一種處理造紙廢水並產微生物油脂的方法及其專用菌株的製作方法
2023-05-29 07:55:36 2
專利名稱：一種處理造紙廢水並產微生物油脂的方法及其專用菌株的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種造紙廢水的處理方法，特別是涉及一種處理造紙廢水並產微生物油脂的方法及其專用菌株。
背景技術：
製漿造紙工業是我國國民經濟的重要基礎原材料產業，但也是產生「三廢」汙染，尤其是水汙染的大戶，其所造成的水汙染，目前仍然比較突出，造紙工業2008年廢水排放量為40. 77億噸，佔全國工業廢水總排放量217. 38億噸的18. 76%。排放廢水中化學需氧量(COD)為128. 8萬噸，佔全國工業COD總排放量404. 8萬噸的31. 82%。
目前，製漿造紙工業廢水處理的方法主要有物理法、生化法、化學法及三者相結合的方法，物理法主要利用廢水中汙染物的密度或粒徑差異來進行分離，實現對廢水中不溶性汙染物的去除；生化法主要是採用微生物種群所形成的生物鏈對廢水中的有機物進行降解，最終轉化為二氧化碳、水、甲烷及微生物細胞等；化學法則是採用絮凝劑或強氧化劑對廢水進行處理，前者通過絮凝作用使廢水中懸浮物或膠體物質發生絮聚而沉澱分離出來，而實現廢水的淨化，後者則是利用氧化劑的強氧化性將廢水中的有機物氧化分解實現淨化。「一種廢紙造紙廢水處理及會用方法」(專利申請號200910098176. 4)、「造紙廢水處理工藝」(專利申請號01128134. O)及「製漿造紙廢水處理系統」(專利申請號200920258322. O)等多個專利公開了造紙廢水的處理方法，但均致力於達標排放。目前，上述廢水處理方法在實際應用中較為普遍，實現達標排放的過程中，都存在著投資和運行費用及對管理水平要求聞等問題。微生物油脂是生物柴油的潛在原料，而生物柴油是解決能源危機的途徑之一。生物柴油的主要原料為油料作物(油菜、花生、向日葵、芝麻、大豆、棉籽、胡麻及玉米等)、木本油料(棕櫚油、黃連木、麻風樹、光皮樹及油茶等)、動物油脂(豬脂、牛脂及羊脂等)、微生物油脂(酵母、黴菌、細菌和藻類等)、廢食用油脂(植物油脂下腳料和廢棄食用油等)。李博公開了以動植物油脂、酸敗了的動植物油脂、回收的各種煎炸油或潲水油為原料生產生物柴油的方法(專利申請號200510200025. 7)。以油料作物油生產的柴油品質好、質量穩定、原料來源充足。但原料成本高，存在「與農爭糧(油)、與糧(油)爭地」的問題。木本油料作物質量穩定、成本低，但主要為熱帶植物，受地域限制，原料難以滿足需要，另外，麻風果榨油後的餅柏含極毒物質，存在安全隱患；廢棄油脂收購困難，且來源不同品質難以控制；動物油脂來源難以滿足需求。微生物油脂則能解決上述問題，與傳統的油脂生產工藝相比較，微生物適應性強，生長繁殖迅速，生長周期短，代謝活力強，易於培養和品種改良；微生物產油脂所需勞動力低，佔地面積小，且不受場地、氣候和季節變化等的限制，能連續大規模生產；清華大學張建安等公開了以1-20%葡萄糖為底物，微生物發酵油脂及其用於製備生物柴油的方法(專利申請號CN200610113582.X)。清華大學劉宏娟等公開了「一種由木質纖維質原料製備微生物油脂的方法」(專利申請號200810114616. 6)，上述專利中是以葡萄糖或木質纖維原料為底物進行發酵製取生物油脂，而且所用的菌種為酵母。
發明內容
本發明針對造紙廢水中含有大量的有機物且需要去除或降解的現狀，及產油菌產油過程需要富含碳源的原料為底物的特徵，提供一種處理造紙廢水並產微生物油脂的方法及其專用菌株。這樣不僅能降解造紙廢水中的汙染物，而且使得微生物油脂的生產成本將大幅降低，產生的微生物油脂可以用作生物柴油的原料，實現廢棄物的高值利用。本發明所提供的可利用造紙廢水中有機物並產油的菌株為紅球菌(Rhodococcussp.) LDS5,該菌株已於2011年4月12日保藏於位於北京市朝陽區北辰西路I號院3號的中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC No. 4762。以紅球菌(Rhodococcus sp. ) LDS5CGMCC No. 4762為活性成分的菌劑也屬於本發明的保護範圍。 紅球菌(Rhodococcus sp. )LDS5CGMCC No. 4762及其菌劑可用於生產甘油三酯，降低廢水中COD及BOD。本發明的第二個目的是提供一種利用造紙廢水生產生物油脂(生產甘油三酯)的方法，包括以下步驟I)將紅球菌(Rhodococcus sp. )LDS5CGMCC No. 4762、或以其為活性成分的菌劑接入造紙廢水中，培養得到所述紅球菌(Rhodococcus sp.) LDS5CGMCC No. 4762菌體；2)從步驟I)得到的所述紅球菌(Rhodococcus sp. ) LDS5CGMCC No. 4762菌體中提取得到甘油三酯。用於接入造紙廢水的紅球菌(Rhodococcus sp. )LDS5CGMCC No. 4762菌種，可在NB培養基中在28-32°C下培養36-40小時獲得。所述NB培養基的配製方法可為0.8%(0. 8g/100ml)Nurient Broth(營養肉湯)的去離子水溶液，高壓滅菌20min。紅球菌(Rhodococcus sp. )LDS5CGMCC No. 4762、或以其為活性成分的菌劑接入造紙廢水後，可在28-32°C下培養36-96小時。步驟2)中，所述甘油三酯可按照常規方法提取。本發明的又一個目的是提供一種處理造紙廢水的方法。本發明所提供的處理造紙廢水的方法，包括如下步驟將造紙廢水作為培養基，將紅球菌(Rhodococcus sp.)LDS5CGMCC No. 4762、或以其為活性成分的菌劑接入造紙廢水中，降低所述造紙廢水的COD和/或BOD。所述造紙廢水可為CTMP (化學熱磨機械漿)製漿廢水，或為APMP (鹼性過氧化氫機械眾)制眾廢水。本發明應用造紙廢水來生產微生物油脂的方法，具有操作簡單、成本低廉和實用價值高的優點，既能有效降低造紙廢水汙染排放問題，又能變廢為寶轉化為生物柴油原料生物油脂，實現了造紙廢棄物的資源化利用。該方法可使造紙廢水的COD和BOD去除率分別達到55%和75%以上。以下結合具體的實例對本發明的技術方案做進一步描述。保藏說明菌種名稱紅球菌拉丁名(Rhodococcussp.)
菌株編號LDS5保藏機構中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏機構簡稱CGMCC地址北京市朝陽區北辰西路I號院3號保藏日期2011年4月12日保藏中心登記入冊編號CGMCC No. 4762菌種名稱紅球菌
拉丁名(Rhodococcussp.)菌株編號RHA1保藏機構中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏機構簡稱CGMCC地址北京市朝陽區北辰西路I號院3號保藏日期2010年12月8日保藏中心登記入冊編號CGMCC No. 442
圖I為本發明所用紅球菌(Rhodococcus sp. ) LDS5的TEM圖。圖2為紅球菌(Rhodococcus sp. )LDS5在不同廢水培養中甘油三酯的產量圖3 為紅球菌(Rhodococcus sp. ) LDS5 和紅球菌(Rhodococcus sp. ) RHAl 在 CTMP廢水中培養時間梯度的甘油三脂含量。
具體實施例方式下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。下述實施例中的NB培養基的配製方法為0.8% (0. 8g/100ml)Nurient Broth(營養肉湯)的去離子水溶液，高壓滅菌20min。紅球菌(Rhodococcussp. ) LDS5CGMCC No. 4762 和紅球菌(Rhodococcus sp. ) RHAl的平板培養基組成為胰蛋白腖10g ;酵母提取物5g，NaCl 10g ;瓊脂15g ; IL去離子水，高壓滅菌20min。將融化的培養基放置至55°C，約IOml倒入一個培養皿，培養基在培養皿中冷卻凝固。MSM培養基組成為0. 5g NH4CLO. 2gMgS04. 7Η20，0· 02g CaCl2 ·2Η20，I. 5g KH2PO4,
0.0012g 檸檬酸銨鐵，0. Iml SL6(1. Og ZnSO4 · 7H20，0. 3g MnCl · 4H20，3. Og H3BO3, 3. OgCoCl2 · 6H20，0. IgCuCl2 · 2H20，0. 2g NiCl2 · 6H20，0. 2g Na2MnO4 · H20,0. 3g Na2MnO4 · H20，去離子水定容至I. 0L) ,9. Og Na2HPO4 · 12H20,9. Og葡萄糖酸鈉,加IL去離子水至I. 0L,高壓滅菌20min。實施例I、紅球菌(Rhodococcus sp. )LDS5的製備及鑑定將紅球菌(Rhodococcus sp. )RHAl (2010年12月8日保藏於中國微生物菌種保藏委員會普通微生物中心(CGMCC)，其地址為中華人民共和國北京市朝陽區北辰西路I號院3號，中國科學院微生物研究所，分類命名為紅球菌Rhodococcus sp.，保藏中心登記入冊編號CGMCC No. 4423)中LDS5基因敲除得到紅球菌(Rhodococcus sp.)LDS5。紅球菌(Rhodococcus sp. )LDS5已於2011年4月12日保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏中心登記入冊編號=CGMCC No. 4762。紅球菌(Rhodococcus sp. ) LDS5CGMCC No. 4762菌體杆狀(圖I)，不形成分生孢子或內孢子。菌落呈淺黃色不透明，溼潤，粘稠，圓形，邊緣整齊。革蘭氏陽性。好氧。化能營養型，過氧化氫酶陽性。芳香基硫酸脂酶陰性，對溶菌酶敏感，可利用許多有機化合物作為碳源。胞壁肽聚糖屬Al Y型，含有大量內消旋二氨基庚二酸、阿拉伯糖和半乳糖。細胞磷酸類脂有雙磷脂醯甘油(DPG)、磷脂醯乙醇胺(PE)和磷脂醯肌醇甘露糖苷(PM)。細胞含大量的直鏈非飽和脂肪酸。菌株的DNA G+C mol%為67mol% (Tm)。實施例2、用紅球菌(Rhodococcus sp. ) LDS5CGMCC No. 4762在造紙廢水中培養生產甘油三酯的方法。I.在不同廢水中培養甘油三酯檢測為了尋找低成本的培養條件，從而有益於大規模的培養。低氮高碳成為尋找低成 本培養的主要條件。製漿造紙廢水中含有大量的有機物，且其中碳源豐富且低氮，運用廢水來培養菌株，如若能夠生長，不但能獲得生物柴油原料的供給，還有可能推動廢水處理業的發展。因此，本實驗選取造紙業中汙染嚴重的製漿廢水CTMP廢水及APMP廢水，並查看細菌產油情況。實驗步驟如下細菌培養將紅球菌(Rhodococcussp. ) LDS5CGMCC No. 4762 在 NB 培養基中28-32°C培養36小時，取30ml培養液離心5000rpm IOmin棄上清。將30ml培養液離心所得沉澱分別轉接入300ml APMP廢水，CTMP廢水及產油最適培養基MSM培養基中。脂萃取分別取不同培養環境，培養24小時後的菌液各500 μ 1，加入氯仿甲醇萃取。菌液氯仿甲醇體積比為I : I : 1，混勻靜置20min。離心14000rpm,4°C, lOmin。抽取離心後的脂相。再將樣品加入500 μ I氯仿，重新萃取，兩次萃取的脂相合併。按照如下方法進行檢測薄層層析將萃取樣品氮氣吹乾，置於室溫，加入100 μ I氯仿溶解脂，震蕩混勻，並室溫離心，IOOOOrpm, I分鐘。用槍頭點樣於薄層板(Whatman, 4865-821)上，點樣基線距底邊2cm,每次點樣量以樣品不外漏為宜(約相當於10μ I)。重複點樣應注意在層析板上樣品晾乾後為宜。點完樣品後，充分晚幹。將點好樣品的薄層板平移放入展開缸的展開劑(由80ml正己烷，20ml無水乙醚和0.8ml乙酸組成)中，浸入展開劑的深度為距原點5mm為宜，用毛玻璃蓋好展開缸，使展開在密閉的環境中進行。可將展開缸邊緣塗抹凡士林，使其與毛玻璃接觸更為緊密。同時需關閉展開缸所在的通風櫥中的通風裝置，儘量減少外界環境對實驗結果的影響，待展開至層析板上緣2cm，取出薄層板，晾乾。將薄層板小心放入碘缸，點樣面面朝碘缸底部，便於蒸發的碘與其充分接觸，碘缸內加入碘的量以鋪滿碘缸邊緣為準，顯色20 30min，即出現褐色斑點。結果如圖2所示，表明相同濃度的紅球菌(Rhodococcus sp. ) LDS5CGMCC No. 4762轉接到三種培養條件下，在APMP和CTMP的廢水培養中，細菌不僅長勢良好，而且其產油量大大增加，遠遠高於在MSM中培養。而在廢水培養條件中，又以CTMP廢水培養條件產油量較好。所以以CTMP廢水作為培養條件，是一種相對來說，成本低，產量高的培養條件。圖2中，從左至右的四個帶分別為APMP廢水、MSM培養基、CTMP廢水和酯標準品(Sigma，1787-1AMP);圖2中箭頭所指是甘油三酯的條帶。2、野生型及敲除菌株在CTMP廢水中甘油三酯的定量檢測細菌培養紅球菌(Rhodococcussp. ) LDS5CGMCC No. 4762 和紅球菌(Rhodococcussp. )RHA1CGMCC No. 4423 單克隆分別接入 IOOml NB培養基 30°C培養至0D600為2. O時，培養時間約為36h，分別取30ml培養液離心5000rpm，IOmin,棄上清，將所得的紅球菌(Rhodococcus sp. ) RHAICGMCC No. 4423 (WT)及紅球菌(Rhodococcussp. ) LDS5CGMCCNo. 4762 (LDS5)沉澱分別轉接入裝有 300ml CTMP 廢水(C0D& 為 10053mg/L，BOD5 為 92IOmg/U 的培養瓶中，在 30°C培養。紅球菌(Rhodococcus sp.) RHA1CGMCC No. 4423 (WT)及紅球菌(Rhodococcus sp.) LDS5CGMCC No. 4762 (LDS5)均分別接入36個培養瓶。分別在接入廢水0、24、48、72、96和120小時各取菌液樣品各Iml離心12000rpm，4°C，3min，棄上清。加 100 μ 11% triton-100將沉澱重懸。將重懸的樣品超聲，每超6s停6s，共2min。將2mM的標準品用1% triton-100稀釋成1，0· 5,0. 2,0. 1,0. 05,0. 02，OmM濃度梯度標準樣品。將所配製好的標準樣品及所製得的樣品分別加入酶標板中10 μ I。取甘油三酯試劑盒(普利萊，Ε1003)，A液B液4 I混勻，分別取190 μ I加入酶標板中，樣品及標準品與混合液充分反應，370C，恆溫孵育20min。在波長565nm下檢測樣品OD值，根據標準品OD值及濃度計算標準曲線，並求出公式y = 0. 3699X+0. 0811 R2 = 0. 9994。根據公式計算出甘油三酯濃度。結果表明，等濃度的紅球菌(Rhodococcus sp.)LDS5CGMCC No. 4762和紅球菌(Rhodococcussp.)RHAlCGMCC No. 4423在CTMP廢水中培養48h後，其甘油三酯含量達到高值。隨後均有不同程度的下降。紅球菌(Rhodococcus sp.) LDS5CGMCCNo. 4762在CTMP廢水中培養48h的甘油三酯含量較高,可達0. 45mM，而紅球菌(Rhodococcus sp.) RHA1CGMCC No. 4423在CTMP廢水中培養48h的甘油三酯含量為0. 39mM，紅球菌(Rhodococcus sp.) LDS5CGMCC No. 4762的甘油三酯產量比紅球菌(Rhodococcus sp.)RHA1CGMCC No. 4423的產量提高了 15%。實施例3、用紅球菌(Rhodococcus sp. ) LDS5CGMCC No. 4762 處理造紙廢水培養濃度梯度及時間梯度的細菌，並對這些細菌進行一些廢水指標的檢測。培養方法如下濃度梯度紅球菌(Rhodococcussp. ) LDS5CGMCC No. 4762 和紅球菌(Rhodococcussp. )RHA1CGMCC No. 4423 單克隆分別接入 300ml NB 培養基 30°C培養 36h。分別取50ml，20ml，IOml培養液5000g，4°C，離心10分鐘，棄上清，將離心下來的菌分別轉接到裝有100ml CTMP廢水(C0D&為10053mg/L，BOD5為9210mg/L)的培養瓶中，即轉接濃度分別為I : 2，1 : 5，1 : 10。同時取同批次CTMP廢水100ml作為對照。30°C，200轉/分鐘震蕩培養48小時後，將液體在4000g，4°C，離心10分鐘，取上清檢測CODcr及BOD5值。時間梯度紅球菌(Rhodococcus sp. )LDS5單克隆入300ml NB培養基30°C培養36h，將培養液5000rpm離心lOmin，棄上清，將菌體轉接入600ml CTMP廢水(C0D&為10350mg/L, BOD5為6975mg/L)中，混勻，平均分裝到6個250ml的錐形瓶中(即轉接濃度為I : 2)。同時取6瓶同樣條件的CTMP廢水各IOOml作為對照。30°C，200轉/分鐘震蕩培養。分別在培養0h，24h，48h，72h，96h，108h各取樣品及對照各一，將液體在4000g，4°C，離心10分鐘，取上清檢測CODcr及BOD5值。根據國標檢測方法測定C0D&(GB 11914-89)和BOD5(GB 7488-87)。根據公式[CODcr去除率=(處理前CODcr值-處理後CODcr值)/處理前CODcr值；B0D5去除率=(處理前BOD5值-處理後BOD5值)/處理前BOD5值]計算C0D&和BOD5去除率。結果表明，在轉接濃度為1/2時，培養48小時後，紅球菌(Rhodococcus sp.)LDS5CGMCC No. 4762C0DCr 去除率(42. 83±4. 19% )明顯高於與紅球菌(Rhodococcussp.)RHAICGMCC No. 4423(27. 93±4· 63 % )。紅球菌(Rhodococcus sp.) LDS5CGMCCNo. 4762的 BOD5 去除率(54. 38 ± 10. 92 % )亦明顯高於紅球菌(Rhodococcus sp.) RHAICGMCCNo. 4423(29. 29±0. 72% )，表明紅球菌(Rhodococcus sp.) LDS5CGMCC No. 4762 處理廢水能力高於野生型菌株紅球菌(Rhodococcus sp.)RHAICGMCC No. 4423。在轉接濃度為1/10時，培養48小時後，紅球菌(Rhodococcus sp.)LDS5CGMCCNo. 4762C0DCr 去除率約為 13. 19±0· 74%, BOD5 去除率約為 25. 3±0· 77%，隨著細菌濃度的增加，廢水處理效果也在顯著增加，在轉接濃度達到1/2時，C0D&去除率達到41. 49±0· 98%, BOD5 去除率達到 44. 00±10. 08%。隨著時間的增加，轉接濃度為1/2時，紅球菌(Rhodococcus sp. ) LDS5CGMCC No. 4762清除廢水C0D&和BOD5的能力在逐步增強。96小時C0D&去除率可達到最強，可達55. 15±5· 89%, BOD5 去除率可達到 75. 66±8· 63%。由此可見，廢水的CODcr及BOD5值是隨著紅球菌(Rhodococcus sp.)LDS5CGMCCNo. 4762 的濃度的增高而降低的。紅球菌(Rhodococcus sp.) LDS5CGMCC No. 4762具備清除CTMP廢水的有害物質的能力，且降低BOD5的能力較高。
權利要求
1.紅球菌(Rhodococcussp. ) LDS5,其在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心的登記入冊編號為CGMCC No. 4762。
2.一種菌劑，其特徵在於所述菌劑的活性成分為權利要求I所述的紅球菌(Rhodococcus sp.)LDS5 ;所述菌劑為生產甘油三酯的菌劑，或為降低廢水中COD的菌劑，或為降低廢水中BOD的菌劑。
3.權利要求I所述的紅球菌(Rhodococcussp.) LDS5、或權利要求2所述的菌劑在生產甘油三酯中的應用。
4.權利要求I所述的紅球菌(Rhodococcussp.) LDS5、或權利要求2所述的菌劑在處理汙水的應用。
5.根據權利要求4所述的應用，其特徵在於所述處理汙水體現為降低汙水中C0D。
6.根據權利要求4所述的應用，其特徵在於所述處理汙水體現為降低汙水中B0D。
7.根據權利要求4-6中任一所述的應用，其特徵在於所述汙水為造紙廢水。
8.一種處理造紙廢水的方法，包括如下步驟將造紙廢水作為培養基，將權利要求I所述的紅球菌(Rhodococcus sp.) LDS5、或權利要求2所述的菌劑接入造紙廢水中，降低所述造紙廢水的COD和/或BOD。
9.一種生產甘油三酯的方法，包括以下步驟 1)將權利要求I所述的紅球菌(Rhodococcussp. )LDS5、或權利要求2所述的菌劑接入造紙廢水中，培養得到所述紅球菌(Rhodococcus sp. )LDS5菌體； 2)從步驟I)得到的所述紅球菌(Rhodococcussp.)LDS5菌體中提取得到甘油三酯。
10.根據權利要求8或9所述的方法，其特徵在於所述造紙廢水為CTMP製漿廢水，或為APMP製漿廢水。
全文摘要
本發明公開了一種處理造紙廢水並產生物油脂的方法及其專用菌株紅球菌(Rhodococcus sp.)LDS5。該方法是一種紅球菌利用造紙廢水為培養基生產生物油脂的方法，同時造紙廢水中的有機物得到降解。該方法包括以下步驟將紅球菌(Rhodococcus sp.)LDS5、或以其為活性成分的菌劑接入造紙廢水中，培養得到紅球菌(Rhodococcus sp.)LDS5菌體；從菌體中提取得到甘油三酯。該方法可使造紙廢水的COD和BOD去除率分別達到55％和75％以上。本發明微生物油脂的生產方法具有操作簡單、成本低廉和實用價值高的優點，既能有效降低造紙廢水汙染排放問題，又能變廢為寶轉化為生物柴油原料生物油脂，實現了造紙廢棄物的資源化利用。
文檔編號C02F3/34GK102787082SQ201110127390
公開日2012年11月21日 申請日期2011年5月17日 優先權日2011年5月17日
發明者丁雲峰, 馮文英, 劉平生, 張淑妍, 徐 明, 曹春昱, 杜雅蘭, 蘇振華 申請人:中國製漿造紙研究院, 中國科學院生物物理研究所