蔓枯病菌侵染西瓜或甜瓜生長速度的檢測方法
2023-05-29 13:24:36 1
專利名稱：蔓枯病菌侵染西瓜或甜瓜生長速度的檢測方法
技術領域：
本發明涉及植物病害抗性鑑定的技術領域，尤其是涉及一種西瓜和甜瓜蔓枯病菌 分生孢子萌發和菌絲生長速度的快速檢測方法。
背景技術：
西瓜和甜瓜植物在全世界範圍內廣泛栽培，以其營養價值高、產值好，備受消費 者和廣大農民的歡迎。西瓜和甜瓜品種很多，而西瓜和甜瓜植物的蔓枯病(stem blight) 是一種危害非常嚴重的病害，育種學家、植物病理學家和農民等都非常關注。蔓枯病無論 在保護地或露地栽培均有發生，其病原無性世代為半知菌亞門，瓜殼二孢真菌(Didymella bry0niae(AuerSW. )Rehn)，有性世代為子囊菌亞門甜瓜球腔菌。病菌以分生孢子器和子囊 殼在病殘體或土壤越冬，翌年以分生孢子進行初次侵染，通過氣流、水、土壤傳播，也可由帶 菌種子傳播。該病在西瓜和甜瓜的幼苗期至採收期均可發生，植株的地上各部均能被侵染， 生育前期易發病，生殖生長盛期達高峰。無論是在冬春日光溫室，還是早春和秋後大棚栽培 均有發生，其危害程度遠高於西瓜和甜瓜枯萎病和疫病，在生產上若不及早防治，植株死亡 率可達30% 40%，造成嚴重減產。目前該病的防治措施主要是種子消毒、無菌苗移栽、水 肥科學管理和藥劑保護等，其中，農業防治效果有限，化學防治又容易產生抗藥性、農藥殘 留和環境汙染，因此，推廣使用西瓜和甜瓜抗性品種是最為經濟有效的辦法。在研究西瓜和 甜瓜抗性的病理學研究中，檢測蔓枯病菌在西瓜和甜瓜的葉片上分生孢子的萌發速度和菌 絲的生長是非常重要的實驗。以往病理學家在研究真菌在植物葉片上侵染時，分生孢子的 萌發速度和菌絲的生長速度，都是採用病菌接種整株植物小苗，然後取整張葉片在Trypan blue染色液中煮沸lmin，水合三氯乙醛內脫色，顯微鏡上觀察孢子萌發率、菌絲生長速度 等。但是這個實驗方法，存在一定的缺陷。整張植物葉片對擬南芥這種小的植物是可以的， 但是對西瓜和甜瓜以及其他蔬菜等葉片比較大的植物，染色和脫色操作難度很大，顯微鏡 觀察取樣隨機性太大，大大妨礙了大葉片的蔬菜上真菌抗性檢測時檢測真菌生長速度的準 確性。本發明把前人的方法加以改進，提出一種適合大葉片的植物檢測病原真菌生長速度 的植物病理學和生理學方法。
發明內容
本發明目的是，針對已有真菌侵染植物葉片時病菌的生長速度的染色方法的操作 不方便、取樣難度大等的不足，提出一種簡便、快速、準確的蔓枯病菌侵染西瓜和甜瓜的生 長速度的檢測方法。本發明的目的是通過以下技術方案予以實現。蔓枯病菌侵染西瓜和甜瓜葉片生長速度的檢測方法，該方法按如下步驟進行 (1)取西瓜或甜瓜的幼苗的第3-5片真葉，並剪成IcmX 5cm的葉條，平展擺放到培 養皿濾紙之上；(2)把西甜瓜蔓枯病菌的孢子懸浮液10 μ L輕輕滴至葉條的一端；(3)用滅 菌的大頭針穿過孢子液滴或者滅菌水滴，刺穿葉片；(4)把步驟(3)的培養皿放置人工氣候箱內，調溫度至25-30°C，培養1-5天，每天添加一次保鮮液l-3mL; (5)讓步驟(4)後的葉 條在trypan blue染色液內煮沸lmin，然後在水合三氯乙醛內脫色至少30min，純水衝洗葉 條上的水合三氯乙醛溶液；(6)觀察刺穿孔周圍細胞死亡情況、孢子萌發和菌絲生長情況。在一些優選的方式中，蔓枯病菌孢子懸浮液的準備將西瓜或者甜瓜蔓枯病菌 (浙江省農業科學院植物與微生物研究所經濟作物病害研究室分離保存)接種在PDA培養 基(馬鈴薯200克煮沸10分鐘，過濾湯汁，棄固體薯塊，取濾液，然後加蔗糖20克，瓊脂17 克，純水定容至1升，滅菌備用)上25°C培養7天，並在40W紫外燈(12h紫外燈/12h黑暗) 下處理4d誘導產孢。用滅菌水洗下孢子，配成5 X IO5個/mL孢子懸浮液，備用。在另外的優選方式中，培養皿準備包括取9cm直徑培養皿，底部鋪設用11.8mg/L 的苯駢咪唑(Benzimidazole)溶液植物保鮮液浸溼的濾紙。在另外一些優選的方式中，trypan blue染色液包括乳酸10mL，甘油10mL，苯酚 10g，臺酚藍 IOmg, 7jC IOmL0保溫和保溼把培養皿放置人工氣候箱內，調溫度至25-30°C。每天添加一次保鮮 液l-3mL為可選項目。葉條培養的時間可以是6-72小時之間，較優選的，培養時間為12-48 小時。
本發明的有益效果一是本發明應用簡便、快速，僅需剪刀、濾紙、一組培養皿和一個人工氣候箱，即可 在室內進行操作。二是本發明技術原理明確，即利用西甜瓜蔓枯病菌主要由植株傷口侵入，且在較 大溼度環境下發病迅速的特點，剪取葉條，限制發病空間，取樣簡單，使接種發病試驗既快 速，又準確可靠。三是試驗表明，應用本發明方法能在室內條件下，4天內即可快速鑑定出蔓枯病菌 在侵染不同的西瓜和甜瓜品種時的生長速度，省時省力，與傳統的蔓枯病菌生長速度的檢 測方法相比，節省時間，操作簡單，極大地提高了工作效率。
圖1本發明方法快速檢測流程示意圖。實驗一蔓枯病菌在西瓜上的生長速度測定為了進一步說明本發明，現給予實驗說明。結合圖1的流程示意圖，採用如下方法 進行。(1)植株苗子準備西瓜浙蜜2號種子消毒、播種，出苗後長至3-5片真葉，備用。(2)蔓枯病菌孢子懸浮液的準備將蔓枯病菌(浙江省農業科學院植物與微生物 研究所經濟作物病害研究室分離保存)接種在PDA培養基(馬鈴薯200克煮沸10分鐘，過 濾湯汁，棄固體薯塊，取濾液，然後加蔗糖20克，瓊脂17克，純水定容至1升，滅菌備用)上 25°C培養7天，並在40W紫外燈(12h紫外燈/12h黑暗)下處理4d誘導產孢。用滅菌水洗 下孢子，配成5 X IO5個/mL孢子懸浮液，備用。(3)培養皿準備取9cm直徑培養皿，底部鋪設用11. 8mg/L的苯駢咪唑 (Benzimidazole)溶液(植物保鮮液)浸溼的濾紙，備用。(4)葉片準備取步驟⑴苗子第3-5片真葉剪成lcmX5cm的葉條，平展擺放到步驟(3)培養皿濾紙之上，備用。(5)孢子接種吸取步驟(2)孢子懸浮液10 μ L輕輕分別滴至步驟(4)培養皿內西瓜葉條的一端。接種滅菌水的葉條為對照。滅菌的大頭針穿過孢子液滴或者滅菌水滴， 刺穿葉條。(6)保溫和保溼把步驟(5)的培養皿放置人工氣候箱內，調溫度至25-30°C，每天添加一次保鮮液l_3mL(ll. 8mg/L的苯駢咪唑(Benzimidazole)溶液)。(7)葉條培養48小時後，每個處理分別取3個葉條，放置到trypan blue染色液(乳酸10mL，甘油10mL，苯酚10g，臺酚藍10mg，水IOmL)內煮沸lmin，然後在水合三氯乙醛 內脫色至少30min，脫色結束後，純水衝洗葉條，去除水合三氯乙醛溶液。(8)脫色後的葉條小心輕放平展至載玻片上，Nikon顯微鏡下IOX 10觀察刺穿孔周圍細胞死亡情況，三個葉條處理，每死亡穿孔測3個直徑，共9個數據取平均值。40 X 10 觀察孢子萌發和菌絲生長情況，每葉條觀察10個視野，共30個視野的分生孢子萌發率及菌 絲伸長度，取平均值。實驗結果接種後48小時取樣，顯微鏡下測微尺測量，穿孔周圍植物細胞死亡平均直徑是 1719 μ m,孢子平均萌發率是92%，菌絲平均伸長290 μ m。實驗二蔓枯病菌在甜瓜上的生長速度測定為了進一步說明本發明，現給予實驗說明。結合圖1的流程示意圖，採用如下方法進行。(1)植株苗子準備甜瓜白沙蜜種子消毒、播種，出苗後長至3-5片真葉，備用。(2)蔓枯病菌孢子懸浮液的準備將蔓枯病菌(浙江省農業科學院植物與微生物 研究所經濟作物病害研究室分離保存)接種在PDA培養基(馬鈴薯200克煮沸10分鐘，過 濾湯汁，棄固體薯塊，取濾液，然後加蔗糖20克，瓊脂17克，純水定容至1升，滅菌備用)上 25°C培養7天，並在40W紫外燈(12h紫外燈/12h黑暗)下處理4d誘導產孢。用滅菌水洗 下孢子，配成5 X IO5個/mL孢子懸浮液，備用。(3)培養皿準備取9cm直徑培養皿，底部鋪設用11. 8mg/L的苯駢咪唑 (Benzimidazole)溶液(植物保鮮液)浸溼的濾紙，備用。(4)葉片準備取步驟(1)苗子第3-5片真葉剪成IcmX5cm的葉條，平展擺放到步驟(3)培養皿濾紙之上，備用。(5)孢子接種吸取步驟(2)孢子懸浮液10 μ L輕輕分別滴至步驟⑷培養皿內甜瓜葉條的一端。接種滅菌水的葉條為對照。滅菌的大頭針穿過孢子液滴或者滅菌水滴， 刺穿葉條。(6)保溫和保溼把步驟(5)的培養皿放置人工氣候箱內，調溫度至25-30°C，每天添加一次保鮮液l_3mL(ll. 8mg/L的苯駢咪唑(Benzimidazole)溶液)。(7)葉條培養24小時後，每個處理分別取3個葉條，放置到trypan blue染色液(乳酸10mL，甘油10mL，苯酚10g，臺酚藍10mg，水IOmL)內煮沸lmin，然後在水合三氯乙醛 內脫色至少30min，脫色結束後，純水衝洗葉條，去除水合三氯乙醛溶液。(8)脫色後的葉條小心輕放平展至載玻片上，Nikon顯微鏡下10X 10觀察刺穿孔周圍細胞死亡情況，三個葉條處理，每死亡穿孔測3個直徑，共9個數據取平均值。40 X 10觀察孢子萌發和菌絲生長情況，每葉條觀察10個視野，共30個視野的分生孢子萌發率及菌 絲伸長度，取平均值。實驗結果接種後24小時取樣，顯微鏡下測微尺測量，穿孔周圍植物細胞死亡平均直徑是856 μ m,孢子平均萌發率是35 %，菌絲平均伸長99 μ m。本文中用來描述方法的術語和表達方式並不是唯一不變的，並且我們沒有任何意 圖使用這些術語和表達方式來排除描述本方法或者特徵的任何相同意義的表達方式，我們 認同在本發明聲明的範圍內的各種不同的表達方式。因此，我們認為儘管在本文中本發明 已經用各種具體方案和任意的特徵描述清楚地展示出來，但是改變本文中揭示的設計的 表達方式還要求助於那些有經驗的專業技術人士，並且這些改變要與本發明附帶的聲明一 致。文章、專利、專利應用和所有其它文檔的內容以及本文中提到的和引證的有用的 電子化信息是結合在一起的，必須作為一個完整的內容來參考，發表其中任何一個部分都 要特別指明這一點。申請者具有將任何和全部的這些文章、專利、專利應用或其它文檔的信 息和材料合併入該申請書作為本專利說明書揭示的一部分的權利。
權利要求
一種蔓枯病菌侵染西瓜或甜瓜生長速度的檢測方法，包括如下步驟(1)取西瓜或甜瓜的幼苗的第3-5片真葉，並剪成1cm×5cm的葉條，平展擺放到培養皿濾紙之上；(2)把西瓜或甜瓜蔓枯病菌的孢子懸浮液10μL輕輕分別滴至西瓜或甜瓜葉條的一端；(3)用滅菌的大頭針穿過孢子液滴，刺穿葉片；(4)把步驟(3)後的培養皿放置人工氣候箱內，調溫度至25-30℃，培養1-5天，每天添加一次保鮮液1-3mL；(5)讓步驟(4)後的葉條在trypanblue染色液內煮沸1min，然後在水合三氯乙醛內脫色至少30min，純水衝洗葉條上的水合三氯乙醛溶液；(6)觀察刺穿孔周圍細胞死亡情況、孢子萌發和菌絲生長情況。
2.如權利要求1所述的方法，其中，所述的蔓枯病菌孢子懸浮液的準備包括將西瓜或 甜瓜蔓枯病菌(浙江省農業科學院植物與微生物研究所經濟作物病害研究室分離保存)接 種在PDA培養基(馬鈴薯200克煮沸10分鐘，過濾湯汁，棄固體薯塊，取濾液，然後加蔗糖 20克，瓊脂17克，純水定容至1升，滅菌備用)上25°C培養7天，然後在40W紫外燈(12h 紫外燈/12h黑暗)下處理4d誘導產孢；最後用滅菌水洗下孢子，配成5 X IO5個/mL孢子 懸浮液。
3.如權利要求1所述的方法，其中，所述培養皿準備包括取9cm直徑培養皿，底部鋪 設用11.8mg/L的苯駢咪唑(Benzimidazole)溶液作為植物保鮮液來浸溼濾紙。
4.如權利要求1所述的方法，其中，所述的trypan blue染色液包括乳酸10mL，甘油 10mL，苯酚 10g，臺酚藍 IOmgjjC IOmL0
5.如權利要求1所述的方法，其中，所述的培養時間為12-48小時。
全文摘要
本發明公開了一種蔓枯病菌侵染不同西瓜和甜瓜品種時生長速度的檢測方法，該方法包括田間採樣、病菌培養、剪葉條、接種病菌、分生孢子萌發和菌絲生長等幾個步驟。該方法只需在人工氣候箱內使用培養皿內濾紙保溼即可接種病菌，顯微鏡下直接觀察染色、脫色後的葉條即可，具有設備要求簡單、應用簡便快速、取樣簡單可靠的特點，適於在病原菌的致病性測定、植物的抗性鑑定等。
文檔編號C12Q1/02GK101798589SQ200910266638
公開日2010年8月11日 申請日期2009年12月31日 優先權日2009年8月13日
發明者任海英, 方麗, 王漢榮, 茹水江 申請人:浙江省農業科學院