一種土壤微生物基因組dna和總rna的提取方法
2023-05-29 03:11:56 1
專利名稱：一種土壤微生物基因組dna和總rna的提取方法
技術領域：
本發明涉及一種土壤微生物基因組DNA和總RNA的提取方法，屬於生物技術領域。
背景技術：
由於傳統微生物學研究方法等因素的限制，作為生命科學研究來源和生物技術創 新基礎的微生物資源的開發和利用曾一度陷入高頻率重複篩選的僵局，而現代生物技術的 不斷發展逐漸克服了這些難題。在現代土壤微生態學研究中，直接提取土壤中微生物基因 組DNA，並在此基礎利用目前先進的分子生物學技術，例如擴增片段長度多態性(AFLP)技 術、末端限制性片段長度多態性(T-RFLP)技術、單鏈構型多態性(SSCP)、變性/溫度梯度凝 膠電泳(DGGE/TGGE)技術，在一定程度上克服了傳統培養方法所造成的土壤微生物信息大 量丟失的弊端，更加全面、精確地揭示出根際土壤微生物群落結構和功能的多樣性。但是相對於單純培養的微生物而言，土壤微生物DNA提取存在一些困難，常規方 法獲得的DNA難以滿足下遊分子操作要求。這主要是由以下兩種原因造成
(1) 土壤成分複雜，包含多種PCR的抑制物，例如重金屬、多糖類、多酚類、腐殖質 等。其中腐殖質由於具有與DNA類似的性質，因此可以在DNA常規抽提中與DNA共沉澱，腐 殖質極少量的存在就可以強烈地抑制PCR反應。(2) 土壤等環境微生物相對於單純培養的微生物更難以裂解。將常規純培養 微生物的DNA提取方法用於土壤等環境微生物DNA提取所獲得的微生物細胞裂解率低，因 此所獲DNA不能反映原始樣品的特種豐度。此外，也造成DNA產量偏低。因此需要研製適用於土壤微生物DNA提取的方便、快捷、實用的方法，解決使用常 規方法所獲得的DNA樣品存在腐殖質等PCR抑制物以及細胞裂解率低、DNA產量低的問題。此外，有效的提取土壤微生物的總RNA，能夠為分析不同環境條件下土壤微生物的 基因表達模式提供重要保證，從而豐富宏基因組學的研究內容。然而，在提取土壤RNA的過 程中，除了與提取土壤DNA存在相同的困難外，無處不在的RNA酶對RNA的穩定存在構成極 大威脅，這也是目前國際國內市場中土壤RNA提取產品不多的原因。據此，開發一種高效 提取土壤基因組DNA和RNA的方法，對於大規模開展土壤宏基因組學研究顯得十分必要。
發明內容
本發明提供一種有效提取作物根際土壤微生物基因組DNA和總RNA的方法，利用該方 法提取的核酸純度較高，且產量較高。本發明的一種土壤微生物基因組DNA和總RNA的提取方法，包括土壤樣品雜質的 去除，土壤微生物細胞裂解、核酸游離及沉澱，其特徵在於具體步驟如下
(1)土壤樣品雜質的去除稱取0. 2 1. Og的新鮮作物根際土壤樣品於2ml的無菌離 心管中，加入 40 200 μ 1 IM Tris-HCl (ρΗ=5. 5)、\ μ 1 無菌雙蒸水(V1=QOO μ I-V2)和 V2 μ 1 0. 2Μ Al2(SO4)3水溶液，其中V2=60 300 μ 1 (由於不同地域或不同種植材料根際土壤 腐殖質等雜質的含量不同，可用梯度％=60，90, 120, 150, 180, 210, 240, 270, 300對供試土壤進行試提)，渦旋震蕩30s ；然後加入1/3 V2體積4M NaOH溶液，以及V3體積0. IM Tris-HCl (pH=8) (Vs=1300- 4/3 V2- V1)，渦旋震蕩 30s，用 4M NaOH 溶液調節土壤溶液的 pH值> 8，3500rpm離心2min，用移液槍移去上清並計算上清體積V4。
(2 ) 土壤微生物細胞裂解在步驟(1)離心得到的沉澱中加入V5體積的0. IM Tris-HCl (pH 8) (V5= V4-650 μ 1)，再加入 0. 5 0. 8g 0. 5mm 玻璃珠，0. 3 0. 5g 0. Imm 玻璃珠和1 2個4mm玻璃珠，然後再加入325 μ 1 10%SDS水溶液(pH=8) ,325 μ 1 EB溶液 (ρΗ=8)，渦旋震蕩30s、冰浴lmin，然後再渦旋震蕩lmin、冰浴5min，再次渦旋震蕩lmin，然 後4°C IlOOOrpm離心lmin，取上清備用。其中EB (pH=8)溶液配製為稱取 2. 416g LiCl、1.211g Tris、3. 506g EDTA，加入 雙蒸水溶解並用4M NaOH溶液調節pH=8. 0，定容至100ml。(3)核酸游離及沉澱取600 800 μ 1步驟(2)得到的上清至1. 5ml無菌離心管， 加入與上清等體積的酚氯仿異戊醇(體積比=25:24:1)，渦旋震蕩，冰浴5min，期間每分 鍾震蕩1次，最後4°C 16000rpm離心15min。將離心後的上清轉移至1. 5ml離心管(離心 管用0. P/oDEPC水浸泡後高壓滅菌)，加入與上清等體積的氯仿異戊醇(體積比=24:1)， 渦旋震蕩，4°C 16000rpm離心15min，取上清。將上清轉移至新的1. 5ml離心管(0. 1%DEPC 水浸泡後高壓滅菌)，加入與上清等體積的氯仿異戊醇(體積比=24:1)，渦旋震蕩，4°C 16000rpm離心15min，取上清。將上清轉移至另一個1. 5ml離心管(0. 1%DEPC水浸泡後 高壓滅菌)，加入0. 7倍上清體積的異丙醇、0. 1倍上清體積3M醋酸鈉(pH=5. 5)，4°C靜置 3h或-20°C沉澱lOmin，然後4°C 18000rpm離心60min。去除上清，沉澱用5ml 75%乙醇 (0. 1%DEPC水配製)洗滌兩次，洗滌條件4°C，18000rpm離心5min。去除上清，沉澱於無菌 操作臺中吹乾並用30 μ 1 0. 1%DEPC水溶解，得到含有DNA和總RNA的溶液，_80°C保存。所述土壤微生物基因組DNA和總RNA的提取方法，優選的步驟如下
(1)土壤樣品雜質的去除稱取0.5g的新鮮作物根際土壤樣品於2ml的無菌離心管中， 加入 100 μ 1 IM ρΗ=5. 5 的 Tris-HCl、V1 μ 1 無菌雙蒸水和 V2 μ 1 0. 2Μ Al2 (SO4) 3 水溶液， 其中V1=QOO μ 1-V2、V2=60 300 μ 1，渦旋震蕩30s ；然後加入1/3 V2體積4M NaOH溶液，以 及 V3 體積 0. IM pH=8 的 Tris-HCl，其中 Vs=1300- 4/3 V2- V1，渦旋震蕩 30s，用 4M NaOH 溶 液調節土壤溶液的PH值> 8，3500rpm離心2min，用移液槍移去上清並計算上清體積V4 ；
(2)土壤微生物細胞裂解在步驟(1)離心得到的沉澱中加入V5體積的0. IM pH=8的 Tris-HCl，其中 V5= V4_650 μ 1，再加入 0. 5g 0. 5mm 玻璃珠，0. 3g 0. Imm 玻璃珠和 1 個 4mm 玻璃珠，然後再加入325 μ 1 10% ρΗ=8的SDS水溶液、325μ 1 ρΗ=8的EB溶液，渦旋震蕩 30s、冰浴lmin，然後再渦旋震蕩lmin、冰浴5min，再次渦旋震蕩lmin，然後4°C IlOOOrpm 離心lmin，取上清備用；
EB溶液的配製為稱取2. 416g LiCl、1.211g Tris、3. 506g EDTA，加入雙蒸水溶解並用 4M NaOH溶液調節pH=8. 0,定容至IOOml。(3)核酸游離及沉澱取750 μ 1步驟(2)得到的上清至1.5ml無菌離心管，力口 入與上清等體積的酚、氯仿和異戊醇混合液，其中酚氯仿異戊醇體積比=25:24:1，渦旋 震蕩，冰浴5min，期間每分鐘震蕩1次，最後4°C 16000rpm離心15min ；將離心後的上清 轉移至1. 5ml離心管，加入與上清等體積的氯仿和異戊醇混合液，其中氯仿異戊醇體積 比=24:1，渦旋震蕩，4°C 16000rpm離心15min，取上清；將上清轉移至新的1. 5ml離心管，加入與上清等體積的氯仿和異戊醇混合液，其中氯仿異戊醇體積比=24:1，渦旋震蕩，40C 16000rpm離心15min，取上清；將上清轉移至另一個1. 5ml離心管，加入0. 7倍上清 體積的異丙醇和0. 1倍上清體積3M pH=5. 5的醋酸鈉，4°C靜置3h或_20°C沉澱lOmin， 然後4°C 18000rpm離心60min ；去除上清，沉澱用5ml 75%乙醇(用0. 1%DEPC水配製)在 4°C溫度下洗滌兩次，然後ISOOOrpm離心5min ；去除上清，沉澱於無菌操作臺中吹乾並用 30 μ 1 0. 1%DEPC水溶解，得到含有DNA和總RNA的溶液，_80°C保存。上述1. 5ml離心管先 用0. 1%DEPC水浸泡後高壓滅菌。本發明的提取方法先將土壤樣品用硫酸鋁去除腐殖質等嚴重幹擾核酸提取的雜 質，進一步用玻璃珠破碎土壤微生物細胞，再加入SDS及LiCl溶液裂解細胞、游離核酸，力口 入酚、氯仿和異戊醇混合物萃取後，萃取液用異丙醇及醋酸鈉沉澱，最終獲得土壤微生物宏 基因組DNA和總RNA。所得的核酸的純度可達1. 724，濃度達12. 2 μ g/ μ 1。對提取的DNA 和RNA分別進行純化後，對純化的DNA進行16srDNA的擴增，對純化的總RNA進行逆轉錄 以及16srRNA的半定量PCR和螢光定量PCR分析，結果見圖1，證實本發明的方法提取土壤 DNA和總RNA的有效性。反覆試驗證明，此法提取的土壤基因組DNA和RNA，完整性好，純度 較高，進一步純化後可用於下遊的基因組文庫構建、RT-PCR、northern-blot等。本發明的顯著優點
1.適合於不同地區、不同來源的土壤，具有廣普適用性。2.所得的DNA和RNA完整性好、純度較高。3.提取便捷、無需複雜的處理工藝，提取的條件不嚴格。
圖1為根際土壤DNA與RNA分離的圖譜；
圖2為甘蔗土壤用不同V2體積Al2(SO4)3的提取結果；其中泳道1，2，3，4，5，6，7分別 表示 120、150、180、210、240、270 和 300 μ 1 ；
圖3為不同作物根際土壤DNA與RNA提取的電泳檢測結果；實線框所包括的部分為 DNA ；虛線框的為RNA ；其中A 菸草，B 太子參，C 甘蔗，D 水稻，E 地黃。
具體實施例實施例1
本發明的土壤微生物基因組DNA和總RNA的提取方法，具體步驟如下
(1)原料新鮮甘蔗根際土壤，來自福建福州(福建農林大學教學農場)；
(2)土壤樣品雜質的去除稱取0. 5g的新鮮甘蔗根際土壤樣品於2ml的無菌離心管 中，加入 100 μ 1 IM Tris-HCl (ρΗ=5. 5)、\ μ 1 無菌雙蒸水(V1=QOO μ I-V2)和 V2 μ 1 0. 2Μ Al2(SO4)JjC溶液(V2 梯度取 60，90, 120, 150, 180, 210, 240, 270, 300μ1，對供試 土壤分別試提)，渦旋震蕩30s ；然後加入1/3 V2體積4M NaOH溶液，以及V3體積0. IM Tris-HCl (pH=8) (Vs=1300- 4/3 V2- V1)，渦旋震蕩 30s，用 4M NaOH 溶液調節土壤溶液的 pH值=8，3500rpm離心2min，用移液槍移去上清並計算上清體積V4。(3 ) 土壤微生物細胞裂解在步驟(1)離心得到的沉澱中加入V5體積的0. IM Tris-HCl (pH 8) (V5= V4-650 μ 1)，再加入 0. 5g 0. 5mm 玻璃珠，0. 3g 0. Imm 玻璃珠和 1 個4mm玻璃珠，然後再加入325 μ 1 10%SDS水溶液(pH=8) >325 μ 1 EB溶液(ρΗ=8)，渦旋震蕩 30s、冰浴lmin，然後再渦旋震蕩lmin、冰浴5min，再次渦旋震蕩lmin，然後4°C IlOOOrpm 離心lmin，取上清備用。其中EB (pH=8)溶液配製為稱取 2. 416g LiCl、1.211g Tris、3. 506g EDTA，加入 雙蒸水溶解並用4M NaOH溶液調節pH=8. 0，定容至100ml。
(3)核酸游離及沉澱取750 μ 1步驟(2)得到的上清至1. 5ml無菌離心管，加入 750μ 1酚氯仿異戊醇(體積比=25:24:1)，渦旋震蕩，冰浴5min，期間每分鐘震蕩1次，最 後4°C 16000rpm離心15min。將離心後的上清轉移至1. 5ml離心管(離心管用0. 1%DEPC 水浸泡後高壓滅菌)，加入與上清等體積的氯仿異戊醇(體積比=24:1)，渦旋震蕩，4°C 16000rpm離心15min，取上清。將上清轉移至新的1. 5ml離心管(0. 1%DEPC水浸泡後高 壓滅菌)，加入與上清等體積的氯仿異戊醇(體積比=24:1)，渦旋震蕩，4°C 16000rpm離 心15min，取上清。將上清轉移至另一個1. 5ml離心管(0. 1%DEPC水浸泡後高壓滅菌)，加 入0. 7倍上清體積的異丙醇、0. 1倍上清體積3M醋酸鈉(pH=5. 5)，4°C靜置3h或_20°C沉 澱lOmin，然後4°C 18000rpm離心60min。去除上清，沉澱用5ml 75%乙醇(0. 1%DEPC水配 制)洗滌兩次，洗滌條件4°C，ISOOOrpm離心5min。去除上清，沉澱於無菌操作臺中吹乾並 用30 μ 1 0. 1%DEPC水溶解，得到含有DNA和總RNA的溶液，取5 μ 1 0. 1%DEPC水溶解的含 有DNA和RNA的溶液，於1%瓊脂糖凝膠中電泳檢測，檢測結果見圖2，通過比較可見第2泳 道的DNA和RNA的條帶最清晰，條帶亮度最明顯，泳道中的雜質背景淡，說明此加入此體積 Al2(SO4)3的提取效果最佳，即提取新鮮甘蔗根際土壤的最適Al2(SO4)3體積為150μ 1，加入 150 μ 1的Al2 (SO4) 3能夠最大程度地去除土壤中的腐殖質，同時又保證DNA和RNA的損失最 少。實施例2
(1) 土壤樣品雜質的去除
分別稱取0. 5g的新鮮甘蔗(福建福州)、地黃(河南焦作)、太子參(福建柘榮)、菸草 (雲南昆明)、水稻(福建福州)的根際土壤樣品，置於2ml的無菌離心管中，加入100μ1 IM Tris-HCl (ρΗ=5. 5)，加入 V1 μ 1 無菌雙蒸水(V1=^O μ I-V2)，加入 V2 μ 1 0. 2Μ Al2(SO4)3(V2=60 300，由於不同地域或不同種植材料根際土壤腐殖質等雜質的含量不同， 根據實施例1所述步驟驗證各供試土壤的最適Al2 (SO4) 3體積，因此本實例中甘蔗土壤加入 的Al2 (SO4)3的體積為150 μ 1，地黃土壤加入75 μ 1，太子參土壤加入120ul，菸草土壤加入 120ul，水稻土壤加入150ul)，渦旋震蕩30s ；加入1/3 V2體積4M NaOH,加入V3體積0. IM Tris-HCl (pH=8) (Vs=1300- 4/3 V2- V1)，渦旋震蕩30s，調節土壤溶液的pH值到8或以 上，3500 rpm離心2min，用移液槍去除上清並計算上清體積V4 (1050 μ 1)。( 2 ) 土壤微生物細胞裂解
加入 V5 (400 μ 1)體積的 0. IM Tris-HCl (pH=8) (V5= V4-650 μ 1)，加入 0. 5g 0. 5mm 玻璃珠，0. 3g 0. Imm 玻璃珠和 1 個 4mm 玻璃珠，加入 325 μ 1 10%SDS (pH=8)，325 μ 1 EB (ρΗ=8)，渦旋震蕩30s，冰浴lmin，渦旋震蕩lmin，冰浴5min，渦旋震蕩lmin，4°C 11000 rpm 離心lmin。其中EB (pH=8)溶液配製稱取 2. 416g LiCl，1.211g Tris,3. 506g EDTA，加入適 當體積的雙蒸水溶解並調節pH=8. 0，定容至100ml。
(3)核酸游離及沉澱
取750 μ 1上清至1. 5ml離心管，加入750 μ 1酚氯仿異戊醇(體積比=25:24:1)， 渦旋震蕩，冰浴5min，期間每分鐘震蕩1次，4°C 16000 rpm離心15min。將上清轉移至 1. 5ml離心管(0. P/oDEPC浸泡後高壓滅菌)，加入等體積的氯仿異戊醇(體積比=24:1)， 渦旋震蕩，4°C 16000 rpm離心15min。將上清轉移至新的1. 5ml離心管(0. 1%DEPC浸泡 後高壓滅菌)，加入等體積的氯仿異戊醇(體積比=24:1)，渦旋震蕩，4°C 16000 rpm離 心15min。將上清轉移至新的1. 5ml離心管(0. 1%DEPC浸泡後高壓滅菌)，加入0. 7倍體 積的異丙醇，0. 1倍體積3M醋酸鈉(pH=5. 5)，4°C靜置3h，4°C 18000 rpm離心60min。去 除上清，沉澱用5ml 75%乙醇(0. 1%DEPC水配製)洗滌兩次，洗滌條件4°C，18000 rpm離 心5min。去除上清，沉澱於無菌操作臺中吹乾並用30 μ 1 0. 1%DEPC水溶解，取5 μ 1含 有DNA和RNA的水溶液，於1%瓊脂糖凝膠中電泳檢測。電泳結果見圖3，紫外分光光度計 檢測不同土壤樣品的DNA和RNA水溶液的純度及濃度，結果如下甘蔗土壤提取的DNA和 RNA水溶液純度為0D26Q/0D28Q=1. 71，濃度為7. 15 μ g/ μ 1 ；地黃土壤提取的DNA和RNA水 溶液純度為0D26Q/0D28Q=1. 72，濃度為12. 24 μ g/ μ 1 ；菸草土壤提取的DNA和RNA水溶液 純度為0D26Q/0D28Q=1. 69，濃度為9. 95 μ g/ μ 1 ；太子參土壤提取的DNA和RNA水溶液純度 為0D26Q/0D28Q=1. 69，濃度為8. 98 μ g/ μ 1 ；水稻土壤提取的DNA和RNA水溶液純度為OD26tl/ OD280=L 71，濃度為 11. 35 μ g/μ 1。
權利要求
一種土壤微生物基因組DNA和總RNA的提取方法，包括土壤樣品雜質的去除，土壤微生物細胞裂解、核酸游離及沉澱，其特徵在於所述方法具體包括以下步驟(1)土壤樣品雜質的去除稱取0.2～1.0g的新鮮作物根際土壤樣品於2ml的無菌離心管中，加入40～200μl 1M pH=5.5的Tris HCl、V1 μl無菌雙蒸水和V2 μl 0.2M Al2(SO4)3水溶液，其中V1=900μl V2、V2=60～300μl，渦旋震蕩30s；然後加入1/3 V2體積4M NaOH溶液，以及V3體積0.1M pH=8的Tris HCl，其中V3=1300 4/3 V2 V1，渦旋震蕩30s，用4M NaOH溶液調節土壤溶液的pH值≥8，3500rpm離心2min，用移液槍移去上清並計算上清體積V4；(2)土壤微生物細胞裂解在步驟(1)離心得到的沉澱中加入V5體積的0.1M pH=8的Tris HCl ，其中V5= V4 650μl，再加入0.5～0.8g 0.5mm玻璃珠，0.3～0.5g 0.1mm玻璃珠和1～2個4mm玻璃珠，然後再加入325μl 10% pH=8的SDS水溶液、325μl pH=8的EB溶液，渦旋震蕩30s、冰浴1min，然後再渦旋震蕩1min、冰浴5min，再次渦旋震蕩1min，然後4℃ 11000rpm 離心1min，取上清備用；(3)核酸游離及沉澱取600～800μl步驟(2)得到的上清至1.5ml無菌離心管，加入與上清等體積的酚、氯仿和異戊醇混合液，其中酚氯仿異戊醇體積比=25:24:1，渦旋震蕩，冰浴5min，期間每分鐘震蕩1次，最後4℃ 16000rpm離心15min；將離心後的上清轉移至1.5ml離心管，加入與上清等體積的氯仿和異戊醇混合液，其中氯仿異戊醇體積比=24:1，渦旋震蕩，4℃ 16000rpm 離心15min，取上清；將上清轉移至新的1.5ml離心管，加入與上清等體積的氯仿和異戊醇混合液，其中氯仿異戊醇體積比=24:1，渦旋震蕩，4℃ 16000rpm 離心15min，取上清；將上清轉移至另一個1.5ml離心管，加入0.7倍上清體積的異丙醇和0.1倍上清體積3M pH=5.5的醋酸鈉，4℃靜置3h或 20℃沉澱10min，然後4℃ 18000rpm 離心60min；去除上清，沉澱用5ml 75%乙醇在4℃溫度下洗滌兩次，然後 18000rpm 離心5min；去除上清，沉澱於無菌操作臺中吹乾並用30μl 0.1%DEPC水溶解，得到含有DNA和總RNA的溶液， 80℃保存。
2.根據權利要求1所述的土壤微生物基因組DNA和總RNA的提取方法，其特徵在於 所述方法具體包括以下步驟(1)土壤樣品雜質的去除稱取0.5g的新鮮作物根際土壤樣品於2ml的無菌離心管中， 加入 100 μ 1 IM ρΗ=5. 5 的 Tris-HCl、V1 μ 1 無菌雙蒸水和 V2 μ 1 0. 2Μ Al2 (SO4) 3 水溶液， 其中V1=QOO μ 1-V2、V2=60 300 μ 1，渦旋震蕩30s ；然後加入1/3 V2體積4M NaOH溶液，以 及 V3 體積 0. IM pH=8 的 Tris-HCl，其中 Vs=1300- 4/3 V2- V1，渦旋震蕩 30s，用 4M NaOH 溶 液調節土壤溶液的PH值> 8，3500rpm離心2min，用移液槍移去上清並計算上清體積V4 ；(2)土壤微生物細胞裂解在步驟(1)離心得到的沉澱中加入V5體積的0. IM pH=8的 Tris-HCl，其中 V5= V4_650 μ 1，再加入 0. 5g 0. 5mm 玻璃珠，0. 3g 0. Imm 玻璃珠和 1 個 4mm 玻璃珠，然後再加入325 μ 1 10% ρΗ=8的SDS水溶液、325μ 1 ρΗ=8的EB溶液，渦旋震蕩 30s、冰浴lmin，然後再渦旋震蕩lmin、冰浴5min，再次渦旋震蕩lmin，然後4°C IlOOOrpm 離心lmin，取上清備用；(3)核酸游離及沉澱取750μ1步驟(2)得到的上清至1. 5ml無菌離心管，加入與上清 等體積的酚、氯仿和異戊醇混合液，其中酚氯仿異戊醇體積比=25:24:1，渦旋震蕩，冰浴 5min，期間每分鐘震蕩1次，最後4°C 16000rpm離心15min ；將離心後的上清轉移至1. 5ml離心管，加入與上清等體積的氯仿和異戊醇混合液，其中氯仿異戊醇體積比=24:1，渦旋 震蕩，4°C 16000rpm離心15min，取上清；將上清轉移至新的1. 5ml離心管，加入與上清等 體積的氯仿和異戊醇混合液，其中氯仿異戊醇體積比=24:1，渦旋震蕩，4°C 16000rpm離 心15min，取上清；將上清轉移至另一個1.5ml離心管，加入0.7倍上清體積的異丙醇和0. 1 倍上清體積3M pH=5. 5的醋酸鈉，4°C靜置3h或_20°C沉澱lOmin，然後4°C 18000rpm離心 60min ；去除上清，沉澱用5ml 75%乙醇在4°C溫度下洗滌兩次，然後18000rpm離心5min ； 去除上清，沉澱於無菌操作臺中吹乾並用30 μ 1 0. 1%DEPC水溶解，得到含有DNA和總RNA 的溶液，-80°C保存。
3.根據權利要求1或2所述的土壤微生物基因組DNA和總RNA的提取方法，其特徵在 於步驟(3)所述1. 5ml離心管先用0. 1%DEPC水浸泡後高壓滅菌。
4.根據權利要求1或2所述的土壤微生物基因組DNA和總RNA的提取方法，其特徵在 於步驟(2)所述EB溶液的配製為稱取2. 416g LiCl、1.211g Tris、3. 506g EDTA，加入雙 蒸水溶解並用4M NaOH溶液調節pH=8. 0，定容至100ml。
5.根據權利要求1或2所述的土壤微生物基因組DNA和總RNA的提取方法，其特徵在 於步驟(3)所述75%乙醇用0. 1%DEPC水配製。
全文摘要
本發明提供一種有效提取作物根際土壤微生物基因組DNA和總RNA的方法，包括將土壤樣品先用硫酸鋁去除腐殖質等嚴重幹擾核酸提取的雜質，進一步用玻璃珠破碎土壤微生物細胞，再加入SDS及LiCl溶液裂解細胞、游離核酸，加入酚、氯仿和異戊醇混合物萃取後，萃取液用異丙醇及醋酸鈉沉澱，最終獲得土壤微生物宏基因組DNA和總RNA。本方法適用於不同地域土壤DNA和總RNA的提取，建立了一種操作流程的簡易，製備樣品純度較高的提取技術，能夠為土壤宏基因組學研究提供重要基礎。
文檔編號C12N15/10GK101974513SQ20101054852
公開日2011年2月16日 申請日期2010年11月18日 優先權日2010年11月18日
發明者餘彥, 方長旬, 林文雄, 林瑞餘, 王清水, 黃力坤 申請人:福建農林大學