱中烘乾，獲得鱗片狀的氧化石墨烯。氧化石墨烯(0.5mg/ml)在每次實驗前需置於冰水中超聲5分鐘，得到褐色均一溶液。此後，將修飾有磷酸基團的1-芘甲胺鹽酸鹽(1-pyrenemethylamine-tyr(p)-oh,1mm)與氧化石墨烯混勻。室溫下攪拌30min後，離心分離以除去未吸附以及吸附不牢的1-芘甲胺鹽酸鹽，由此製得磷酸化納米石墨烯複合信標。
所述的zr4+與磷酸基團間穩定的配位交聯作用，指zr4+一方面通過配位作用與電極上殘留的dna末端修飾的磷酸基團發生交聯，另一方面zr4+與納米石墨烯複合信標中修飾的磷酸基團反應，發揮「離子膠水」的作用將磷酸化納米石墨烯複合信標連接至電極表面。stat3洗脫後的電極與磷酸化納米石墨烯複合信標溫育時間不少於60分鐘。zr4+僅識別和交聯少量的磷酸基團，剩餘的大量磷酸基團可以和三價鐵離子通過配位作用相螯合，藉助大量形成的絡離子發揮其對h2o2的催化活性。
所述的納米石墨烯複合信標配位大量三價鐵離子催化opd氧化產生大量dap的方法中，將已標記有磷酸化納米石墨烯複合信標的金電極置於fecl3反應溶液中(50μmfecl3,100mmhcl,ph7.0)，在室溫下靜置1小時。用100mmhcl溶液和雙蒸水依次衝洗電極，以終止反應並去除非特異性吸附。在加入h2o2前提下，再將電極浸入到1ml的tris-hcl反應溶液中(20mm,ph7.5)在50℃水浴條件下孵育30分鐘，該1ml的tris-hcl反應溶液中含有1μl的hcl和過量的2.5mgopd。
所述的電極信表面信號放大的方法，即室溫下通過電化學工作站完成電化學檢測。採用三電極系統：飽和甘汞電極(sce)為參比電極，金電極作為工作電極，鉑柱電極則依然作為對電極使用。所採用的電化學方法有交流阻抗法(eis)和方波伏安法(swv)。eis實驗採用的工作電解液是濃度為5mm的[fe(cn)6]3-/4-(10mmtris-hcl，ph7.4，0.1mkcl)溶液，掃描參數為：初始電平0.224v，振幅5mv，高頻10khz，低頻0.1khz。對生成的dap進行swv實驗所採用的電化學工作液是10mmtris-hcl(ph7.4)，掃描範圍從-0.7v到-0.2v，電位增量設置為4mv，方波振幅為25mv，方波頻率是15hz。三電極系統開始工作前，首先用高純度氮氣對各電解液進行除氧10分鐘，並在電化學掃描全程中仍使電解液處於氮氣氣氛，以排除溶液中殘留氧氣對檢測結果帶來的幹擾。
本發明的具體檢測方法如下：
(1)胎盤組織標本採集
取正常/子癇前期剖宮產後的無菌胎盤組織，在胎盤娩出後5分鐘內，立即在胎盤近臍帶部位剪取近母體面的胎盤絨毛組織(注意避開出血、壞死及鈣化區域)數塊。在冰上以無菌生理鹽水反覆洗滌組織數次防止有積血，對於蛻膜和小血管類的幹擾物質也要剔除乾淨。再將標本存於液氮組織中，以便後續的蛋白質提取、檢測分析實驗。
(2)配製裂解液
按下列順序配製需預冷的1×hypotonic反應溶液3ml：10×hypotonic反應溶液300μl，去離子水2.7ml；配製10mmdtt溶液：1mdtt(二硫蘇糖醇)溶液1μl，去離子水99μl；配製完全裂解溶液：10mmdtt溶液10μl；裂解反應溶液am189μl，蛋白酶抑制混合溶液1μl。其中，hypotonic、am1以及蛋白酶抑制混合溶液均為activemotif公司nuclearextractkit試劑盒(catalognos.40010&40410)中的試劑。
(3)組織裂解
胎盤組織細胞核中活化後的stat3蛋白的提取基於核提取試劑盒：(a)將新鮮冰凍組織標本稱重後，放在乾淨的燒杯中，在冰上用剪刀充分剪碎呈糊狀並儘量避開蛻膜及血管組織；(b)將組織放在預冷的低滲緩衝液(含100mmdtt和去垢劑)中，置於冰上用超聲裂解儀裂解10分鐘，功率為75w，工作2s，間歇3s；(c)超聲結束後在冰上繼續孵育15分鐘；(d)將所得的懸浮液在4℃條件下850g離心15分鐘(離心機需預冷)，棄去上清液；(e)用50μl完全裂解緩衝液(含1mmdtt和0.1％蛋白酶抑制cocktail)將細胞核沉澱重懸並渦旋10秒後；(f)在冰上持續振蕩孵育30分鐘；(g)最後將懸浮液在4℃轉速為14000g的條件下離心5分鐘，收集上清液，並迅速用於隨後的電化學測量。
(4)金電極的製備和修飾
金電極處理過程如下：首先，用70％的濃h2so4：30％h2o2配製好piranha溶液並把電極置於其中浸泡5分鐘，然後用雙蒸水反覆衝洗乾淨以除去電極表面吸附的有機物質。隨後用3000目和5000目的砂紙精心打磨金電極，而隨後使用的不同粒度(1μm，0.3μm，0.05μm)的氧化鋁砂漿則是為了保證將電極打磨至鏡面(金電極表面沒有劃痕為佳)。用雙蒸水衝洗乾淨後，還要將電極放入乙醇、雙蒸水中各超聲5分鐘，以清洗電極表面所殘留的氧化鋁粉末。取出電極用水衝洗後，再將其置於預先配置好的50％硝酸中浸泡30分鐘，最後在通氮氣的氛圍下在0.5m的h2so4中進行循環伏安掃描直至信號穩定，進一步除去電極表面的吸附物質，以利於形成較平整的自組裝單層保證每次實驗的平行性。最後將電極置於氮氣氛圍內乾燥備用。修飾有巰基的誘餌寡核苷酸序列首先在10mmtcep溶液中室溫孵育1小時，以去除探針dna分子間或分子內的二硫鍵。將該捕獲探針序列及其互補序列在95℃水浴鍋中加熱5分鐘，後緩慢退火降至室溫，以便dna雜交形成雙鏈。再將上述已經過處理的金電極浸入到dna固定緩衝液中(含有0.2μm雙鏈dna)，室溫下黑暗處放置16小時。由於捕獲探針dna3』端修飾的巰基可以與金電極表面形成牢固的金-硫共價鍵，tcep的加入則是為了避免雙鏈dna末端的巰基形成的二硫鍵幹擾dna在電極界面的自組裝，故在巰基的作用下，通過au-s鍵雙鏈dna探針可以充分自組裝到電極表面。隨後，將衝洗乾淨的金電極浸入1mmmch溶液中，通風櫥中放置1小時，使得緻密的dna自組裝單層可以在電極表面形成。最後用雙蒸水去除電極表面的剩餘溶液並用氮氣吹乾待用。
(5)磷酸化納米石墨烯複合信標的製備
首先將石墨烯溶解到雙蒸水中並超聲60分鐘。隨後離心去除較大片層。之後，取上清，通過離心洗滌的方式(16,000rcf，20分鐘)進一步純化三次。最後，獲得的沉澱在80℃的烘箱中烘乾，獲得鱗片狀的氧化石墨烯。氧化石墨烯(0.5mg/ml)在每次實驗前需置於冰水中超聲5分鐘，得到褐色均一溶液。此後，將修飾有磷酸基團的1-芘甲胺鹽酸鹽(1-pyrenemethylamine-tyr(p)-oh,1mm)與氧化石墨烯混勻。室溫下攪拌30min後，離心分離以除去未吸附以及吸附不牢的1-芘甲胺鹽酸鹽衍生物，由此製得磷酸化納米石墨烯複合信標。
(6)stat3蛋白活化水平的檢測
首先用src激酶反應溶液將重組人stat3蛋白的儲液稀釋至實驗所需的一系列濃度，src激酶反應溶液中src激酶的終濃度均為500unit/ml。上述混合溶液隨後在37℃水浴下反應30分鐘，以保證對溶液中stat3蛋白的充分活化。所有活化完全的stat3溶液中含有：20mmtris-hcl(ph7.2)，20mmmgcl2，2mmdtt，2mmedta，70mmkcl，25mmmops，12.5mmβ-glycerol-phosphate，12.5mmmncl2，5mmegta。再將修飾有捕獲探針dna自組裝單層的金電極浸入到含不同濃度的活化的stat3二聚體的反應溶液中，在室溫下孵育120分鐘。然後將電極取出，用雙蒸水反覆衝洗電極三遍以去除吸附在電極表面的非特異性分子。
(7)利用dnaseⅰ對電極表面未結合有蛋白的剩餘dna進行降解
當活化的stat3二聚體被電極上dna探針成功捕獲後，將電極浸入到含有10udnaseⅰ的50μl1×neb反應緩衝液中，在37℃水浴條件下反應30分鐘，以確保dnaseⅰ將電極上未與蛋白結合的過量dna降解完全，然後加入5mmedta終止整個反應。最後將電極用雙蒸水徹底衝洗3分鐘以終止反應。
(8)磷酸化肽介導的stat3蛋白和捕獲探針dna間的可逆性解離
首先將經過dnaseⅰ降解後只留有與stat3結合的dna的金電極浸入到多肽反應溶液(1μm磷酸化肽，10mmtcep，10mmtbs，ph7.4)中，置於室溫下反應60分鐘，促使原本相互結合的stat3和dna探針之間相互解離。之後，分別用含有0.5％tween的tris-hcl緩衝液，tris-hcl緩衝液，雙蒸水依次衝洗電極(tween-20的作用是防止stat3解離後在電極表面的非特異性吸附)。
(9)鋯離子(zr4+)介導的磷酸化納米石墨烯複合信標和電極上剩餘dna探針的連接
首先將留有曾結合stat3蛋白的dna探針的金電極浸入到0.2mm二氯氧鋯溶液中，在室溫下靜置1小時。zr4+可以通過配位作用與電極上殘留的dna末端修飾有的磷酸基團發生交聯。經過雙蒸水的反覆淋洗後，將電極浸沒到磷酸化納米石墨烯複合信標溶液中，在室溫下放置1小時。再重複以上的電極淋洗步驟，並用氮氣吹乾。
(10)磷酸化納米石墨烯複合信標介導的信號多重放大
首先將已標記有磷酸化納米石墨烯複合信標的金電極置於fecl3反應溶液中(50μm,100mmhcl,ph7.0)，在室溫下靜置1小時。用100mmhcl溶液和雙蒸水依次衝洗電極，以終止反應並去除非特異性吸附。在加入h2o2前提下，再將電極浸入到1ml的tris-hcl反應溶液中(20mm,ph7.5)在50℃水浴條件下孵育30分鐘，該反應溶液中含有1μl的hcl和過量的2.5mgopd。
(11)電化學測量
室溫下通過電化學工作站(chi660d，ch儀器)完成電化學檢測。採用三電極系統：飽和甘汞電極(sce)為參比電極，金電極作為工作電極，鉑柱電極則依然作為對電極使用。本實驗中所採用的電化學方法有交流阻抗法(eis)和方波伏安法(swv)。eis實驗採用的工作電解液是濃度為5mm的[fe(cn)6]3-/4-(10mmtris–hcl，ph7.4，0.1mkcl)溶液，掃描參數為：初始電平0.224v，振幅5mv，高頻10khz，低頻0.1khz。對生成的dap進行swv實驗所採用的電化學工作液是10mmtris-hcl(ph7.4)，掃描範圍從-0.7v到-0.2v，電位增量設置為4mv，方波振幅為25mv，方波頻率是15hz。三電極系統開始工作前，首先用高純度氮氣對各電解液進行除氧10分鐘，並在電化學掃描全程中仍使電解液處於氮氣氣氛，以排除溶液中殘留氧氣對實驗結果帶來的幹擾。實驗中所得到的每個數據均進行了至少五次的獨立重複實驗，實驗重複五次得到標準差。
本發明通過運用了兩種天然適配體和靶標蛋白間的相互作用，並將它與基因工程中發展起來的工具酶、不同於抗原抗體的小分子識別機制以及材料科學中新近提出的具有特殊性能的納米材料相偶聯，從而實現了對stat3蛋白活化水平的高靈敏性高特異性的檢測，並很好地豐富並擴展了現有的分子識別和信號轉換的方法。通過控制多肽來調節活化後的stat3蛋白與dna探針間的結合和脫離，並藉助於dna工具酶的作用，使靶標蛋白的濃度轉換成為dna探針量的多少，巧妙地利用蛋白與多肽、dna兩種天然配體間的相互作用和構象變化，實現「信號開放」(signal-on)的信號轉化。本發明還利用磷酸基團和鋯離子之間穩定的配位作用，通過這種簡便易行高效的小分子識別機制，引入了磷酸化納米石墨烯複合信標作為信號放大的策略，克服了以往用抗體和納米材料相結合時，由於抗體高度複雜的結構、多樣的生物學效應所帶來的結合質量不穩定、抗體容易失活的問題。
本發明的有益效果：
(1)提高了檢測靈敏度
本發明所用到的氧化石墨烯是一種高度氧化，高度親水的層狀材料。它有較大表面積、長期穩定性、良好的生物相容性以及顯著的電子傳遞能力，可以吸附大量報告分子，具有信號放大的作用；又可通過共價及非共價修飾等方法，將不同的功能基團連接到石墨烯碳骨架上，發揮分子識別、催化等多種生物學作用；同時能穩定吸附ssdna，但不會吸附dsdna，其原因在於dna雜交後原先暴露的鹼基被磷酸骨架屏蔽，導致石墨烯無法接觸到鹼基。基於納米石墨烯材料眾多優良特性，可裝載大量磷酸基團配位大量三價鐵離子，從而藉助這些配離子的催化作用形成信號的多重放大。極大地提升了方法的靈敏度和檢測品質。
(2)對靶標檢測的高特異性和高效能
利用可以和stat3特異性結合的dna探針取代了傳統的抗體，用於識別捕獲活化的靶標蛋白。這類配體在蛋白質定量分析方面具有一些獨特的優勢：1)結構簡單而明確，在體外合成的工藝相比於抗體來說操作簡單，具有著極佳的性價比；2)它更容易進行功能性修飾和標記，模塊化的程度很高又可保留有原本的生物活性；3)它的目標蛋白範圍更廣；4)可以與許多新型信號放大策略相偶聯從而提高檢測的效能和靈敏性。
(3)對抗原的檢測不依賴於抗體
巧妙地利用了stat3蛋白與特異性磷肽和dna探針這兩種不同的天然配體間的相互作用關係和可逆構象變化的特性，利用特殊磷酸化肽動態地可逆地調控靶標蛋白stat3和dna探針間的結合與分離，發明了一種新穎的不依賴於抗體的對stat3蛋白活化水平進行檢測和分析的電化學方法。
(4)在子癇前期臨床評估、早期診斷、靶向治療等方面的應用
本發明構建的電化學體系不僅可以高穩定性地對stat3蛋白活化水平進行快速、動態和準確的檢測，更為重要的是，該體系可以成功應用於臨床實際生物樣本的檢測分析中。因此，本發明不但在未來可以作為高效靈敏的檢測及分析平臺，被應用到對與疾病密切相關的蛋白標誌物進行準確表徵和定量檢測的研究中去；還可以為今後更加深入廣泛地探索子癇前期、胎兒生長受限、腫瘤等多種疾病的發病機制，尋找個體化的治療方法上提供新的手段和研究思路。在疾病的早期診斷、預後評估和靶向治療等方面具有著很高的應用價值和廣闊的應用前景。
附圖說明
圖1金電極表面在實驗各階段所得的交流阻抗圖。(a)裸金電極；(b)捕獲探針雙鏈dna序列修飾的金電極；(c)捕獲有活化的stat3蛋白的金電極；(d)內切酶切除部分裸露的dna探針並引入特殊磷酸化肽後的金電極；(e)通過zr4+的配位作用，將磷酸化納米石墨烯複合信標固定到電極表面後所得到的交流阻抗圖。
圖2修飾有捕獲探針雙鏈dna序列的金電極，分別與含有100nm活化的stat3蛋白的溶液，含有100nm未活化的stat3蛋白的tbs緩衝液，10mmtbs緩衝液(ph7.4)反應後，在電解質溶液中掃描所得到的dap的方波伏安圖。
圖3(a)捕獲探針dna序列修飾的金電極經處理後，所獲得的dap的方波伏安圖，用於優化活化的stat3蛋白與電極溫育時間。修飾有捕獲探針的金電極與含有100nm活化的stat3蛋白的溶液溫育不同的時間。圖b為圖a中峰電流對所優化實驗條件作圖。誤差線為實驗重複五次的標準差。
圖4(a)捕獲探針dna序列修飾的金電極經處理後，所獲得的dap的方波伏安圖，用於優化dnaseⅰ酶切反應時間。金電極在與100nmstat3蛋白結合後，依次與dnaseⅰ酶反應不同的時間。圖b為圖a中峰電流對所優化實驗條件作圖。誤差線為實驗重複五次的標準差。
圖5(a)捕獲探針dna序列修飾的金電極經處理後，所獲得的dap的方波伏安圖，用於優化與特殊磷肽孵育時間的方波伏安圖。捕獲有靶標蛋白的電極與特殊磷酸化肽孵育不同的時間。圖b為圖a中峰電流對所優化實驗條件作圖。誤差線為實驗重複五次的標準差。
圖6(a)捕獲探針dna序列修飾的金電極經處理後，所獲得的dap的方波伏安圖，用於優化磷酸化納米石墨烯複合信標與電極溫育時間後的方波伏安圖。stat3洗脫後的的電極與磷酸化納米石墨烯複合信標溫育不同的時間。圖b為圖a中峰電流對所優化實驗條件作圖。誤差線為實驗重複五次的標準差。
圖7(a)捕獲探針dna序列修飾的金電極與處於不同活化水平的stat3蛋白反應後，所獲得的dap的的方波伏安圖。(b)為圖a中峰電流對不同活化水平的stat3蛋白作圖。內嵌圖為stat3蛋白在0.1-100nm濃度範圍內，峰電流值和stat3蛋白活化水平(橫坐標濃度經過對數處理)間的線性關係圖。誤差線為五次獨立重複實驗之間的標準偏差。
圖8檢測100nm活化的stat3蛋白及一系列對照實驗中電極表面所得到的dap的方波伏安圖譜。除了將捕獲探針修飾的金電極分別與實驗組中標準的100nm活化的stat3蛋白以及一系列對照組的樣品反應外，還將修飾有dna探針的亂序序列的金電極與100nm活化的stat3蛋白相反應。對照組實驗包含有：tbs緩衝液所代表的空白對照，hsa及失活的stat3蛋白，其濃度均為100nm。
圖9(a)捕獲探針dna序列修飾的金電極與不同組織樣本的細胞核提取物溶液反應後，所獲得的dap的的方波伏安圖；(b)為正常妊娠孕婦、輕度子癇前期和重度子癇前期患者胎盤組織中stat3蛋白的活化水平。誤差線為重複五次的標準差。
圖10本發明方法原理圖.
具體實施方式
實施例1
交流阻抗是研究表面修飾電極的界面特徵的有效手段。為了確認電極表面的修飾情況，首先在檢測的各個階段利用eis技術研究了金電極表面狀態的變化。交流阻抗圖包括了高頻區的與界面電子傳遞過程關聯的半圓，和低頻區與溶液本體向電極表面擴散過程相關的線性部分。而半圓直徑的增加反應了電極表面電荷傳遞阻力的增大。
圖1清晰地反應了不同反應階段金電極表面的交流阻抗情況。如圖1a所示，裸金電極的阻抗圖幾乎是一條直線，說明電子在電極表面的傳遞並未受到任何幹擾。當在電極表面形成緻密的捕獲探針dna自組裝單層後，金電極的交流阻抗圖譜中出現了一個明顯的半圓弧(圖1b)，說明此時電極表面電子傳遞的阻力已經增大。這是由於自組裝的雙鏈dna的磷酸骨架是負電性的，在電極表面形成了有序的負電荷界面，對於溶液中同樣帶有負電荷的[fe(cn)6]3-/4-產生很大的靜電排斥。隨後，當探針將活化後的stat3蛋白捕獲到電極表面，半圓直徑顯著增大(圖1c)。這種電極表面電子傳遞阻力的明顯增加來源於電極上的部分探針dna序列與stat3蛋白二聚體相結合。但是，當利用工具酶切除了電極上裸露的部分dna探針，並引入可以和stat3蛋白的sh2活化區特異性結合的磷酸化肽後，半圓的直徑極大地減小，電子傳遞的阻力下降地非常明顯，甚至小於b(圖1d)。這一方面是由於內切酶從電極上切除了部分dna，dna量的減少使得其對[fe(cn)6]3-/4-的排斥作用有所減少；另一方面是由於該多肽可以使有活性的stat3二聚體構象發生改變，重新解聚成為無活性的無法和dna探針結合的單體，故可將已被捕獲的stat3蛋白從電極上洗脫下來。通過zr4+將磷酸化納米石墨烯複合信標連接到電極表面後，半圓的直徑又明顯增加(圖1e)。這是由於氧化石墨烯帶大量的負電荷，受靜電排斥影響，[fe(cn)6]3-/4-與電極表面的電子傳遞進一步受限。
實施例2
將修飾有捕獲探針雙鏈dna序列的金電極，分別與100nm活化的stat3蛋白、100nm未活化的stat3蛋白、10mmtbs緩衝液(ph7.4)反應，考察本發明對活化的stat3蛋白的特異性。
圖4中，當功能化的金電極與活化的stat3蛋白相反應經過一系列的實驗步驟並最終引入石墨烯催化信標後，所催化的臨苯胺氧化反應產生大量有電化學信號的2,3-二氨基吩嗪，從而在-0.42mv處可產生一個非常明顯的swv峰。但是，當用同濃度非活化的stat3蛋白替代活化的蛋白或用tbs緩衝液作為空白對照與電極反應後，由於電極表面無蛋白質結合，全部dna均被降解，最終無法提供可供zr4+識別的磷酸化位點，故zr4+無法發揮其「離子膠水」的作用將功能化的納米石墨烯複合信標固定到電極表面，因此這兩種情況下所產生的swv峰與活化的stat3蛋白產生的swv峰相比，背景信號均很小並可以忽略不計。
實施例3
蛋白與捕獲探針溫育時間的優化。考慮到能夠將活化的stat3蛋白從液相中被捕獲並成功固定到電極界面，是整個流程的重要基礎，因此本實施例對stat3蛋白和電極上的dna捕獲探針間的溫育時間進行了優化(圖3)。實驗結果表明，在120分鐘時swv的峰電流值達到了飽和，120分鐘已經足以確保活化的stat3可以被捕獲探針dna序列識別並結合，從而固定到金電極的表面，故將實驗中這一步驟的溫育時間選定為了120分鐘。
實施例4
利用dnaseⅰ這一內切酶對雙鏈dna的切割特性，可將沒有結合有stat3蛋白的、仍然裸露於電極上的dna全部從電極界面上切除。由於此發明是針對stat3活化水平進行的檢測，工具酶的降解效果對隨後將靶標蛋白的濃度轉換成為剩餘dna探針量的多少，實現信號輸出的定量、成比例轉化至關重要。因此，對於dnaseⅰ酶切反應時間本文也進行了優化。在使用固定的活化的stat3蛋白濃度的前提下，以swv峰電流的變化對dnaseⅰ酶切的不同反應時間作圖(圖6)。如圖所示：隨著dnaseⅰ酶切反應時間的延長，swv的峰電流也在快速地減小，說明對電極上裸露dna的降解進行的越來越徹底，直到酶切反應時間達到30分鐘時，電極上未被蛋白保護的dna探針也被徹底切除，繼續增加酶切反應時間電信號不再有明顯減少而達飽和，說明酶切時間為30分鐘時可達到酶的最佳作用時間。因此發明的檢測條件將dnaseⅰ酶切反應時間定為30分鐘。
實施例5
捕獲有靶標蛋白的電極與特殊磷肽孵育時間的優化，利用特殊磷酸化肽可逆性地調控靶標蛋白stat3和dna探針間的結合與解離，最終實現信號的定量輸出和級聯放大。通過引入可以和stat3蛋白的sh2活化區特異性結合的磷肽，將stat3蛋白徹底地從電極界面上洗脫下來決定發明方法的準確性。因此，需對捕獲有靶標蛋白的電極與特殊磷酸化肽間的孵育時間進行了優化。實驗結果表明(圖7)：swv的峰電流隨著兩者之間孵育時間的延長而逐漸增大，在60分鐘時進入了穩定的平臺期。因此，選擇60分鐘作為最終孵育時間。
實施例6
stat3洗脫後的電極與磷酸化納米石墨烯複合信標溫育時間的優化，由於本方法的靈敏性在很大程度上依賴於功能化的納米石墨烯複合信標帶來的信號級聯放大，因此電極與磷酸化納米石墨烯複合信標間的溫育時間，對信號放大效果和檢測品質都起著重要作用。因此，對於該步驟的反應時間進行了優化。如圖8結果所示：當該步反應時間達到60分鐘時，swv的峰電流響應已經達到了飽和，說明該反應時間已經足以保證實驗體系的信號放大效果和靈敏度。所以將60分鐘選擇為了重新釋放了捕獲探針的電極與磷酸化納米石墨烯複合信標間的溫育時間。
實施例7
stat3蛋白活化水平的電化學檢測，考察處於不同活化水平的stat3蛋白進行了電化學檢測。
如圖7a所示，隨著stat3蛋白活化水平從0nm逐漸提高到100nm，swv的響應也在隨之增加，且在超過這一活化水平後最終達到了穩定的平臺期，這說明隨著stat3蛋白活化水平的提高，結合到電極表面的蛋白質也越來越多，經過dna酶切後保留在電極界面的dna探針的量也逐漸增多，並提供了越來越多的磷酸基團供zr4+識別，通過zr4+發揮「離子膠水」的作用可以將更多的磷酸化納米石墨烯複合信標固定到電極的表面。
圖7b則是swv峰電流與處於不同活化水平的stat3蛋白間的關係圖。從圖中可以看出，在0.1-100nm的濃度範圍內，隨著stat3蛋白活化水平的提高，swv的峰電流值逐漸升高。在該濃度範圍內，峰電流與濃度的對數呈現出線性關係(圖7b，內嵌圖)。對於圖7中所選取的每一個濃度都進行了至少五次的獨立重複試驗。根據所有濃度下的變異係數，推算出的平均變異係數小於5.00％。表明本檢測體系對於stat3蛋白活化水平的檢測性能穩定且可靠。根據背景信號加它的三倍標準差的方法，還可以推算出該檢測體系的最低檢測限為0.085nm，實驗顯示出了很高的靈敏度。
實施例8
為了驗證本發明方法對於stat3蛋白活化水平檢測的準確性和專一性，首先將修飾有捕獲探針的金電極與100nm活化後的stat3蛋白相反應，在-0.42mv處可見一明顯的swv峰。在對照試驗中，我們則首先將修飾有原捕獲探針的亂序序列的金電極按照上述步驟，與100nm活化後的stat3蛋白相反應。同時在相同的蛋白濃度下，我們將修飾有捕獲探針dna序列的金電極與失活的stat3蛋白、hsa、空白對照溶液反應後，如圖8所示，無論是原dna探針亂序序列修飾的金電極、非特異性的蛋白、失活的stat3蛋白還是空白對照實驗，檢測體系所得到的結果是基本相同的，電化學信號均可以忽略不計。因此說明本發明方法具有很高的特異性。
實施例9
為了驗證本文的檢測體系在臨床複雜樣本中的可行性和穩定性，我們進一步選取了輕度子癇前期產婦、重度子癇前期產婦和正常妊娠產婦的胎盤組織，並對組織中stat3蛋白的活化水平進行檢測和比較分析，以用來評估stat3蛋白活化水平的異常與子癇前期發生發展的相關性。
本實施例分別收集了正常妊娠孕婦、輕度子癇前期患者、重度子癇前期患者的胎盤組織各5例，並提取這些組織的核蛋白進行檢測。具體流程如下：
(1)胎盤組織標本採集
取正常/子癇前期剖宮產後的無菌胎盤組織，在胎盤娩出後5分鐘內，立即在胎盤近臍帶部位剪取近母體面的胎盤絨毛組織(注意避開出血、壞死及鈣化區域)數塊。在冰上以無菌生理鹽水反覆洗滌組織數次防止有積血，對於蛻膜和小血管類的幹擾物質也要剔除乾淨。再將標本存於液氮組織中，以便後續的蛋白質提取、檢測分析實驗。
(2)配置裂解液
按下列順序配置需預冷的1×hypotonic反應溶液3ml：10×hypotonic反應溶液300μl，去離子水2.7ml；配製10mmdtt溶液：1mdtt溶液1μl，去離子水99μl；配製完全裂解溶液：10mmdtt溶液10μl；裂解反應溶液am189μl，蛋白酶抑制混合溶液1μl。
(3)組織裂解
胎盤組織細胞核中活化後的stat3蛋白的提取基於核提取試劑盒：(a)將新鮮冰凍組織標本稱重後，放在乾淨的燒杯中，在冰上用剪刀充分剪碎呈糊狀並儘量避開蛻膜及血管組織；(b)將組織放在預冷的低滲緩衝液(含100mmdtt和去垢劑)中，置於冰上用超聲裂解儀裂解10分鐘，功率為75w，工作2s，間歇3s；(c)超聲結束後在冰上繼續孵育15分鐘；(d)將所得的懸浮液在4℃條件下850g離心15分鐘(離心機需預冷)，棄去上清液；(e)用50μl完全裂解緩衝液(含1mmdtt和0.1％蛋白酶抑制cocktail)將細胞核沉澱重懸並渦旋10秒後；(f)在冰上持續振蕩孵育30分鐘；(g)最後將懸浮液在4℃轉速為14000g的條件下離心5分鐘，收集上清液，並迅速用於隨後的電化學測量。
(4)金電極的製備和修飾
金電極處理過程如下：首先，用70％的濃h2so4：30％h2o2配置好piranha溶液並把電極置於其中浸泡5分鐘，然後用雙蒸水反覆衝洗乾淨以除去電極表面吸附的有機物質。隨後用3000目和5000目的砂紙精心打磨金電極，而隨後使用的不同粒度(1μm，0.3μm，0.05μm)的氧化鋁砂漿則是為了保證將電極打磨至鏡面(金電極表面沒有劃痕為佳)。用雙蒸水衝洗乾淨後，還要將電極放入乙醇、雙蒸水中各超聲5分鐘，以清洗電極表面所殘留的氧化鋁粉末。取出電極用水衝洗後，再將其置於預先配置好的50％硝酸中浸泡30分鐘，最後在通氮氣的氛圍下在0.5m的h2so4中進行循環伏安掃描直至信號穩定，進一步除去電極表面的吸附物質，以利於形成較平整的自組裝單層保證每次實驗的平行性。最後將電極置於氮氣氛圍內乾燥備用。修飾有巰基的dna捕獲探針序列首先在10mmtcep溶液中室溫孵育1小時，以去除探針dna分子間或分子內的二硫鍵。將該捕獲探針序列及其互補序列在95℃水浴鍋中加熱5分鐘，後緩慢退火降至室溫，以便dna雜交形成雙鏈。再將上述已經過處理的金電極浸入到dna固定緩衝液中(含有0.2μm雙鏈dna)，室溫下黑暗處放置16小時。由於捕獲探針dna3』端修飾的巰基可以與金電極表面形成牢固的金-硫共價鍵，tcep的加入則是為了避免雙鏈dna末端的巰基形成的二硫鍵幹擾dna在電極界面的自組裝，故在巰基的作用下，通過au-s鍵雙鏈dna探針可以充分自組裝到電極表面。隨後，將衝洗乾淨的金電極浸入1mmmch溶液中，通風櫥中放置1小時，使得緻密的dna自組裝單層可以在電極表面形成。最後用雙蒸水去除電極表面的剩餘溶液並用氮氣吹乾待用。
(5)磷酸化納米石墨烯複合信標的製備
首先將石墨烯溶解到雙蒸水中並超聲60分鐘。隨後離心去除較大片層。之後，取上清，通過離心洗滌的方式(16,000rcf，20分鐘)進一步純化三次。最後，獲得的沉澱在80℃的烘箱中烘乾，獲得鱗片狀的氧化石墨烯。氧化石墨烯(0.5mg/ml)在每次實驗前需置於冰水中超聲5分鐘，得到褐色均一溶液。此後，將修飾有磷酸基團的1-芘甲胺鹽酸鹽衍生物(1-pyrenemethylamine-tyr(p)-oh,1mm)與氧化石墨烯混勻。室溫下攪拌30min後，離心分離以除去未吸附以及吸附不牢的1-芘甲胺鹽酸鹽衍生物，由此製得磷酸化納米石墨烯複合信標。
(6)stat3蛋白活化水平的檢測
首先用src激酶反應溶液將重組人stat3蛋白的儲液稀釋至實驗所需的一系列濃度，src激酶反應溶液中src激酶的終濃度均為500unit/ml。上述混合溶液隨後在37℃水浴下反應30分鐘，以保證對溶液中stat3蛋白的充分活化。所有活化完全的stat3溶液中含有：20mmtris-hcl(ph7.2)，20mmmgcl2，2mmdtt，2mmedta，70mmkcl，25mmmops，12.5mmβ-glycerol-phosphate，12.5mmmncl2，5mmegta。再將修飾有捕獲探針dna自組裝單層的金電極浸入到含不同濃度的活化的stat3二聚體的反應溶液中，在室溫下孵育120分鐘。然後將電極取出，用雙蒸水反覆衝洗電極三遍以去除吸附在電極表面的非特異性分子。
(7)利用dnaseⅰ對電極表面未結合有蛋白的剩餘dna進行降解
當活化的stat3二聚體被電極上dna探針成功捕獲後，將電極浸入到含有10udnaseⅰ的50μl1×neb反應緩衝液中，在37℃水浴條件下反應30分鐘，以確保dnaseⅰ將電極上未與蛋白結合的過量dna降解完全，然後加入5mmedta終止整個反應。最後將電極用雙蒸水徹底衝洗3分鐘以終止反應。
(8)磷酸化肽介導的stat3蛋白和捕獲探針dna間的可逆性解離
首先將該磷酸化肽溶解於多肽反應溶液中(1um多肽，10mmtcep，10mmtbs，ph7.4)，隨後將經過dnaseⅰ降解後只留有與stat3結合的dna的金電極浸入到該多肽反應溶液中，置於室溫下反應60分鐘，促使原本相互結合的stat3和dna探針之間相互解離。最後，分別用含有0.5％tween的tris-hcl緩衝液，tris-hcl緩衝液，雙蒸水依次衝洗電極(tween-20的作用是防止stat3解離後在電極表面的非特異性吸附)。
(9)鋯離子(zr4+)介導的磷酸化納米石墨烯複合信標和電極上剩餘dna探針的連接
首先將留有曾結合stat3蛋白的dna探針的金電極浸入到0.2mm二氯氧鋯溶液中，在室溫下靜置1小時。zr4+可以通過配位作用與電極上殘留的dna末端修飾有的磷酸基團發生交聯。經過雙蒸水的反覆淋洗後，將電極浸沒到磷酸化納米石墨烯複合信標溶液中，在室溫下放置1小時。再重複以上的電極淋洗步驟，並用氮氣吹乾。
(10)磷酸化納米石墨烯複合信標介導的信號多重放大
首先將已標記有磷酸化納米石墨烯複合信標的金電極置於fecl3反應溶液中(50μm,100mmhcl,ph7.0)，在室溫下靜置1小時。用100mmhcl溶液和雙蒸水依次衝洗電極，以終止反應並去除非特異性吸附。在加入h2o2前提下，再將電極浸入到1ml的tris-hcl反應溶液中(20mm,ph7.5)在50℃水浴條件下孵育30分鐘，該反應溶液中含有1μl的hcl和過量的2.5mgopd。
(11)電化學測量
室溫下通過電化學工作站(chi660d，ch儀器)完成電化學檢測。採用三電極系統：飽和甘汞電極(sce)為參比電極，金電極作為工作電極，鉑柱電極則依然作為對電極使用。本實驗中所採用的電化學方法有交流阻抗法(eis)和方波伏安法(swv)。eis實驗採用的工作電解液是濃度為5mm的[fe(cn)6]3-/4-(10mmtris–hcl，ph7.4，0.1mkcl)溶液，掃描參數為：初始電平0.224v，振幅5mv，高頻10khz，低頻0.1khz。對生成的dap進行swv實驗所採用的電化學工作液是10mmtris-hcl(ph7.4)，掃描範圍從-0.7v到-0.2v，電位增量設置為4mv，方波振幅為25mv，方波頻率是15hz。三電極系統開始工作前，首先用高純度氮氣對各電解液進行除氧10分鐘，並在電化學掃描全程中仍使電解液處於氮氣氣氛，以排除溶液中殘留氧氣對實驗結果帶來的幹擾。實驗中所得到的每個數據均進行了至少五次的獨立重複實驗，實驗重複五次得到標準差。
檢測結果如圖9所示，與正常妊娠孕婦胎盤組織中的stat3蛋白活化水平相比，輕度、重度子癇前期患者胎盤組織中stat3的活化水平都有所降低，且重度子癇前期組胎盤組織中stat3的活化水平亦低於輕度子癇前期組。檢測出的stat3蛋白的活化水平可以在一定程度上反映子癇前期的發生和發展，本實施例的檢測結果也與相關研究領域先前的報導相一致。特別需要指出的是，原組織中的stat3活化水平遠超出本檢測方法的線性標定範圍，因此採用了10倍稀釋的樣品用於檢測。可見，本方法較高的檢測靈敏性有利於降低臨床樣本用量。
本實施例結果證實本文提出的新方法能高效地對實際生物樣本中的stat3蛋白活化水平進行檢測和分析，為今後進一步研究揭示stat3在子癇前期和一系列妊娠相關疾病中的作用機理奠定堅實的基礎。stat3活化水平的深入研究，有望成為子癇前期臨床評估、早期診斷、靶向治療等方面研究新的突破口。
雖然本實施例提供的是檢測胎盤組織樣本中的stat3蛋白活化水平，但本方法同樣適用於檢測非生物樣本中的stat3蛋白活化水平，因此，不應將本發明理解為疾病的診斷方法。