用於微生物或其亞單位的載體顆粒，含有該顆粒的藥物組合物，該組合物的製備方法及其...的製作方法

2023-05-29 02:58:51

專利名稱：用於微生物或其亞單位的載體顆粒，含有該顆粒的藥物組合物，該組合物的製備方法及其 ...的製作方法
用於微生物或其亞單位的載體顆粒，含有該顆粒的藥物組 合物，該組合物的製備方法及其在動物治療中的用途本發明涉及用於微生物和/或其亞單位的載體，含有該載體的藥物組合物，該藥物組合物的製備方法及其治療動物與微生物有關的疾病的用途。為了保護動物(包括人)使其不受疾病，特別是可傳播的傳染病的侵害，通常的做 法是給予含有一種或多種與該疾病相關的微生物(即，微米或亞微米大小的生命形式，包 括細菌和病毒)和/或其亞單位(通常稱為「抗原」)的藥物組合物，例如，疫苗，以使得動 物能夠並有效地產生防禦性應答，例如，當遇到野生型微生物感染時。為此，當將微生物用 於該組合物中時，通常給予活的但無毒形式(通常稱為「活的減毒的」)或滅活形式(「殺滅 的」)的微生物。還常用的是微生物的亞單位，即，構成抗原決定簇的微生物的一部分，能夠 在動物中誘導針對微生物自身的免疫應答。例如，常用的細菌亞單位是外膜蛋白的一部分。 在使用殺滅的微生物和/或亞單位的情況下，通常加入刺激目標動物免疫應答的成分。通 常用術語「佐劑」來表示這樣的免疫應答刺激成分。不同類型的佐劑是已知的。這些中的 許多是基於礦物油作為免疫刺激劑。常常用水配製這些油，以形成乳液。根據相是不連續 相或連續相，可以分成幾種類型的乳液，例如，W/0(水滴分散於油中)、o/w(油滴分散於水 中)或W/0/W乳液(水滴分散於油滴中，再分散於水中)等。佐劑製劑可以用作在藥物組 合物中攜帶微生物和/或其亞單位的載體工具。重要的是載體在貯藏過程中提供穩定性， 不僅是對於微生物或亞單位自身的穩定性，而且是對於藥物組合物的物理構造。此外，載體 應當使得易於給藥，例如當注射是優選途徑時，應當具有低粘度。再者，重要的是載體使得 藥物組合物易於配製，例如，使得製造過程中攝取最小量的能量。這可能是重要的，因為能 量攝取通常導致(至少局部)溫度升高，這常常導致微生物和亞單位不可逆轉的變化，這隨 後又導致在所治療動物中誘導適當免疫應答能力的喪失。從EP 1 179 349已知，用於微生物和/或其亞單位的載體工具在貯藏過程中提供 了穩定性，使其易於通過注射給藥(由於其低粘度)和易於配製。已知的載體工具包括在 基於液體脂肪或蠟的連續油相中的分散水相。油相包括二氧化矽顆粒，其在該相中提供了 觸變效應。當機械上不連接時，這使得油相的行為像高粘性的相，這給乳液提供了非常好的 機械穩定性，因為油滴凝固的趨勢得到了高度降低。當搖動時，粘度下降，使得乳液可以通 過注射給藥。此外，當攪拌含有二氧化矽顆粒的油相時，粘度非常低。因此，觸變油相使得 容易配製，而沒有太多的能量攝取。然而，已知的載體具有一些重要的缺陷。首先，二氧化 矽常常與毒性、損傷和膿腫有關。因此，應用於藥物組合物的載體中不是優選的。此外，固 體顆粒在接受者體內積存也是非常不合適的。對於人的應用，一般認為風險太高，對於應用 於種畜，積聚可能形成不適用於人食用的部位。其次，當油相不再受到機械攪動時，油相的 觸變特性提供幾乎立刻再生的高粘度。這對於通過注射的給藥是不現實的就在實際注射 之前那一刻必須將裝滿的注射器充分搖晃，否則對於順暢的注射過程而言，粘度將太高。這 種「注射前充分搖晃注射器」不是醫生或獸醫所習慣的。本發明的目的是克服或至少減輕現有載體工具的缺陷，並且同時儘可能多地保持 該載體工具的優點。為此，設計了一種載體顆粒，該顆粒包括含有微生物和/或其亞單位的親水相，親水相分散於在室溫為固體的疏水連續相中，其中疏水相在超過室溫的溫度下連 續經歷固體-至-液體轉化，該轉化包括一級相變。在根據本發明的顆粒中，將微生物和 /或亞單位包含於親水相中(在此意義上的親水性意指具有對水的親和性，使得與水混合 時，可以形成均勻的一相混合物)，其分散於連續的疏水相中(疏水是與親水相對的)，該疏 水相在室溫下(即，25°C)是固體。疏水相在室溫下是固體的事實在高達至少室溫下提供非 常好的物理穩定性。本發明的一個非常重要的方面是疏水相在超過室溫的溫度下連續經歷 固體-至-液體轉化，該轉化包括一級相變。如通常所知的，一級相變是不連續的轉變，即， 涉及熵在轉變點不連續變化的轉變(參見，P. Ehrenfest. Proc. Acad. Sci. Ams terdam. 36， 153，1933)。這對應於正經歷轉變的化合物的特性的突然變化。這種類型轉變的實例是冰 熔化成水。隨著冰熔化，H2O分子中的「級」發生了變化，這給高於和低於轉變點的底物提供 了完全不同的特性。在本發明中，因為固體-至_液體轉化包括一級相變，在高於轉化點下 可以提供非常突然的粘度下降。只要將溫度保持在高於發生轉變的溫度下，可以保持低粘 度。這使得就在高於發生一級相變的溫度下，可以容易地配製乳液。在高於室溫的二級或 高級轉變的情況下(或更精確連續轉變)，相的粘度僅僅將逐漸下降，這意味著相對高的 能量攝取是尋常的結果(因為相溫熱至相對高的溫度，或因為粘度相對高)。注意到在本發 明意義上的術語「固體」意指「自_支撐」(self-bearing)，S卩，將「固體」組合物按本義理解 時，其具有足夠的內部強度，以在宏觀上保持其形狀，與其物理環境無關(例如，將其放入 其中的容器形狀)。在本發明意義上的「液體」意指將「液體」組合物按本義理解時，其不具 有足夠的內部強度來保持其形狀，形狀馬上由其物理環境來決定(例如，將其放入其中的 容器形狀)。例如，在本專利申請的意義下，橡膠彈力球(儘管是可變形的)， 玻璃片(儘管 是無定形的並因此是粘性的)和一些稠化液(例如，混凝土，儘管含有流體)可以認為是固 體的，而如糖漿、防曬霜和煎餅麵糊(儘管它們可以經受一些剪切力)這樣的組合物可以認 為是液體的。特別值得注意的是「固體」不必定表示固體組合物中的每種化合物都必須是 固體結構。例如，在固體凝膠的情況下，甚至可以是賦予組合物自支撐特性的分子的網絡僅 構成組合物的10%的實際質量，而網絡的孔隙由液體充滿(因此，構成組合物的90% )。在一個實施方案中，一級相變對應於疏水相中所含的結晶化合物的熔化過程，結 晶化合物即該化合物在凝固時可以形成在每個維度具有均勻結構的構(但不必定每個維 度都相同)。清楚的是這樣的化合物非常適於應用於根據本發明的載體顆粒中，因為已知其 在低於結晶溫度下的固有穩定性並且在高於熔化溫度下非常快速地變成較低級的構造。在進一步的實施方案中，化合物是可代謝的化合物，特別是脂肪酸酯。可代謝的化 合物，例如，天然蠟，如椰子油(Μ. p. 士26°C )，棕櫚油(Μ. p. 士35°C )和羊脂(Μ. p. 士42°C )， 具有可以通過代謝來改變的特性，特別是目標動物的代謝。這減輕或甚至完全解決了例如 將礦物油用於載體工具中時常見的累積問題。在此意義上的蠟定義為在室溫下為固體的物 質，在固化時通常形成結晶，用手搓揉時散落，並具有低於75°C的熔點。在另一個實施方案中，親水相包括水和其他的化合物。水是最常用於抗原的載體， 並且實際上，作為藥物組合物中的組分是非常合適的。在該實施方案中，緊接著水存在第二 種化合物。已經看到這可以導致微生物或亞單位本身穩定性的提高。在進一步的實施方案 中，其他化合物是多元醇，優選甘油。在另一個實施方案中，疏水相含有第二個微生物和/或其亞單位，這第二個微生物和/或其亞單位可以與第一個微生物和/或其亞單位相同或不同。該實施方案使得顆粒可以裝載更多的抗原，因為更大的顆粒部分可以實際地用於攜帶微生物和/或其亞單位。 此外，可以將接觸時發生反應的微生物或亞單位置於兩個分開的相中來保持分開，這在經 受住內含物的交換方面是優越的(本發明的載體顆粒就是這種情況)，例如當給予動物時 會導致不太合適的免疫應答。此外，通過將抗原置於兩個分開的相中，可以提供抗原釋放的 時間差。例如，這使得一次使用的藥物製劑的配製在給藥時模擬初次/加強給藥的效果。本發明還涉及用於治療動物的藥物組合物，其包含根據本發明的載體顆粒。在這 種情況下治療動物還包括未出生動物，如雞胚的治療。顆粒可以按原樣使用，例如，以熔化 液滴形式給予動物，但在藥物組合物包含連續的親水相的實施方案中，其中分散了如上所 述的載體顆粒。通過作為實質性部分的第二個親水相的粘度來決定該組合物的粘度，例如， 該親水相可以為水，任選地與一種或多種其他流體結合，並任選地包括溶解和/或分散的 材料，給予親水相以藥物學上可接受的滲透壓，特別是不會引起待治療動物肉眼可見的組 織損傷。通過作為實質性部分的第二個親水相的粘度來決定該組合物的粘度的事實是優於 現有技術的藥物組合物的重要改進，現有技術的藥物組合物主要是通過系統的機械攪動來 決定粘度。應當注意在本發明意義上的「治療」包括針對疾病或與該疾病相關症狀的預防、 診斷、治癒和提供緩解而採取的行動。除了上述的組分之外，藥物組合物(在兩個或三個分 開相的一個或多個中)可以包含所有種類的助劑，如乳化劑、穩定劑、抗氧化劑、佐劑(如鋁 鹽、免疫刺激複合物、皂甙、脂多糖衍生物、分枝桿菌等)、用於診斷目的的可追蹤化合物、用 於緩衝或其他目的的鹽等。注意到從EP 1097721已知具有良好貯藏穩定性的藥物組合物，該組合物包含作 為載體的W/0/W乳液，其中疏水相(「0」)在低於室溫的溫度下是固體。然而，在室溫下， 該已知組合物的疏水相是液體(實際上，在所有示例性的組合物中，甚至在低如o°c的溫度 下，疏水相也是液體)。緊接著，在高於室溫下，疏水相沒有經歷一級相變，迫使(以使得可 以配製W/0乳液，而不需要太多的機械作用力)將疏水相加熱至相對高的溫度，超過該疏水 相主要組分的熔化溫度53°c至125°C。因此，該組合物比從EP 1179349中已知的組合物離 本發明的組合物更遠。在一個實施方案中，建立疏水相，使得一級相變在相對於動物體溫的預定溫度下 發生。該實施方案具有非常重要的優勢可以高度控制微生物和/或亞單位的釋放。申請人 即認識到釋放取決於在目標動物體內發生一級相變的時刻或速度，或甚至不管一級相變是 否在所有目標動物體內發生。隨後，這實質上將取決於給藥後載體顆粒所在部位(例如，當 將藥物組合物肌內給藥時在肌肉中，當口服給藥時在胃腸道中，當血管內給藥時在血液中) 的體溫。申請人結合了這些見解並將其作為設計該實施方案的基礎，其中一級相變發生的 溫度不是相對於目標動物體溫的結果，而實際上是通過離動物體溫(即，給藥藥物組合物 後載體顆粒所處部位的溫度)一定程度或與動物體溫相同的期望來決定。在一個實施方案中，一級相變在低於動物體溫的溫度下發生。在該實施方案中，抗 原的釋放可以相對快，因為已知組合物將容易溫熱達到體溫的事實，在給予動物後，疏水相 將幾乎立即變成液體，或至少非常快。在固體-至-液體轉變後，如果所得到的W/0型乳液 是不穩定的，抗原幾乎將立即釋放。乳液越穩定，所有抗原物質釋放至動物體內所花費的時 間越長。在一些情況下，當乳液穩定性優良時，釋放可以進行例如總地長達三個月。
在另一個實施方案中，一級相變在動物體溫下發生。該意義下的「在體溫下」意指 與給予藥物組合物後載體顆粒所處部位的動物體溫相差不超過1度。這使得可以提供緩 慢、持久的釋放(其持續時間，例如，取決於一級相變發生後所獲乳液的穩定性)，例如，在 動物體內形成了與使用所謂的初次-加強疫苗接種所獲得應答相當的免疫應答。在另一個實施方案中，一級相變在高於動物體溫的溫度下發生。這使得可以提供 非常慢或甚至延遲的釋放。例如，可以選擇一級相變發生的溫度只在動物發燒時動物體內 才能達到。在實際轉變發生之前，例如，可以通過抗原在固體疏水相中的擴散來釋放。這樣 的擴散，特別取決於抗原的類型和疏水相的類型，可以完全禁止或非常慢，具有中等速度或 相對快。當疏水相由動物代謝時，對於該實施方案中的釋放可以提供可替換的途徑。這意味 著在載體顆粒中形成用於釋放的途徑。例如，當釋放總地應當超過3個月時，或應當延遲， 例如，直至動物產生高燒或經歷另一個誘導(局部)體溫升高的過程時，可以使用這些實施 方案。 本發明述涉及用於製備藥物組合物的方法，其包括在第一個親水相中混合微生物 和/或其亞單位，在高於固體-至-液體轉化發生溫度的溫度下，將所得到的混合物在能夠 在高於室溫下經歷固體-至-液體轉化的疏水相中乳化，得到親水相液滴在連續疏水相中 的單一乳液(即，其中一個相分散於另一相中的乳液)，在高於固體-至-液體轉化發生溫 度的溫度下，將所得到的單一乳液與第二個親水相混合，得到雙重乳液(即，其中一個相分 散於另一個相中，其依次又分散於再一個相中的乳液)，其中第二個親水相變成藥物組合物 的連續相，並將雙重乳液冷卻至低於固體-至-液體轉化發生溫度的溫度。在該製備方法的一個實施方案中，第二個親水相包含非含水化合物，優選多元醇， 更優選甘油。申請人發現了這使得可以獲得雙重乳液，其中分散的疏水性液滴小(通常低 於50 μ m)並具有非常窄的顆粒分布，例如，20 μ m± 10 ym(d95,體積平均的)。在一個實施方案中，通過將雙重乳液與含水的流體混合來進行冷卻，該流體具有 低於固體_至_液體轉化發生溫度的溫度。這是一種獲得藥物組合物的非常方便的方法。本發明還涉及如上所述的藥物組合物用於治療動物的與微生物相關的疾病的用 途。應當注意本發明不限於特定類型的微生物或其亞單位。原則上，本發明可以與任 何微生物和/或其亞單位聯合使用。現在將通過參照以下的實施例和附圖來進一步解釋本 發明。實施例1 根據本發明的載體顆粒和藥物組合物的製備方法。實施例2 含有豬胸膜肺炎放線桿菌(Actinobacilluspleuropneumoniae) (APP) 抗原的載體顆粒的用途。實施例3 含有豬環狀病毒抗原的載體顆粒的用途。實施例4 含有禽類病毒和細菌抗原的載體顆粒的用途。實施例5 載體顆粒的疏水相的表徵。圖 1 :Wit印sol E85 的 DSC 圖像。圖2 根據本發明的載體顆粒的照片。實施例1在該實施例中，描述了獲得根據本發明的載體顆粒和藥物組合物的方法。首先，通過將0. 44g Inutec SPl表面活性劑(Orafti,比利時)加入10. 56g緩衝液中製得緩衝液。 使用磁力攪拌棒將所得到的混合物(「混合物1」)攪拌1小時。然後，將混合物1在121°C 下高壓滅菌1小時，沒有攪拌(Varioklav，H+P Labortechnik，德國)。此後，將高壓滅菌器 關閉，打開門並邊攪拌邊使混合物1冷卻至48°C。這花費大約1至2小時。在混合物1的冷卻過程中，通過將7. 83g Witepsol E85(Sasol，德國)加入0.16g Arlacel P135 (Uniqema，荷蘭)中來製得下一個混合物(「混合物2」)，將該混合物加熱至 50°C，此後使用適於油性溶液的濾器(如獲自Pall，Sigma Aldrich和Millipore的濾器) 通過0. 22 μ m過濾將溶液滅菌。將所得到的混合物2在48°C下貯藏直至使用。通過將抗原置於無菌緩衝液中來製備抗原的無菌混合物。緩衝液中抗原的含量取 決於最終疫苗中所需的抗原單位量。將抗原混合物(「混合物3」)在室溫下貯藏直至使用。通過使用溫度約為60°C的水浴將混合物3快速加熱至48°C。加熱過程優選少於 5分鐘。同時，將7. 26g混合物2在48°C下均質，使用均質器(T25B，IKA Labortechnik，德 國)在24. OOOrpm下進行。通過將4. 84g混合物3緩慢加入7. 26g混合物2中來製得下一 個混合物，這應當大約為2分鐘。將所得到的混合物在24. OOOrpm下均質直至混合物(「混 合物4」)的質量是可接受的。質量是通過使用標準光學顯微鏡(Olympus BX50)和預熱至 略高於48°C溫度的物鏡(也稱為樣品板)進行檢測的溫熱產品的質量。當95%的抗原相 液滴小於5 μ m時，混合物的質量是可接受的。將混合物4在48°C下貯藏10分鐘。然後，將混合物1在48 °C下均質，使用均質器(T25B)在24. OOOrpm下進行。將該 混合物1中，在3分鐘的過程中緩慢加入11. OOg混合物4。一符合規格就停止均質。規格 為99%的顆粒小於80μπι(使用之前所述的相同光學顯微鏡進行檢測)。將所獲得的產物 (「混合物5」)在48°C下貯藏較短的時間段(通常少於5分鐘)。該產物是W/0/W乳液，其 中油(疏水性的Witepsol)是液體。混合物5中的油滴密度相對高。為了防止混合物5在 冷卻時油滴的聚集，在緩衝的並連續攪拌的溶液中將混合物冷卻，使得通過液滴的稀釋來 完成變成固體小球的液滴的冷卻。該緩衝液通過混合0. 54g在與用於製備混合物1的相同 緩衝液中的10%甲醛溶液，11. 44g佐劑Microsol Diluvac Forte (「MDF」佐劑，如用於產品 Myco Silencer Once 和 End-FLUence 2 中，Intervet USA)和 66. 65g 與用於構成混合物 1 的相同緩衝液來製得，並使該混合物冷卻至5°C。將該混合物(「混合物6」)在IOOrpm下 攪拌(Euro-STP CV攪拌機，IKA Labortechinik，德國)。向該混合物6中，加入20. OOg混 合物5 (其貯藏在48°C下)。將所得到的藥物組合物保持在低於8°C，裝入小瓶中並儲存在 2-8°C，直至接種。注意到MDF佐劑的替代，可以決定將其省略，並由例如緩衝的無菌水來替 代，或使用任何其他的佐劑，例如，EP382271或EP1613346中所述的一種或多種佐劑。實施例2對於該實驗，使用了來自可購得疫苗Porcillis APP(獲自Intervet，Boxmeer，荷 蘭)的已知抗原，即，ApxI，ApxII，ApxIII和OMP。將這些抗原置於無菌Tris-HCl緩衝液 中(40mM三羧甲基氨基甲燒，用HCl將pH調至7. 5)，以獲得實施例1中所示的混合物3(注 意相同的緩衝液用於獲得混合物1)。該混合物3含有250單位每種抗原/ml。這最終形 成了含有10單位APP抗原/ml的製劑，與可購得產品的25單位/ml相比較。用於測試的動物是6周大的小豬。六頭小豬通過頸部肌內注射接受了 Iml如上所 述獲得的製劑。4周後進行了加強接種。通過在頸部的肌內注射2ml疫苗給六頭也是6和10周大的小豬給予了可購得的Porcillis APP疫苗。對照組的六頭小豬在6和10周大時 給予了 2ml磷酸鹽緩衝鹽水。測試動物的局部反應、直腸溫度、臨床體徵和對抗豬胸膜肺炎 放線桿菌的抗體滴度。給予了 APP疫苗的一些小豬在第一次和第二次接種後，顯示出溫和的臨床體徵， 如顫抖、嘔吐和/或增強的呼吸和偶爾的局部反應。給予了含有根據本發明載體顆粒的制 劑的動物根本沒有顯示出臨床體徵或局部反應，與對照動物的情況相同。直腸溫度與對照 動物相比時，對於含有載體顆粒的製劑，略有提高。在第一次接種後，最大差異為0. 7V，第 二次接種後，最大差異為1. 1°C。這在可接受的水平內，並且等於或低於給予Porcillis APP 時的直腸溫度升高。所獲得的抗體滴度顯示於表1中。將這些滴度相對於使用可購得的產 品PorcillisAPP獲得的滴度進行標準化。 表1.各種抗原的抗體滴度，相對於使用Porcillis APP獲得的滴度標準化。如所看到的，儘管事實是與2ml Porcillis APP疫苗比較時，給予Iml新製劑僅 注射了約20%抗原，但滴度相當或甚至略有提高。實施例3對於該實驗，使用了豬2型環狀病毒。這些抗原是ORF 2編碼的PCV 2蛋白，在本 領域公知的杆狀病毒表達系統中表達，例如W02007/028823中所述的。使用了全細胞裂解 物，在SF-900 II SFM培養基中(獲自Invitrogen，USA)緩衝以獲得實施例1中所示的混 合物3。該混合物含有100. 000 (Elisa)單位抗原/ml (這些單位的2，5E03等於20 μ g 0RF2 編碼的蛋白質)為了獲得最終的製劑，按照根據實施例1的方法，進行了以下改變為了獲 得混合物1，將0. 20gInuteC加入9.80g SF-900 II SFM中(作為緩衝液)；為了獲得混合物 2，使用了 9. 80g Witepsol H185 和 0. 20g Arlacel P135 ；為 了獲得混合物 4，使用了 5. OOg 混合物3和5. OOg混合物2 ；為了獲得混合物5，將10. OOg混合物4加入混合物1中；通過 將 0. 68g PCV 抗原濃縮物(含有 221528U/g)與 16. 72g MDF 和 35. 32g SF-900 II SFM 混 合製得用於獲得混合物6的緩衝液；向該緩衝液中加入6. OOg混合物5，獲得混合物6。這 最終獲得了如下的製劑每ml產品中，在W/0/W雙重乳液的疏水相中含有2500單位PCV抗 原，在連續親水相中含有2500單位PCV抗原。用於測試的動物是2周大的小豬。通過頸部的肌內注射，十頭小豬接受了 2ml根據 實施例1獲得的製劑。通過頸部肌內注射2ml疫苗，給十頭小豬給予了根據W02007/028823 製得的含有5000單位/劑的PCV疫苗。在第一次接種後兩周，那些小豬接受了相同的接種， 作為增強接種。通過頸部肌內注射，給對照組的10頭小豬給予了 2mlSF-900 II SFM。使用 已知的疫苗測試動物的局部反應和抗豬環狀病毒的抗體滴度直至增強接種後8周。
在實驗結束時，接受新製劑的一些小豬(3)，該製劑一些剩餘的是明顯的。儘管沒 有給予增強接種，使用新疫苗接種獲得的抗體滴度的產生與已知疫苗大致相同，儘管所獲 得的滴度水平限於使用已知疫苗所獲水平的最大約80% (基於對數尺度)。然而，這些滴 度足以給小豬提供顯著水平的保護。實施例4對於該實驗，使用了病毒性和細菌性禽類抗原的組合物。這些抗原是疫苗Nobilis IB multi+ND+EDS (第一種病毒疫苗)、Nobilis RTInac (第二種病毒疫苗)和 Nobilis Salenvac T(細菌疫苗)中存在的相同抗原，所有疫苗獲自Intervet，Boxmeer，荷蘭。最終 的製劑，每ml產品，含有與使用可購得疫苗的情況相同量的抗原。為了獲得該製劑，將頭兩 種(小瓶)疫苗的抗原懸浮於8. 56g無菌水中，以獲得混合物3。通過使用0. 96g Inutec SPl和47. 04g無菌水(不是緩衝的)製得混合物1。通過使用24. 50g Witepsol E85和 0. 50g ArlacelP135獲得混合物2。通過使用16. 5g混合物3和16. 50g混合物2獲得混合 物4。通過各自使用33. Og混合物1和3獲得混合物5。通過混合0. 26g Trometamol (獲 自 Merck，德國)、0· 25g 馬來酸(獲自 SigmaAldrich)、0. 90g 氯化鈉(獲自 Merck)、79ml 無 菌水、27. 50g氫氧化鋁凝膠(獲自Brenntag Nordic，瑞典)和存在於NobilisSalenvac T 中的滅活沙門氏菌製得用於獲得混合物6的緩衝液。最終通過使用22. OOg混合物5，加入 該溶液中獲得混合物6。
將該製劑用於接種4周大的小雞。頭一組10隻小雞接種0. 5ml新製劑，接種至左 胸肌中。第二組10隻小雞接受了可購得的疫苗Nobilis IB multi+ND+EDS和Nobilis RT Inac0第三組十隻小雞接受了可購得的產品Nobilis Salenvac T。在接種後4和6周時將 小雞放血並測試所收集血清對抗抗原的抗體。將新組合的製劑與現有的產品比較時，顯示 出能獲得對抗IB、RT和沙門氏菌抗原的良好抗體滴度。然而，與使用現有產品獲得的滴度 相比時，對抗EDS和ND抗原的抗體滴度低。實施例5適用於根據本發明的載體顆粒的疏水相中的材料必需在高於室溫的溫度下經歷 固體-至-液體轉化，該轉化包括一級相變。例如，可以通過在差示掃描量熱儀(DSC)(例 如，Perkin Elmer DSC 7)中篩選據稱具有高於室溫的熔點或範圍的材料來找到這樣的材 料，以便查明轉變是否確實包括一級相變。適於檢測該轉變的方法是將樣品接受第一個熱 循環以排除任何熱的歷史事件，例如，以5°C /分鐘的速度將樣品加熱至超過其熔化溫度 IO0C以上的溫度，然後以同樣的速度將樣品冷卻至10°C。然而，使用第二個熱循環來確定材 料是否在室溫以上經歷了一級相變。該加熱循環可以包括以5°C的速度將樣品加熱至超過 其熔化溫度10°C的溫度，然後以相同的速度將樣品冷卻至10°C。已經使用該方法來選擇適 於構成根據本發明的載體顆粒的材料。在

圖1中，顯示了 Witepsol E85的DSC示意圖，該 圖是使用相同的方法獲得的。圖 1圖1顯示了根據實施例5測量的Witepsol E85的DSC示意圖(X-軸給出了以。C計 的溫度；Y-軸給出了以任意單位計的熱流量H)。Wit印sol E85是將該材料從10°C溫熱至 60°C時引起各種轉變的化合物的混合物。已知熔化峰A的不對稱形狀，當Wit印sol化合物 熔化時，發生了兩次一級相變。熔點各自大約為40和47°C。此外，認為在大約35°C下，發生了高級轉變，在該溫度下產生了微小的「凸起」，並且從峰A的左邊往右時，基線升高。總地， 這些轉變顯示為一個開始於大約30°C並結束於大約50°C的寬峰。冷卻該熔化材料時，就在 高於35°C的溫度下開始結晶。情況是測量了兩個截然不同的結晶峰B，一個大約在33°C，而 另一個大約在24°C，這與熔化Wit印sol E85時看到出現兩次一級相變相對應。儘管在本發明的實施例中，使用了 Wit印sol E85和H185來構成根據本發明的載體顆粒，清楚可以使用其他材料，只要它們是疏水性的並且在高於室溫下經歷固 體-至-液體轉化，其中轉化包括一級相變。這樣的材料例如是Wit印sol H5(熔化範圍 大約為34-36°C )，或支鏈醇，如ISOFOL 28 (熔化範圍32_39°C )和ISOFOL 32 (熔化範圍 44-480C )。後兩種材料也可以獲自Sasol (德國)。其他合適的材料例如為氫化油，如氫化 蓖麻油、鯨蠟棕櫚酯、高熔點油醇(高達35°C)、各種甘油三酯和硬化脂肪(如以Novata商 品名獲自 Cognis (MonheimGermany) )、Pharmaline 或 Edenor L2 SM GS 的一部分、植物基硬 脂酸/棕櫚酸(也獲自Cognis)。其他材料例如是在室溫下為液體的油，但該油含有結晶膠 凝劑，該物質在高於室溫下熔化(經歷一級相變)。這使得疏水性材料的主要成分是液體， 但束縛在膠凝劑的膠凝分子網絡的空隙中。這樣的稠化油實際上是(半)固體載體顆粒， 其在膠凝劑熔化時變成液體。優選，用於建立疏水相的一種或多種材料是藥物學上可接受 的，即，在藥物組合物中給予時，它們不會引起顯著的身體問題。更優選地，材料是認可的藥 物賦形劑。在實踐中，特別是對於在哺乳動物中使用，用於一級相變的典型溫度低於60°C。圖 2圖2是根據本發明的載體顆粒的顯微鏡照片。將依據實施例2獲得的顆粒乳液在 39°C的溫度和IOOOrpm下攪拌15分鐘。然後取樣並置於適於光學顯微鏡的透明樣品板上。 添加浸油並用第二塊透明樣品板將樣品覆蓋。然後，在普通光學顯微鏡的傳遞模式下使用 普通光源獲得了圖1中所示的圖像。圖2中最小顆粒的直徑大約為5 μ m。中心的大顆粒具 有約50 μ m的直徑。這些顆粒構成疏水性連續相併具有分散於其中的含有APP抗原的含水 液滴，通常大小為0. 5至5 μ m。
權利要求
包括含有微生物和/或其亞單位的親水相的載體顆粒，所述親水相分散於室溫下為固體的疏水性連續相中，其中建立疏水相以在高於室溫的溫度下經歷固體-至-液體轉化，該轉化包括一級相變。
2.根據權利要求1的載體顆粒，其特徵在於一級相變對應於疏水相中所含晶體化合物 的熔化過程。
3.根據權利要求2的載體顆粒，其特徵在於所述化合物是可代謝的化合物，特別是脂 肪酸酯。
4.根據在前任一項權利要求的載體顆粒，其特徵在於所述親水相包括水和其他化合物。
5.根據權利要求4的載體顆粒，其特徵在於其他化合物為多元醇，優選甘油。
6.根據在前任一項權利要求的載體顆粒，其特徵在於所述疏水相含有第二種微生物和/或其亞單位。
7.用於治療動物的藥物組合物，包含根據權利要求1至6任一項的載體顆粒。
8.根據權利要求7的藥物組合物，包含載體顆粒分散於其中的連續親水相。
9.根據權利要求7或8的藥物組合物，其特徵在於建立疏水相，使得一級相變在相對於 動物體溫的預定溫度下發生。
10.根據權利要求9的藥物組合物，其特徵在於所述一級相變在低於動物體溫的溫度 下發生。
11.根據權利要求9的藥物組合物，其特徵在於所述一級相變在動物的體溫下發生。
12.根據權利要求9的藥物組合物，其特徵在於所述一級相變在高於動物體溫的溫度 下發生。
13.製備藥物組合物的方法，其包括-在第一個親水相中混合微生物和/或其亞單位，-在高於發生固體-至-液體轉化溫度的溫度下，將所得到的混合物在高於室溫下能經 歷固體-至-液體轉化的疏水相中乳化，在連續疏水相中形成親水相液滴的單一乳液，-在高於發生固體-至-液體轉化溫度的溫度下，將所得到的乳液與第二個親水相混 合，得到雙重乳液，其中所述第二個親水相變成藥物組合物的連續相， -將所述雙重乳液冷卻至低於發生固體-至-液體轉化溫度的溫度。
14.根據權利要求13的方法，其特徵在於所述第二個親水相包含非水性化合物，優選 多元醇，更優選甘油。
15.根據權利要求14的方法，其特徵在於通過將所述雙重乳液與含水流體混合來進行 冷卻，該含水流體具有低於發生固體-至-液體轉化溫度的溫度。
16.根據權利要求7至12任一項的藥物組合物用於治療動物與微生物相關疾病的用途。
全文摘要
本發明涉及包括含有微生物和/或其亞單位的親水相的載體顆粒，所述親水相分散於室溫下為固體的疏水性連續相中，其中建立疏水相以在高於室溫的溫度下經歷固體-至-液體轉化，該轉化包括一級相變。本發明還涉及含有所述顆粒的藥物組合物，製備該藥物組合物的方法和該組合物在動物治療中的用途。
文檔編號A61K39/00GK101848707SQ200880114964
公開日2010年9月29日 申請日期2008年11月26日 優先權日2007年11月27日
發明者E·莫姆巴格, R·比曼斯 申請人:英特威國際有限公司