分離核酸的方法

2023-05-29 02:19:11

專利名稱：分離核酸的方法
技術領域：
本發明涉及核酸的純化。特別地，本發明涉及將存在於含水吸附液中的核酸吸附到固體基材上的方法。
背景技術：
許多生物物質，特別是核酸，目前特有的問題是將它們與它們所在的自然環境相分離。一方面，它們通常以非常小的濃度存在，另一方面，通常發現它們存在於許多其它固體和溶解物質中，如存在於胞溶之後的物質中。這使它們難以分離或測量，特別是在檢測特定核酸或檢測核酸的特定性質的生物特異性試驗中。這種生物特異性試驗在診斷學和生物分析領域的研發中起重要作用。生物特異性試驗的例子為雜交試驗、免疫試驗、和受體-配體試驗。雜交試驗使用特定的鹼基對用於核酸分析物如RNA和DNA的分子檢測。因此，長度為18到20個核苷酸的寡聚核苷酸探針能夠特異性識別所選擇的如人類基因組中的互補序列。另一個需要兩種寡聚核苷酸引物選擇性結合的試驗是US4,683,195中描述的聚合酶鏈式反應(PCR)。該方法通過在若干循環中在脫氧核苷酸三磷酸的存在下，通過熱穩定的聚合酶將特定的核酸區域選擇性擴增到可檢測的水平。
如上所述，核酸在上述試驗之一中進行分析或用於其它方法之前，需要將它們從包含不同組分如蛋白質和非蛋白質組分的複合混合物的生物樣品中分離或純化。通常，對於第一步，使用使在研組分即核酸富集的方法。經常地，這些組分包含於細菌細胞、真菌細胞、病毒粒子、或更複雜生物體的細胞如人血細胞或植物細胞中。核酸作為在研組分也可以稱為「靶組分」。
為釋放所述細胞或粒子的內容物，它們可用酶或化學品處理，使這些生物體的細胞壁和細胞膜溶解、降解或變性。該方法通常稱為胞溶。得到的包含這種胞溶物質的溶液稱為胞溶產物。在胞溶過程中經常遇到的問題是降解靶組分的其它酶如脫氧核糖核酸酶或核糖核酸酶在胞溶過程中與靶組分接觸。這些降解酶也可在胞溶之前存在於細胞外部或在不同的細胞隔室內在空間上被分開，而現在接觸到靶組分。該方法期間釋放的其它組分可為如屬於脂多糖類的內毒素，其對細胞有毒性並能夠使人類或動物治療用產品出現問題。
在樣品製備的胞溶步驟之後的下一步中，進一步使核酸富集。通常在用於基於探針的試驗之前將核酸從複雜的胞溶混合物中提取出來。核酸的提取有幾種方法。序列依賴性或生物特異性的方法包括例如親和色譜法或與固定探針的雜交。序列非依賴性或物化方法包括例如使用苯酚-氯仿的液-液提取法、用純乙醇或異丙醇沉澱、用濾紙提取、用膠束形成試劑如十六烷基三甲基溴化銨提取、與固定的嵌入染料如吖啶衍生物結合、吸附於基材如矽膠或硅藻土上、在離液序列高的條件下吸附於可磁吸引的玻璃粒子(MGP)或有機矽烷粒子。優選核酸與具有二氧化矽表面的基材直接結合，原因之一為核酸無需修飾，並且甚至天然的核酸也可以結合。
雖然可使用其它的表面，但用於提取目的的特別興趣在於將核酸吸附到玻璃表面上。
近年來已經提出通過使用核酸與基材如玻璃表面的結合行為將核酸與它們的自然環境分離的許多過程。當想要使核酸游離時，經常使用離液劑如硫氰酸胍或陰離子的、陽離子的、兩性離子的或非離子的洗滌劑。還可以有利地使用迅速降解這些酶或多餘蛋白質的蛋白酶類。在例如細胞胞溶和/或細胞器如線粒體、質體、細胞核或其它含核酸的細胞器胞溶之後游離的核酸，可通過如下方式純化核酸使其結合於基材如無機物載體，洗滌結合有核酸的所述無機物載體，並使所述核酸從所述無機物載體釋放，即解吸。對於洗滌步驟的條件，由本領域的技術人員進行選擇，在所選的洗滌條件下，使核酸保持吸附於無機物載體上。優選地，大於40％，更優選大於50％，更優選大於70％，更優選大於80％，更優選大於90％，更優選大於95％，更優選大於99％的核酸保持吸附於無機物載體上。對於解吸步驟條件，由本領域的技術人員進行選擇，在所選條件下，使核酸從無機物載體釋放。優選地，大於40％，更優選大於50％，更優選大於70％，更優選大於80％，更優選大於90％，更優選大於95％，更優選大於99％的核酸被從無機物載體釋放。
在離液鹽的存在下將核酸吸附於玻璃粒子或二氧化矽粒子在本領域是已知的(Vogelstein，B.，和Gillespie，D.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 76(1979)第615-619頁)並且為核酸的色譜純化和分離過程奠定了基礎。本領域還已知使用高濃度的離液鹽如碘化鈉、高氯酸鈉、和硫氰酸胍從胞溶產物中分離和純化RNA和DNA的方法(Boom，R.等人，J.Clin.Microbiol.28(1990)495-503；Yamada，O.等人，J.Virol.Methods 27(1990)203-209)。得自細菌的質粒DNA在高氯酸鈉的存在下在玻璃粉上的純化在Marko，M.A.等人，Anal.Biochem.121(1982)382-387中有所描述。在DE 3724442中，描述了通過用乙酸使噬菌體粒子沉澱並用高氯酸鹽使噬菌體粒子胞溶而分離單鏈的M13噬菌體DNA。洗滌與玻璃纖維過濾器結合的核酸，然後用含甲醇的Tris/EDTA緩衝溶液洗脫。從λ噬菌體純化DNA的類似過程在Jakobi，R.等人，Anal.Biochem.175(1988)196-201中有所描述。該過程要求核酸在離液鹽溶液中選擇性地與玻璃表面結合，並從汙染物如瓊脂糖、蛋白質或細胞殘餘物中分離核酸。為從汙染物中分離玻璃粒子，可通過離心分離粒子或吸引液體使其通過玻璃纖維過濾器。然而，這是一個限制性步驟，防止使用該過程來處理大量的樣品。
在通過加入鹽和乙醇沉澱之後，使用磁性粒子固定核酸是更有利的，其在例如Alderton，R.P.等人，Anal.Biochem.201(1992)166-169和WO 91/00212中有所描述。在這個過程中，核酸與磁性粒子一起粘合。通過施加磁場使粘合物從原溶劑中分離並進行洗滌步驟。一次洗滌步驟之後，將核酸溶解於Tris緩衝溶液中。然而，這個過程有一個缺點，在於沉澱對於核酸不是選擇性的。而是還粘合有多種固體和溶解物質。結果是，這個過程不能用於除去可能存在的顯著量的特定酶促反應的任何抑制劑。磁性的多孔玻璃也是有市售的，其在多孔的特別是玻璃基質中包含磁性粒子，並由包含鏈親和素的層覆蓋。如果生物材料在複雜的製備步驟中經過修飾使得它們與生物素共價結合，則上述產物可用於分離這些生物材料，如蛋白質或核酸。可磁化的特定吸附劑被證明是非常有效的，並適用於自動樣品製備。亞鐵磁的和鐵磁的以及超順磁性顏料被用於這一目的。最優選的MGP為在WO01/37291中描述的那些。
通過在高濃度鹽的存在下將核酸吸附於基材上如無機物基材來純化核酸也適用於其它的複雜混合物。其例子是分子生物學領域的技術人員已知的，包括例如在核酸的體外合成如PCR、限制性內切酶消化、連接反應等之後得到的反應混合物。例如在Vogelstein，B.和Gillespie，D.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 76(1979)615-619中，提出了使瓊脂糖凝膠中的核酸在碘化鈉的存在下結合於研磨的燧石玻璃的過程。通過在高濃度鹽的存在下將核酸吸附於基材上如無機物基材來純化核酸的另一個應用是除去可能已經與核酸共同純化的熱原(pyrogenic)汙染物。
還不完全清楚核酸在離液劑的存在下與無機物載體結合的機理。據假設，核酸和溶劑之間的相互作用受到影響而使核酸吸附於無機物載體並變性。在高濃度離液劑的存在下，反應幾乎是定量的。被吸附的核酸可通過對無機物載體施用低離子強度的緩衝溶液洗脫。
EP 0 658 164描述了色譜純化核酸的方法。核酸從具有高的鹽濃度的、優選包含離液劑的含水吸附液中吸附於基材即無機物載體上。所述含水吸附液包括鏈長度為1％-50％的C1-C5脂族醇和/或聚乙二醇和/或疏水的無機聚合物和/或有機聚合物和/或有機酸如三氯乙酸。
本領域中目前的分離/純化核酸的方法有某些缺點。這種缺點涉及如純度、選擇性、回收率、實驗室安全性和方便性，以及涉及分離/純化方法的速度。
例如，在使用苯酚/氯仿提取的方案中，殘餘的苯酚對於某些後分離過程，特別對於酶促反應如用限制性內切酶消化、聚合酶鏈式反應(PCR)、或連接酶介導的反應通常是一個問題。通常，純化/分離方法的殘餘試劑的濃度升高可帶來問題。因此，希望在純化的核酸中保持儘可能低的在純化過程中所用試劑的殘餘量。與純度有關的另一個潛在問題是某些物質從吸附基質中共萃取(浸出)。因此，希望在純化的核酸中保持儘可能低的在純化過程中由浸出釋放出的化合物的殘餘量。
本領域目前的在吸附液中使用乙醇或異丙醇的方案的另一個缺點為這種醇的高揮發性和易燃性。一方面，這些易燃的醇在實驗室實踐中是潛在危險。同時，根據國家法規的規定，易燃的醇可造成與可允許的儲存和運輸有關的後勤問題。另外，揮發性醇由於它們的蒸氣壓難以精確定量。因此，希望由危險較小或/和較少造成後勤問題的物質代替易燃醇。
用於製備核酸樣品的市售示例性試劑盒為「High Pure」產品線(Roche Diagnostics GmbH，Mannheim，Germany)。將吸附液轉移到「High Pure」柱並通過包含玻璃纖維材料的羊毛狀物(fleece)。在這個方法過程中，核酸吸附於玻璃物質上。當使用Roche的「HighPure」試劑盒和在吸附液中使用乙醇從血清分離/純化核酸的方案時，人們注意到血清中高的甘油三酯濃度導致吸附液通過玻璃纖維羊毛狀物所需的時間延長(也參見實施例6)。因此，考慮到從具有高的甘油三酯濃度的血清製備樣品時，希望找到乙醇的代替物，以減少吸附液通過玻璃纖維羊毛狀物所需的時間。

發明內容
因此，本發明要解決的問題是提供可供選擇的純化核酸的方法，該方法在含水吸附液中使用可供選擇的物質，以促進核酸與基材如無機物載體的結合。
令人驚訝地，已經發現如果高離子強度的吸附液包括含有式I官能團的與水混溶的非酸性有機化合物時，核酸可與基材結合， (式I)其中W為碳原子或硫原子，和Z為氧原子或氮原子。
因此，在本發明的第一個實施方案中提供純化核酸的方法，其包括以下步驟a)將核酸從組合物吸附於基材上，所述組合物含有(i)緩衝水溶液、(ii)高濃度鹽、和(iii)包含式I官能團的與水混溶的非酸性有機化合物、和(iv)核酸， (式I)其中W為碳原子或硫原子，和Z為氧原子或氮原子；b)任選地用洗滌液洗滌吸附有核酸的基材，然後，c)將吸附有核酸的基材與含有鹽的溶液接觸，從而使核酸從基材解吸，該含有鹽的溶液中鹽的濃度低於步驟(a)的組合物中鹽的濃度，和d)將含有解吸核酸的溶液與基材分離，從而純化核酸，和任選地(e)使解吸核酸從步驟(d)的溶液中沉澱並分離沉澱的核酸，從而進一步純化核酸。
本發明的另一個實施方案是將核酸吸附於基材上的方法，其包括以下步驟(a)提供核酸的水溶液，所述水溶液包含高濃度的鹽和與水混溶的非酸性有機化合物，該有機化合物包含式I的官能團，其中W為碳原子或硫原子，Z為氧原子或氮原子；然後(b)將步驟(a)的水溶液加入到基材上。
另外，本發明的另一個實施方案為將核酸吸附於基材上的方法，其包括以下步驟(a)提供包含高濃度鹽的核酸水溶液；(b)提供粉狀材料形式的基材；(c)提供包含式I官能團的與水混溶的非酸性有機化合物，其中W為碳原子或硫原子，Z為氧原子或氮原子；然後(d)將步驟(b)的基材分散在步驟(c)的與水混溶的非酸性有機化合物中，形成所述基材的懸浮液；和(e)將步驟(a)的水溶液與步驟(d)的懸浮液混合。
另外，本發明的另一個實施方案為含有粉狀材料形式的基材的懸浮液，所述基材分散在與水混溶的非酸性有機化合物中，該有機化合物包含式I的官能團，其中W為碳原子或硫原子，Z為氧原子或氮原子。
另外，本發明的另一個實施方案為與水混溶的非酸性有機化合物在實施本文所述的本發明的方法中的應用，所述與水混溶的非酸性有機化合物包含式I的官能團，其中W為碳原子或硫原子，Z為氧原子或氮原子。另外，本發明的另一個實施方案為使用與水混溶的非酸性有機化合物用於製備懸浮液，通過將基材分散在所述與水混溶的非酸性有機化合物中形成所述基材的懸浮液，所述與水混溶的非酸性有機化合物包含式I的官能團，其中W為碳原子或硫原子，Z為氧原子或氮原子。另外，本發明的另一個實施方案為本發明的懸浮液在實施本發明的方法中的應用。
本發明的其它實施方案為各組件的試劑盒(kit of parts)，包含與水混溶的非酸性有機化合物，該有機化合物包括式I的官能團，其中W為碳原子或硫原子，Z為氧原子或氮原子。
還發現如果高離子強度的吸附液包含與水混溶的環狀二醚時，核酸可與基材結合。
因此，本發明的另一個實施方案為純化核酸的方法，其包括以下步驟a)將核酸從組合物吸附於基材上，所述組合物包含(i)緩衝水溶液、(ii)高濃度鹽、(iii)與水混溶的環狀二醚、和(iv)核酸；b)任選地用洗滌液洗滌吸附有核酸的基材；然後，c)將吸附有核酸的基材與含有鹽的溶液接觸，從而使核酸從基材解吸，該含有鹽的溶液中鹽的濃度低於步驟(a)的組合物中鹽的濃度，和(d)將含有解吸核酸的溶液與基材分離，從而純化核酸，和任選地(e)使解吸核酸從步驟(d)的溶液中沉澱並分離沉澱的核酸，從而進一步純化核酸。
另外，本發明的另一個實施方案為將核酸吸附於基材上的方法，其包括以下步驟(a)提供包含高濃度鹽和與水混溶的環狀二醚的核酸水溶液；和(b)將步驟(a)的水溶液加到基材上。
另外，本發明的另一個實施方案為將核酸吸附於基材上的方法，其包括以下步驟(a)提供包含高濃度鹽的核酸水溶液；(b)提供粉狀材料形式的基材；(c)提供與水混溶的環狀二醚；(d)將步驟(b)的基材分散在步驟(c)的與水混溶的環狀二醚中形成所述基材的懸浮液；和(e)將步驟(a)的水溶液與步驟(d)的懸浮液混合。
另外，本發明的另一個實施方案為包含粉狀材料形式的基材的懸浮液，所述基材分散在與水混溶的環狀二醚中。
另外，本發明的另一個實施方案為與水混溶的環狀二醚在實施本文所述的本發明的方法中的應用。另外，本發明的另一個實施方案為使用與水混溶的環狀二醚，通過將所述基材分散在所述與水混溶的非酸性有機化合物中製備懸浮液，從而形成所述基材的懸浮液。另外，本發明的另一個實施方案為本發明的懸浮液在實施本發明的方法中的應用。
本發明的其它實施方案為包含與水混溶的環狀二醚的各組件的試劑盒。
本發明的另一個實施方案為測定生物樣品中核酸存在的方法，其包括以下步驟(a)使生物樣品胞溶；(b)形成組合物，該組合物含有(i)步驟(a)的胞溶生物樣品、(ii)緩衝水溶液、(iii)高濃度鹽、(iv)包含式I官能團的與水混溶的非酸性有機化合物 (式I)
其中W為碳原子或硫原子，和Z為氧原子或氮原子；(c)將步驟(b)的組合物與基材接觸，從而將核酸吸附於基材上；(d)任選地用洗滌液洗滌吸附有核酸的基材；然後，(e)將吸附有核酸的基材與含有鹽的溶液接觸，從而使核酸從基材解吸，該含有鹽的溶液中鹽的濃度低於步驟(a)的組合物中鹽的濃度，和(f)將含有解吸核酸的溶液與基材分離，和(g)檢測步驟(f)的溶液中核酸的存在，從而測定核酸的存在。優選地，通過核酸的擴增測定核酸，通過使用特異引物、特異性檢測探針、和擴增混合物的聚合酶鏈式反應的方式進行擴增，從而實時監測擴增。
本發明的另一個實施方案為測定生物樣品中核酸的存在的方法，其包括以下步驟(a)使生物樣品胞溶；(b)形成組合物，該組合物含有(i)步驟(a)的胞溶生物樣品、(ii)緩衝水溶液、(iii)高濃度鹽、(iv)與水混溶的環狀二醚，其中W為碳原子或硫原子，Z為氧原子或氮原子；(c)將步驟(b)的組合物與基材接觸，從而將核酸吸附於基材上；(d)任選地用洗滌液洗滌吸附有核酸的基材；然後，(e)將吸附有核酸的基材與含有鹽的溶液接觸，從而使核酸從基材解吸，該含有鹽的溶液中鹽的濃度低於步驟(a)的組合物中鹽的濃度，和(f)將含有解吸核酸的溶液與基材分離，和(g)檢測步驟(f)的溶液中核酸的存在，從而測定核酸的存在。
在本文中，可以理解，術語「核酸」表示至少一種核酸。另外，術語「核酸」還可能表示核酸的混合物。術語「核酸」包括RNA、DNA、或兩者都包括。術語「基材」表示在水溶液中基本上不溶的物質，並且當加入高離子強度的核酸水溶液時，所述基材上可吸附核酸。因此，基材的例子為多孔或無孔無機物粒子，如二氧化矽、玻璃、石英、沸石、或其混合物。同時，術語「基材」包括塗有二氧化矽、玻璃、石英、或沸石的可被磁吸引的粒子。另外，可以理解，「粉末」或「粉狀」材料形式的基材指精細粉碎的材料，當分散在液相如液體有機化合物或水溶液中時，其生成懸浮液。術語「粉末」或「粉狀」材料包括其中粉狀材料已經聚集的片，但是當與液體有機化合物或水溶液混和時，仍然得到懸浮液。另外，可以理解，術語「高離子強度」和「高濃度」指溶解的鹽的濃度等於或大於約1M所生成的水溶液的離子強度或濃度。優選水溶液中存在的鹽的濃度為1-10M。更優選離液鹽的濃度為1到8M。另外，術語「與水混溶的」是指在室溫和標準大氣壓力下非含水有機化合物可以以等於或大於1％(體積百分數)的比例溶解於水中，形成均相液相。術語「非酸性的」有機化合物表示沒有羧基官能團的有機化合物。
詳細而言，將(至少一種)核酸(也稱為靶核酸)結合於基材如玻璃粒子上的過程可描述如下。優選在濃度為1到8mol/l，優選在2到6mol/l的離液鹽的存在下進行，該離液鹽可為碘化鈉、高氯酸鈉、硫氰酸胍、異硫氰酸胍或鹽酸胍。也可使用其它物質如氯化鋰、氯化鈉、氯化鉀、醋酸鈉、脲、及其混合物。
純化效果得自在這些條件下，即在一定濃度的離液劑以及優選的與水混溶的非酸性有機化合物的存在下，將DNA或RNA結合於具有玻璃表面的材料上。為使樣品與基材即與核酸有親和力的材料接觸，將樣品與材料混和並培養一段足以發生結合的時間。技術人員通常熟知進行非磁性粒子處理過程的培養持續時間。這個步驟可通過在不同的時間點測定固定在表面上的生物材料的量而進行優化。對於核酸，適合的培養時間為10秒到30分鐘。培養之後，結合的(至少一種)靶組分即核酸與液體分離。這通常可通過重力來實現、或在核酸結合於磁性玻璃粒子上的情況中通過施加磁場使與磁性粒子結合的材料分離而實現。例如，磁性粒子可被拉到其中進行培養的容器的壁上。從而除去包含未與磁性粒子結合的樣品的液體。使用的除去過程取決於其中進行培養的容器的種類。適當的步驟包括通過移液或抽取除去液體。
另一個例子是將吸附液中的核酸結合於玻璃羊毛狀物上。市售的試劑盒經常在柱的底部提供這種羊毛狀物。包含核酸的吸附液被轉移到柱上，並通過施加力使吸附液通過羊毛狀物。術語「力」包括重力，和優選的離心力。非常優選的是「自旋柱」過程，其中由於通過離心施加的力使吸附液通過過濾器。使吸附液通過羊毛狀物的其它方法包括施用壓力或吸力。
然後，結合有DNA或RNA的材料可至少洗滌一次。優選地，洗滌液包含高於1和低於100體積百分數的與水混溶的非酸性有機化合物。同樣優選地，洗滌液包含1到100體積百分數的與水混溶的非酸性有機化合物。更優選地，洗滌液為1到50體積百分數的與水混溶的非酸性有機化合物與水的混合物。另一個非常優選的洗滌液為40到80體積百分數的與水混溶的非酸性有機化合物與水的混合物。另一個非常優選的洗滌液為50到99體積百分數的與水混溶的非酸性有機化合物與水的混合物。更優選的洗滌液是約70體積百分數的與水混溶的非酸性有機化合物與水的混合物。同樣優選的洗滌液為與水混溶的非酸性有機化合物，也就是說得自供應商的純液體化合物也理解是被包括在術語「洗滌液」中。
使用的洗滌液不會引起所述(至少一種)靶核酸從材料表面釋放，但儘可能徹底地洗掉不需要的汙染物。這一洗滌步驟優選通過將結合有靶核酸的材料與洗滌液培養進行。在這一步驟中，材料優選是懸浮的。同樣優選地，在材料為玻璃羊毛狀物或柱中的填塞物的情況中，洗滌步驟通過用洗滌液淋洗柱子而進行。優選地，通過施加壓力、吸力、離心力或重力使洗滌液通過柱。當與水混溶的非酸性有機化合物以純的形式使用時，以上所述同樣適用。
被汙染的洗滌液優選正如在上述將核酸與基材材料結合的步驟中那樣被除去。最後的洗滌步驟之後，材料可在真空中簡單地乾燥，或使液體蒸發。也可實施使用丙酮的預處理步驟。
然後，條件可能逆轉，例如，離液劑或與水混溶的非酸性有機化合物的濃度可被降低，以洗脫與材料結合的DNA或RNA。優選地，使基材如磁性玻璃粒子與其餘樣品分離的方法通過使固定的生物材料粒化，例如通過重力或在磁性玻璃粒子的情況中使用磁鐵，並除去上清液進行。然後，將固定有生物材料的磁性玻璃粒子再懸浮在沒有或只有少量離液劑和/或與水混溶的非酸性有機化合物的水溶液中。或者，可使用沒有或只有少量離液劑和/或與水混溶的非酸性有機化合物的溶液稀釋該懸浮液。具有這一性質的緩衝溶液在DE 372442和Jakobi，R.，等人的Anal.Biochem.，175(1988)196-201中已知。低含鹽量的洗脫緩衝溶液特別為含量低於0.2mol/l的緩衝溶液。優選地，洗脫緩衝溶液包含緩衝用的物質Tris。同樣優選地，洗脫緩衝溶液為軟化水。目前包含純化DNA或RNA的溶液可用於其它反應。任選地，可使用例如乙醇或異丙醇使核酸從溶液中沉澱。沉澱物還可以進行另外的洗滌步驟。這類的方法是本領域技術人員公知的，並在Sambrook，Fritsch Maniatis，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，第三版，CSHL Press，2001中有所描述。
對於本發明方法中的吸附和洗滌步驟，優選使用適合於分子生物學方法特別是脫氧核糖核酸(DNA)或者核糖核酸(RNA)純化方法中的液體，所述方法利用了這些物質在一定條件下與玻璃粒子的結合。優選的液體包括含有式I官能團的與水混溶的非酸性有機化合物 (式I)其中W為碳原子或硫原子，Z為氧原子或氮原子。優選地，官能團選自氧代基團、硫氧代(sulfoxo)基團、氰基、和氨基甲醯基官能或醯胺中的但不屬於羧基官能的羰基。更優選地，與水混溶的非酸性有機化合物選自丙酮、乙醯丙酮、乙腈、二甲亞碸、二乙酮、甲基乙基酮、甲基丙基酮、異丁基甲基酮、γ-丁內酯、γ-戊內酯、異丙二醇碳酸酯、和N-甲基-2-吡咯烷酮。本發明同樣包括包含作為與水混溶的非酸性有機化合物的環狀二醚的液體。優選地，環狀二醚為二氧雜環己烷。
本發明中使用的磁性玻璃粒子可以以不同製劑提供。可能以片劑的形式提供、作為粉末或作為懸浮液提供。非常優選地，磁性玻璃粒子懸浮在與水混溶的非酸性有機化合物中。優選地，這些懸浮液包含5到60mg/ml的磁性玻璃粒子(MGP)。同樣優選地，將含二氧化矽的材料懸浮在緩衝水溶液中，所述緩衝水溶液任選地包含濃度為2到8mol/l，優選4到6mol/l的離液劑。離液鹽為碘化鈉、高氯酸鈉、硫氰酸胍、異硫氰酸胍或鹽酸胍。也可使用本領域技術人員已知的其它化合物。本發明的離液劑為幹擾液態水有序結構的任何化學物質，並且如果這些試劑存在於包含DNA或RNA的溶液中，其具有使DNA或RNA與磁性玻璃粒子結合的效果。生產適當的緩衝水溶液對於本領域技術人員而言是顯而易見的。適用於分子生物學目的的緩衝系統可在例如Sambrook，Fritsch Maniatis，Molecular Cloning，A LaboratoryManual，第三版，CSHL Press，2001中發現。優選的緩衝材料為三(羥甲基)-氨基甲烷(TRIS)、磷酸鹽、N-(2-羥乙基)哌嗪-N′-(2-乙磺酸)(HEPES)及其鹽或其它適當的材料。另外，可存在那些改進溶液的離子強度的物質如NaCl、KCl、或CaCl2；或金屬陽離子絡合劑如乙二胺四乙酸(EDTA)或其鹽。也可存在本領域已知的其它生物材料。
本發明的方法適合於從包含核酸的其它生物材料的複雜混合物純化核酸，即RNA或DNA。因此可以純化多種核酸的混合物，甚至是包含低豐度在研核酸的混合物。因此，本發明還包括純化其中靶核酸在濃度上可能是微量組分(或可能以低豐度存在)的特定核酸的混合物。
本文所述的過程可用於分離天然或修飾的核酸。天然核酸被認為是如下核酸，其結構與天然存在的核酸相比不是不可逆改變的。然而，這不意味著樣品的其它組分不能被修飾。修飾的核酸包括非天然存在的核酸，如通過將其連接於反應性的、可檢測的、或能夠固定的基團上而修飾的核酸。其例子為生物素化的核酸。
在上述步驟之後，現在可根據需要進一步使用通過本發明的方法分離的核酸。例如它們可用作多種酶促反應的基材。當涉及核酸時，它們可用於測序、放射性或非放射性標記、它們所含的一個或多個序列的擴增、轉錄、與標記探針核酸雜交、翻譯或連接。因此，本發明也包括如下方法該方法包含使結合的靶核酸從與其有親合力的材料中釋放的步驟。如果期望，如此純化的靶核酸可與如上所述的材料分離。
因此，本發明的第一個實施方案是純化核酸的方法，其包括以下步驟a)將包含(i)緩衝水溶液、(ii)高濃度鹽、(iii)包含式I官能團的與水混溶的非酸性有機化合物、和(iv)核酸的組合物中的核酸吸附於基材上 (式I)其中W為碳原子或硫原子，和Z為氧原子或氮原子；b)任選地用洗滌液洗滌吸附有核酸的基材；然後，c)將吸附有核酸的基材與含有鹽的溶液接觸，從而使核酸從基材解吸，該含有鹽的溶液中鹽的濃度低於步驟(a)的組合物中鹽的濃度；和d)將含有解吸核酸的溶液與基材分離，從而純化核酸，和任選地(e)使解吸核酸從步驟(d)的溶液中沉澱並分離沉澱的核酸，從而進一步純化核酸。優選官能團選自氧代基、硫氧代基、氰基、和氨基甲醯基官能或醯胺中的但不屬於羧基官能的羰基。更優選與水混溶的非酸性有機化合物選自丙酮、乙醯丙酮、乙腈、二甲亞碸、二乙酮、甲基乙基酮、甲基丙基酮、異丁基甲基酮、γ-丁內酯、γ-戊內酯、異丙二醇碳酸酯、和N-甲基-2-吡咯烷酮。還考慮了步驟(a)的組合物在純化(至少一種)核酸的自動化方法中的應用。能夠實施本發明的方法的自動化處理裝置，如具有移液裝置的自動機，經常具有包含溶液如儲備溶液的開口容器。在這個方面，溶液的液相包含在標準大氣壓力和室溫下具有低蒸發傾向的溶劑是有利的。因此，非常優選地，與水混溶的非酸性有機化合物為二甲亞碸。還非常優選地，與水混溶的非酸性有機化合物為N-甲基-2-吡咯烷酮。
優選地，步驟(a)的組合物包含1到50體積百分數的與水混溶的非酸性有機化合物。更優選地，步驟(a)的組合物包含2到35體積百分數的與水混溶的非酸性有機化合物。更優選地，步驟(a)的組合物包含3到30體積百分數的與水混溶的非酸性有機化合物。非常優選地，步驟(a)的組合物包含約4體積百分數的與水混溶的非酸性有機化合物。非常優選地，步驟(a)的組合物包含約15體積百分數的與水混溶的非酸性有機化合物。非常優選地，步驟(a)的組合物包含約25體積百分數的與水混溶的非酸性有機化合物。
優選地，步驟(a)的組合物中的鹽為離液鹽，其濃度為1到8M。更優選地，所述離液鹽選自高氯酸鈉、鹽酸胍、硫氰酸胍、異硫氰酸胍、和碘化鈉。
同樣優選地，步驟(a)的組合物中鹽的濃度為1到10M，並且所述鹽選自氯化鋰、氯化鈉、氯化鉀、醋酸鈉、脲、及其混合物。
優選地，洗滌液包含與水混溶的非酸性有機化合物。更優選地，洗滌液包含1到50體積百分數的與水混溶的非酸性有機化合物。更優選地，洗滌液包含2到35體積百分數的與水混溶的非酸性有機化合物。更優選地，洗滌液包含3到30體積百分數的與水混溶的非酸性有機化合物。非常優選地，洗滌液包含約4體積百分數的與水混溶的非酸性有機化合物。非常優選地，洗滌液包含約15體積百分數的與水混溶的非酸性有機化合物。非常優選地，洗滌液包含約25體積百分數的與水混溶的非酸性有機化合物。
優選地，基材包括多孔或無孔無機物基材，其選自矽膠、玻璃纖維、石英纖維、和沸石。同樣優選地，基材包括多孔或無孔無機物基材，其選自金屬氧化物，和/或金屬混合的氧化物、氧化鋁、二氧化鈦、氧化鋯、和主要由玻璃組成的材料。同樣優選粒度為0.1μm到1,000μm的無機物基材。同樣優選當使用時，多孔的無機物載體材料的孔徑大小為2到1,000nm。更優選地，多孔或無孔載體材料，特別是沸石，為疏鬆填充的形式。更優選地，無機物基材由玻璃形式的濾板、石英或陶瓷濾板、和/或包含矽膠的膜、和/或無機物載體的粒子或纖維和石英或玻璃棉的織物組成。同樣優選地，基材包括可被磁吸引的粒子。更優選地，可被磁吸引的粒子塗有選自矽膠、玻璃、石英、和沸石的無機物基材。更優選地，基材包括塗有玻璃的可被磁吸引的粒子。靶核酸可進行檢測和測定。優選上述純化方法，然後進行測定或檢測步驟或純化方法，然後進行擴增和測定或檢測步驟。靶核酸或在研核酸可包含在非靶核酸的基質中，甚至可在特定核酸的所述混合物中為微量組分。適當的DNA檢測方法為本領域技術人員已知的並在標準教科書如Sambrook，Fritsch Maniatis，Molecular Cloning，ALaboratory Manual，第三版，CSHL Press，2001；和Ausubel等人，Current Protocols in Molecular Biology，J.Wiley and Sons，NY，1987中有所描述。在DNA檢測步驟之前同樣可能進行另外的純化步驟如沉澱步驟。檢測方法可包括但不限於特定染料如溴化3，8-二氨基-5-乙基-6-苯基菲啶鎓的結合或嵌入，所述染料嵌入雙鏈DNA並由此改變其螢光。純化的DNA同樣可通過電泳法分離，任選地在限制性內切酶酶切消化之後進行所述分離，然後顯象。還有基於探針的試驗，其採用將寡聚核苷酸雜交到特異序列上並隨後進行雜交檢測。同樣在本領域技術人員已知的另外的步驟之後對DNA測序。其它方法將多種DNA序列施加到結合有特異探針的矽片上，並當結合有互補序列時產生信號。
本發明同樣涉及包含核酸的非蛋白質和蛋白質組分的混合物，其中核酸包括DNA或RNA或兩者。
本發明同樣涉及從其中純化核酸的生物樣品，其包括病毒或細菌細胞以及多細胞機體的分離細胞如人和動物細胞如白細胞，和免疫活性的低和高分子化合物如半抗原、抗原、抗體和核酸、血漿、腦液、唾液、糞便、活檢標本、骨髓、漱口液、血清、組織、尿或其混合物。本發明同樣涉及生物樣品如得自人或動物體的液體；優選生物樣品為血液、血漿、血清或尿。血漿優選為EDTA、肝素或檸檬酸鹽血漿。在本發明的一個實施方案中，生物樣品包括細菌細胞、真核細胞、病毒或其混合物。以上所述的生物樣品，優選為經過處理的形式如胞溶產物，可為(靶)核酸由其吸附到基材上的組合物的部分。
同樣優選核酸和蛋白質材料的混合物包括脫氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)或兩者，優選DNA或RNA或兩者源自於病毒或(至少一種)微生物。病毒可為A型肝炎病毒(HAV)、B型肝炎病毒(HBV)、C型肝炎病毒(HCV)、人類免疫缺陷病毒(HIV)、人類乳頭狀瘤病毒(HPV)或細小病毒B19。
同樣優選靶核酸組分和其它核酸的純化基本上如上所述。然後對靶核酸組分進行另外的操作並檢測，即，通過特異性擴增靶序列到可檢測的量的聚合酶鏈式反應進行擴增。其它可能的擴增反應為連接酶鏈式反應(LCR，Wu，D.Y.和Wallace R.B.，Genomics 4(1989)560-569；和Barany，F.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88(1991)189-193)；聚合酶連接酶鏈式反應(Barany，F.，PCR Methods and Applic.1(1991)5-16)；Gap-LCR(WO 90/01069)；修復鏈式反應(EP 0 439 182A2)，3SR(Kwoh，D.Y.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86(1989)1173-1177；Guatelli，J.C.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87(1990)1874-1878；WO 92/08800)，和NASBA(US 5,130,238)。另外，有鏈置換擴增(SDA)、轉錄介導擴增(TMA)、和Q-β-擴增(綜述參見例如Whelen，A.C.和Persing，D.H.，Annu.Rev.Microbiol.50(1996)349-373；Abramson，R.D.和Myers，T.W.，Curr.Opin.Biotechnol.4(1993)41-47)。
特別優選的是在WO 92/02638和相應的美國專利US 5,210,015；US 5,804,375；US 5,487,972中公開的TaqMan檢測方法。該方法採用聚合酶的核酸外切酶活性生成信號。詳細而言，檢測靶核酸組分的方法包括使樣品與含有與靶核酸組分區域序列互補的寡聚核苷酸和含有與相同靶核酸組分序列鏈的第二區域序列互補但不包括第一寡聚核苷酸定義的核酸序列的標記寡聚核苷酸接觸，以在雜交條件期間生成雙鏈體混合物，其中雙鏈體包括退火為第一寡聚核苷酸和標記寡聚核苷酸的靶核酸，使得第一寡聚核苷酸的3′-末端連接於標記寡聚核苷酸的5′-末端。然後，用具有5′到3′核酸酶活性的模板依賴性核酸聚合酶在足夠使得聚合酶的5′到3′核酸酶活性能使退火的標記寡聚核苷酸裂開並釋放標記片段的條件下處理混合物。檢測和/或測量標記寡聚核苷酸水解生成的信號。TaqMan技術消除了對形成固相結合反應複合物的需要，並使其可檢測。更概括地，公開了純化靶核酸組分然後進行檢測步驟的過程，其中擴增和/或檢測反應為均相溶液相。
本發明的另一個實施方案是將核酸吸附於基材上的方法，其包括以下步驟(a)提供核酸的水溶液，該水溶液包含高濃度的鹽和具有式I官能團的與水混溶的非酸性有機化合物 (式I)其中W為碳原子或硫原子，Z為氧原子或氮原子；和(b)將步驟(a)的水溶液加到基材上。優選地，官能團選自氧代基、硫氧代基、氰基、和氨基甲醯基官能或醯胺中的但不屬於羧基官能的羰基。更優選地，與水混溶的非酸性有機化合物選自丙酮、乙醯丙酮、乙腈、二甲亞碸、二乙酮、甲基乙基酮、甲基丙基酮、異丁基甲基酮、γ-丁內酯、γ-戊內酯、異丙二醇碳酸酯、和N-甲基-2-吡咯烷酮。同樣考慮了在自動化方法中使用步驟(a)的水溶液來純化(至少一種)核酸。能夠實施本發明的方法的自動化處理裝置，如具有移液裝置的自動機，經常具有包含溶液如儲備溶液的開口容器。在這個方面，溶液/或懸浮液的液相包含在標準大氣壓力和室溫下具有低蒸發傾向的溶劑是有利的。因此，非常優選地，與水混溶的非酸性有機化合物為二甲亞碸。還非常優選地，與水混溶的非酸性有機化合物為N-甲基-2-吡咯烷酮。
優選地，步驟(a)的水溶液包含1到50體積百分數的與水混溶的非酸性有機化合物。更優選地，步驟(a)的水溶液包含2到35體積百分數的與水混溶的非酸性有機化合物。更優選地，步驟(a)的水溶液包含3到30體積百分數的與水混溶的非酸性有機化合物。非常優選地，步驟(a)的水溶液包含約4體積百分數的與水混溶的非酸性有機化合物。非常優選地，步驟(a)的水溶液包含約15體積百分數的與水混溶的非酸性有機化合物。非常優選地，步驟(a)的水溶液包含約25體積百分數的與水混溶的非酸性有機化合物。
優選地，步驟(a)的水溶液中的鹽為濃度為1到8M的離液鹽。更優選地，所述離液鹽選自高氯酸鈉、鹽酸胍、硫氰酸胍、異硫氰酸胍、和碘化鈉。
同樣優選地，步驟(a)的水溶液中的鹽的濃度為1到10M，並且所述鹽選自氯化鋰、氯化鈉、氯化鉀、醋酸鈉、脲、及其混合物。
優選地，基材包括多孔或無孔無機物基材，其選自矽膠、玻璃纖維、石英纖維、和沸石。同樣優選地，基材包括多孔或無孔無機物基材，其選自金屬氧化物，和/或金屬混合的氧化物、氧化鋁、二氧化鈦、氧化鋯、和主要由玻璃組成的材料。同樣優選粒度為0.1μm到1,000μm的多孔無機物基材。同樣優選當使用時，多孔的無機物載體材料的孔徑大小為2到1,000nm。更優選地，多孔或無孔載體材料，特別是沸石，為疏鬆填充的形式。更優選地，無機物基材由玻璃形式的濾板、石英或陶瓷濾板、和/或包含矽膠的膜、和/或無機物載體的粒子或纖維和石英或玻璃棉的織物組成。同樣優選地，基材包括可被磁吸引的粒子。更優選地，可被磁吸引的粒子塗有選自矽膠、玻璃、石英、和沸石的無機物基材。更優選地，基材包括塗有玻璃的可被磁吸引的粒子。
本發明的另一個實施方案中提供將核酸吸附於基材上的方法，其包括以下步驟a)提供包含高濃度鹽的核酸水溶液；(b)提供粉狀材料形式的基材；(c)提供包含式I官能團的與水混溶的非酸性有機化合物 (式I)其中W為碳原子或硫原子，和Z為氧原子或氮原子；(d)將步驟(b)的基材分散在步驟(c)的與水混溶的非酸性有機化合物中，以形成所述基材的懸浮液；和(e)將步驟(a)的水溶液與步驟(d)的懸浮液混合。優選地，官能團選自氧代基、硫氧代基、氰基、和氨基甲醯基官能或醯胺中的但不屬於羧基官能的羰基。更優選與水混溶的非酸性有機化合物選自丙酮、乙醯丙酮、乙腈、二甲亞碸、二乙酮、甲基乙基酮、甲基丙基酮、異丁基甲基酮、γ-丁內酯、γ-戊內酯、異丙二醇碳酸酯、和N-甲基-2-吡咯烷酮。還考慮了步驟(d)的懸浮液在純化(至少一種)核酸的自動化方法中的應用。能夠實施本發明的方法的自動化處理裝置，如具有移液裝置的自動機，經常具有包含溶液如儲備溶液和懸浮液如步驟(d)的懸浮液的開口容器。在這個方面，溶液和/或懸浮液的液相包含在標準大氣壓力和室溫下具有低蒸發傾向的溶劑是有利的。因此，非常優選地，與水混溶的非酸性有機化合物為二甲亞碸。還非常優選地，與水混溶的非酸性有機化合物為N-甲基-2-吡咯烷酮。
優選地，步驟(e)的組合物包含1到50體積百分數的與水混溶的非酸性有機化合物。更優選地，步驟(e)的組合物包含2到35體積百分數的與水混溶的非酸性有機化合物。更優選地，步驟(e)的組合物包含3到30體積百分數的與水混溶的非酸性有機化合物。非常優選地，步驟(e)的組合物包含約4體積百分數的與水混溶的非酸性有機化合物。非常優選地，步驟(e)的組合物包含約15體積百分數的與水混溶的非酸性有機化合物。非常優選地，步驟(e)的組合物包含約25體積百分數的與水混溶的非酸性有機化合物。
優選地，步驟(e)的組合物中的鹽為離液鹽，其濃度為1到8M。更優選地，所述離液鹽選自高氯酸鈉、鹽酸胍、硫氰酸胍、異硫氰酸胍、和碘化鈉。
同樣優選地，步驟(e)的組合物中鹽濃度為1到10M，並且所述鹽選自氯化鋰、氯化鈉、氯化鉀、醋酸鈉、脲、及其混合物。
優選地，基材包括粉狀多孔或無孔無機物基材，其選自矽膠、玻璃、石英、和沸石。同樣優選地，基材包括粉狀多孔或無孔無機物基材，其選自金屬氧化物，和/或金屬混合的氧化物、氧化鋁、二氧化鈦、氧化鋯、和主要由玻璃組成的材料。同樣優選基材包括可被磁吸引的粒子。更優選地，可被磁吸引的粒子塗有選自矽膠、玻璃、石英、和沸石的無機物基材。更優選地，基材包括塗有玻璃的可被磁吸引的粒子。
本發明的另一個實施方案為包含粉狀材料形式的基材的懸浮液，該基材分散在包括式I官能團的與水混溶的非酸性有機化合物中 (式I)其中W為碳原子或硫原子，和Z為氧原子或氮原子。優選地，官能團選自氧代基、硫氧代基、氰基、和氨基甲醯基官能或醯胺中的但不屬於羧基官能的羰基。更優選與水混溶的非酸性有機化合物選自丙酮、乙醯丙酮、乙腈、二甲亞碸、二乙酮、甲基乙基酮、甲基丙基酮、異丁基甲基酮、γ-丁內酯、γ-戊內酯、異丙二醇碳酸酯、和N-甲基-2-吡咯烷酮。還考慮了本發明的懸浮液在純化(至少一種)核酸的自動化方法中的應用。能夠實施本發明的方法的自動化處理裝置，如具有移液裝置的自動機，經常具有包含溶液如儲備溶液和懸浮液如上述懸浮液的開口容器。在這個方面，溶液和/或懸浮液的液相包含在標準大氣壓力和室溫下具有低蒸發傾向的溶劑是有利的。因此，非常優選地，與水混溶的非酸性有機化合物為二甲亞碸。還非常優選地，與水混溶的非酸性有機化合物為N-甲基-2-吡咯烷酮。
優選地，基材包括粉狀多孔或無孔無機物基材，其選自矽膠、玻璃、石英、和沸石。同樣優選地，基材包括粉狀多孔或無孔無機物基材，其選自金屬氧化物，和/或金屬混合的氧化物、氧化鋁、二氧化鈦、氧化鋯、和主要由玻璃組成的材料。同樣優選基材包括可被磁吸引的粒子。更優選地，可被磁吸引的粒子塗有選自矽膠、玻璃、石英、和沸石的無機物基材。更優選地，基材包括塗有玻璃的可被磁吸引的粒子。
本發明的另一個實施方案為使用包含式I官能團的與水混溶的非酸性有機化合物用於實施本文所述的方法 (式I)其中W為碳原子或硫原子，Z為氧原子或氮原子。
優選地，官能團選自氧代基、硫氧代基、氰基、和氨基甲醯基官能或醯胺中的但不屬於羧基官能的羰基。更優選與水混溶的非酸性有機化合物選自丙酮、乙醯丙酮、乙腈、二甲亞碸、二乙酮、甲基乙基酮、甲基丙基酮、異丁基甲基酮、γ-丁內酯、γ-戊內酯、異丙二醇碳酸酯、和N-甲基-2-吡咯烷酮。還考慮了本發明的懸浮液在純化(至少一種)核酸的自動化方法中的應用。能夠實施本發明的方法的自動化處理裝置，如具有移液裝置的自動機，經常具有包含溶液如儲備溶液和懸浮液如上述懸浮液的開口容器。在這個方面，溶液和/或懸浮液的液相包含在標準大氣壓力和室溫下具有低蒸發傾向的溶劑是有利的。因此，非常優選地，與水混溶的非酸性有機化合物為二甲亞碸。還非常優選地，與水混溶的非酸性有機化合物為N-甲基-2-吡咯烷酮。
本發明的另一個實施方案為使用包含式I官能團的與水混溶的非酸性有機化合物用於製備懸浮液，其通過將基材分散於所述與水混溶的非酸性有機化合物中製備 (式I)其中W為碳原子或硫原子，Z為氧原子或氮原子。
優選地，官能團選自氧代基、硫氧代基、氰基、和氨基甲醯基官能或醯胺中的但不屬於羧基官能的羰基。更優選與水混溶的非酸性有機化合物選自丙酮、乙醯丙酮、乙腈、二甲亞碸、二乙酮、甲基乙基酮、甲基丙基酮、異丁基甲基酮、γ-丁內酯、γ-戊內酯、異丙二醇碳酸酯、和N-甲基-2-吡咯烷酮。還考慮了本發明的懸浮液在純化(至少一種)核酸的自動化方法中的應用。能夠實施本發明的方法的自動化處理裝置，如具有移液裝置的自動機，經常具有包含溶液如儲備溶液和懸浮液如上述懸浮液的開口容器。在這個方面，溶液和/或懸浮液的液相包含在標準大氣壓力和室溫下具有低蒸發傾向的溶劑是有利的。因此，非常優選地，與水混溶的非酸性有機化合物為二甲亞碸。還非常優選地，與水混溶的非酸性有機化合物為N-甲基-2-吡咯烷酮。
優選地，基材包括粉狀多孔或無孔無機物基材，其選自矽膠、玻璃、石英、和沸石。同樣優選地，基材包括粉狀多孔或無孔無機物基材，其選自金屬氧化物，和/或金屬混合的氧化物、氧化鋁、二氧化鈦、氧化鋯、和主要由玻璃組成的材料。同樣優選基材包括可被磁吸引的粒子。更優選地，可被磁吸引的粒子塗有選自矽膠、玻璃、石英、和沸石的無機物基材。更優選地，基材包括塗有玻璃的可被磁吸引的粒子。
本發明的另一個實施方案為使用本發明懸浮液用於實施本文所述的本發明的方法。
本發明同樣考慮了試劑盒。這種試劑盒在本領域中已知，其另外包括能夠在樣品製備過程中使用的塑料製品，如由德國漢堡的Eppendorf生產的96或384孔格式的微量滴定板或僅僅是普通的反應管、和所有其它的用於實施本發明方法的試劑。因此，試劑盒可另外包含與核酸(和(至少一種)靶核酸組分)有親合力的材料，與核酸(和(至少一種)靶核酸組分)有親合力的材料優選包括具有二氧化矽表面的材料。優選地，具有二氧化矽表面的材料為玻璃。最優選地，與核酸有親合力的材料包括磁性玻璃粒子，即塗有玻璃的可被磁吸引的粒子的組合物。另一個優選的與核酸有親合力的材料為陰離子交換劑。試劑盒可進一步或另外包括胞溶緩衝溶液，其包含例如離液劑、洗滌劑、或其混合物，其能夠使細胞溶解。本發明的試劑盒的這些組分可分別在試管中或儲存容器中提供。根據組分的性質，這些甚至可在一個試管或儲存容器中提供。試劑盒可進一步或另外包括適合於磁性玻璃粒子在結合有DNA或RNA時的洗滌步驟的洗滌液。這些洗滌液可包含本發明的與水混溶的非酸性有機化合物和/或在一種或多種不含本發明與水混溶的非酸性有機化合物的酸性pH的緩衝溶液中的離液劑；和/或如上所述的離液劑。通常洗滌液或其它溶液作為儲備溶液提供，其在使用之前必需經過稀釋。試劑盒可進一步或另外包括洗脫劑或洗脫緩衝溶液，即溶液或緩衝溶液(如10mM Tris、1mM EDTA、pH8.0)或純水，以洗脫結合於磁性玻璃粒子上的DNA或RNA。另外，可存在有其它的試劑或緩衝溶液，用於核酸即DNA或RNA的純化方法。
本發明的另一個實施方案為各組件的試劑盒，其包含(a)緩衝鹽和離液鹽的濃儲備液，離液鹽選自高氯酸鈉、鹽酸胍、硫氰酸胍、異硫氰酸胍、和碘化鈉；(b)包含式I官能團的與水混溶的非酸性有機化合物 (式I)其中W為碳原子或硫原子，Z為氧原子或氮原子，與水混溶的非酸性有機化合物選自丙酮、乙醯丙酮、乙腈、二甲亞碸、二乙酮、甲基乙基酮、甲基丙基酮、異丁基甲基酮、γ-丁內酯、γ-戊內酯、異丙二醇碳酸酯、和N-甲基-2-吡咯烷酮；(c)緩衝溶液；和(d)色譜材料和過濾材料。
本發明的另一個實施方案為各組件的試劑盒，其包含(a)緩衝鹽和選自氯化鋰、氯化鈉、氯化鉀、醋酸鈉、脲、及其混合物的鹽的濃儲備液；(b)包含式I官能團的與水混溶的非酸性有機化合物
(式I)其中W為碳原子或硫原子，Z為氧原子或氮原子，與水混溶的非酸性有機化合物選自丙酮、乙醯丙酮、乙腈、二甲亞碸、二乙酮、甲基乙基酮、甲基丙基酮、異丁基甲基酮、γ-丁內酯、γ-戊內酯、異丙二醇碳酸酯、和N-甲基-2-吡咯烷酮；(c)緩衝溶液；和(d)色譜材料和過濾材料。
本發明的另一個實施方案為各組件的試劑盒，其包含(a)緩衝鹽和離液鹽的濃儲備液，離液鹽選自高氯酸鈉、鹽酸胍、硫氰酸胍、異硫氰酸胍、和碘化鈉；(b)如上所述的本發明的懸浮液；(c)緩衝溶液。
本發明的另一個實施方案為各組件的試劑盒，其包含(a)緩衝鹽和選自氯化鋰、氯化鈉、氯化鉀、醋酸鈉、脲、及其混合物的鹽的濃儲備液；(b)如上所述的本發明的懸浮液；(c)緩衝溶液。
本發明的優選實施方案為本發明的方法或試劑盒在如WO 99/16781中描述的可自動化的方法中的應用。可自動化的方法是指該方法的步驟適合於使用在很少或沒有通過人類外部控制或影響下能夠進行操作的裝置或機器進行。自動化方法是指可自動化的方法的步驟使用在很少或沒有通過人類外部控制或影響下能夠進行操作的裝置或機器進行。只有方法的準備步驟需要手工完成，如儲存容器必需被填充並放在位置上，樣品的選擇必需由人類完成，其它步驟為本領域技術人員已知的，例如控制計算機的操作。裝置或機器可例如自動添加液體、混合樣品、或在特定溫度下進行培養步驟。典型地，這種機器或裝置通過執行其中規定了單個步驟和命令的程序的計算機進行自動控制。優選的自動化方法為在高通量格式中實施的那些方法，所述高通量格式是指方法和所用機器或裝置被優化用於在短時間內處理高通量樣品。在本發明的另一個實施方案中，本發明的方法或試劑盒用於半自動化方法中，其是指某些反應步驟必需通過手動完成。在本發明的優選實施方案中，包含本發明的MGP(磁性玻璃粒子)的懸浮液被從儲存容器中取出並將部分加入到不同的反應容器中。反應容器可能是由塑料製成最終為包含96或384孔或更多孔的微量滴定板格式的反應管，在孔中可進行反應。然而，這些容器可由其它材料製成，例如鋼。
對於本領域技術人員清楚地是，本發明考慮的某些有機化合物能夠溶解某些塑料材料。因此，當確定適當的儲存容器或反應容器的性質時，本領域技術人員可在有限的顯而易見的試驗中確定最適合進行本發明的方法或生產本發明的試劑盒的材料。
在本發明的優選實施方案中，本發明的試劑盒被用於在研核酸的純化、生物分析或診斷。在本發明的優選實施方案中，本發明的試劑盒或本發明的方法被用於高通量格式中，即，用於允許在非常短的時間分析大量不同樣品的自動化方法中。
本發明的另一個實施方案為測定生物樣品中的核酸存在的方法，其包括以下步驟(a)使生物樣品胞溶；(b)形成組合物，該組合物包含(i)步驟(a)胞溶生物樣品、(ii)緩衝水溶液、(iii)高濃度鹽、(iv)包含式I官能團的與水混溶的非酸性有機化合物 (式I)其中W為碳原子或硫原子，Z為氧原子或氮原子；(c)將步驟(b)的組合物與基材接觸，從而將核酸吸附於基材上；(d)任選地用洗滌液洗具有吸附的核酸的基材；然後，(e)將吸附有核酸的基材與含有鹽的溶液接觸，從而使核酸從基材解吸，該含有鹽的溶液中鹽的濃度低於步驟(a)的組合物中鹽的濃度；和(f)將從基材解吸的核酸與溶液分離；和(g)檢測步驟(f)的溶液中核酸的存在，從而測定核酸的存在。優選地，通過核酸的擴增測定核酸，其通過使用特異引物、特異性檢測探針、和擴增混合物的聚合酶鏈式反應的方式擴增，從而實時監測擴增。同樣優選的是通過使核酸雜交於雜交探針並檢測和/或對雜交體定量化而測定核酸。本領域技術人員知道不僅核酸可作為雜交探針，而且可以使用包含一種或多種核苷類似物的核酸。另外，本領域已知核酸類似物如PNA能夠與核酸形成可檢測的雜交體。可以理解，要被檢測的核酸為DNA或RNA。非常優選的是上述方法，其中核酸為RNA以及步驟(g)包括(i)使RNA逆轉錄形成cDNA，(ii)隨後通過聚合酶鏈式反應的方式擴增cDNA，(iii)檢測cDNA的存在，從而測定核酸的存在。
本發明的發明人同樣發現，與水混溶的環狀二醚是適合於實施本發明的方法的非酸性有機化合物。
因此，本發明的另一個實施方案為純化核酸的方法，其包括以下步驟a)將核酸從組合物吸附於基材上，所述組合物包含(i)緩衝水溶液、(ii)高濃度鹽、(iii)與水混溶的環狀二醚、和(iv)核酸；b)任選地用洗滌液洗具有吸附的核酸的基材；然後，c)將吸附有核酸的基材與含有鹽的溶液接觸，從而使核酸從基材解吸，該含有鹽的溶液中鹽的濃度低於步驟(a)的組合物中鹽的濃度，和d)將從基材解吸的核酸與溶液分離，從而純化核酸；和任選地(e)使解吸核酸從步驟(d)的溶液中沉澱並分離沉澱的核酸，從而進一步純化核酸。優選地，與水混溶的環狀二醚是二氧雜環己烷。
優選地，步驟(a)的組合物包含1到50體積百分數的與水混溶的環狀二醚。更優選地，步驟(a)的組合物包含2到35體積百分數的與水混溶的環狀二醚。更優選地，步驟(a)的組合物包含3到30體積百分數的與水混溶的環狀二醚。非常優選地，步驟(a)的組合物包含約4體積百分數的與水混溶的環狀二醚。非常優選地，步驟(a)的組合物包含約15體積百分數的與水混溶的環狀二醚。非常優選地，步驟(a)的組合物包含約25體積百分數的與水混溶的環狀二醚。
優選地，步驟(a)的組合物中的鹽為離液鹽，其濃度為1到8M。更優選地，所述離液鹽選自高氯酸鈉、鹽酸胍、硫氰酸胍、異硫氰酸胍、和碘化鈉。
同樣優選地，步驟(a)的組合物中鹽濃度為1到10M，並且所述鹽選自氯化鋰、氯化鈉、氯化鉀、醋酸鈉、脲、及其混合物。
優選地，洗滌液包含與水混溶的環狀二醚。更優選地，洗滌液包含1到50體積百分數的與水混溶的環狀二醚。更優選地，洗滌液包含2到35體積百分數的與水混溶的環狀二醚。更優選地，洗滌液包含3到30體積百分數的與水混溶的環狀二醚。非常優選地，洗滌液包含約4體積百分數的與水混溶的環狀二醚。非常優選地，洗滌液包含約15體積百分數的與水混溶的環狀二醚。非常優選地，洗滌液包含約25體積百分數的與水混溶的環狀二醚。
優選地，基材包括多孔或無孔無機物基材，其選自矽膠、玻璃纖維、石英纖維、和沸石。同樣優選地，基材包括多孔或無孔無機物基材，其選自金屬氧化物，和/或金屬混合的氧化物、氧化鋁、二氧化鈦、氧化鋯、和主要由玻璃組成的材料。同樣優選粒度為0.1μm到1,000μm的無機物基材。同樣優選當使用時，多孔的無機物載體材料的孔徑大小為2到1,000nm。更優選地，多孔或無孔載體材料，特別是沸石，為疏鬆填充的形式。更優選地，無機物基材由玻璃形式的濾板、石英或陶瓷濾板、和/或包含矽膠的膜、和/或無機物載體的粒子或纖維和石英或玻璃棉的織物組成。同樣優選地，基材包括可被磁吸引的粒子。更優選地，可被磁吸引的粒子塗有選自矽膠、玻璃、石英、和沸石的無機物基材。更優選地，基材包括塗有玻璃的可被磁吸引的粒子。
本發明的另一個實施方案為將核酸吸附於基材上的方法，其包括以下步驟a)提供包含高濃度鹽和與水混溶的環狀二醚的核酸水溶液；和b)將步驟(a)的水溶液加入基材。優選地，與水混溶的環狀二醚是二氧雜環己烷。
優選地，步驟(a)的水溶液包含1到50體積百分數的與水混溶的環狀二醚。更優選地，步驟(a)的水溶液包含2到35體積百分數的與水混溶的環狀二醚。更優選地，步驟(a)的水溶液包含3到30體積百分數的與水混溶的環狀二醚。非常優選地，步驟(a)的水溶液包含約4體積百分數的與水混溶的環狀二醚。非常優選地，步驟(a)的水溶液包含約15體積百分數的與水混溶的環狀二醚。非常優選地，步驟(a)的水溶液包含約25體積百分數的與水混溶的環狀二醚。
優選地，步驟(a)的水溶液中的鹽為離液鹽，其濃度為1到8M。更優選地，所述離液鹽選自高氯酸鈉、鹽酸胍、硫氰酸胍、異硫氰酸胍、和碘化鈉。
同樣優選地，步驟(a)的水溶液中的鹽濃度為1到10M，並且所述鹽選自氯化鋰、氯化鈉、氯化鉀、醋酸鈉、脲、及其混合物。
優選地，基材包括多孔或無孔無機物基材，其選自矽膠、玻璃纖維、石英纖維、和沸石。同樣優選地，基材包括多孔或無孔無機物基材，其選自金屬氧化物，和/或金屬混合的氧化物、氧化鋁、二氧化鈦、氧化鋯、和主要由玻璃組成的材料。同樣優選粒度為0.1μm到1,000μm的無機物基材。同樣優選當使用時，多孔的無機物載體材料的孔徑大小為2到1,000nm。更優選地，多孔或無孔載體材料，特別是沸石，為疏鬆填充的形式。更優選地，無機物基材由玻璃形式的濾板、石英或陶瓷濾板、和/或包含矽膠的膜、和/或無機物載體的粒子或纖維和石英或玻璃棉的織物組成。同樣優選地，基材包括可被磁吸引的粒子。更優選地，可被磁吸引的粒子塗有選自矽膠、玻璃、石英、和沸石的無機物基材。更優選地，基材包括塗有玻璃的可被磁吸引的粒子。
本發明的另一個實施方案為將核酸吸附於基材上的方法，其包括以下步驟(a)提供包含高濃度鹽的核酸水溶液；(b)提供粉狀材料形式的基材；(c)提供與水混溶的環狀二醚；(d)將步驟(b)的基材分散在步驟(c)的與水混溶的環狀二醚中形成所述基材的懸浮液；和(e)將步驟(a)的水溶液與步驟(d)的懸浮液混合。優選地，與水混溶的環狀二醚為二氧雜環己烷。
優選地，步驟(e)的組合物包含1到50體積百分數的與水混溶的環狀二醚。更優選地，步驟(e)的組合物包含2到35體積百分數的與水混溶的環狀二醚。更優選地，步驟(e)的組合物包含3到30體積百分數的與水混溶的環狀二醚。非常優選地，步驟(e)的組合物包含約4體積百分數的與水混溶的環狀二醚。非常優選地，步驟(e)的組合物包含約15體積百分數的與水混溶的環狀二醚。非常優選地，步驟(e)的組合物包含約25體積百分數的與水混溶的環狀二醚。
優選地，步驟(e)的組合物中的鹽為離液鹽，其濃度為1到8M。更優選地，所述離液鹽選自高氯酸鈉、鹽酸胍、硫氰酸胍、異硫氰酸胍、和碘化鈉。
同樣優選地，步驟(e)的組合物中鹽濃度為1到10M，並且所述鹽選自氯化鋰、氯化鈉、氯化鉀、醋酸鈉、脲、及其混合物。
優選地，基材包括粉狀多孔或無孔無機物基材，其選自矽膠、玻璃、石英、和沸石。同樣優選地，基材包括粉狀多孔或無孔無機物基材，其選自金屬氧化物，和/或金屬混合的氧化物、氧化鋁、二氧化鈦、氧化鋯、和主要由玻璃組成的材料。同樣優選基材包括可被磁吸引的粒子。更優選地，可被磁吸引的粒子塗有選自矽膠、玻璃、石英、和沸石的無機物基材。更優選地，基材包括塗有玻璃的可被磁吸引的粒子。
本發明的另一個實施方案為包含粉狀材料形式的基材的懸浮液，該基材分散在與水混溶的環狀二醚中。優選地，與水混溶的環狀二醚為二氧雜環己烷。
優選地，基材包括粉狀多孔或無孔無機物基材，其選自矽膠、玻璃、石英、和沸石。同樣優選地，基材包括粉狀多孔或無孔無機物基材，其選自金屬氧化物，和/或金屬混合的氧化物、氧化鋁、二氧化鈦、氧化鋯、和主要由玻璃組成的材料。同樣優選基材包括可被磁吸引的粒子。更優選地，可被磁吸引的粒子塗有選自矽膠、玻璃、石英、和沸石的無機物基材。更優選地，基材包括塗有玻璃的可被磁吸引的粒子。
本發明的另一個實施方案為與水混溶的環狀二醚在實施本文所述的本發明的方法中的應用。優選地，環狀二醚為二氧雜環己烷。
本發明的另一個實施方案為使用與水混溶的環狀二醚用於製備懸浮液，其通過將基材分散在所述與水混溶的環狀二醚中形成所述基材的懸浮液。優選地，環狀二醚為二氧雜環己烷。
優選地，基材包括粉狀多孔或無孔無機物基材，其選自矽膠、玻璃、石英、和沸石。同樣優選地，基材包括粉狀多孔或無孔無機物基材，其選自金屬氧化物，和/或金屬混合的氧化物、氧化鋁、二氧化鈦、氧化鋯、和主要由玻璃組成的材料。同樣優選基材包括可被磁吸引的粒子。更優選地，可被磁吸引的粒子塗有選自矽膠、玻璃、石英、和沸石的無機物基材。更優選地，基材包括塗有玻璃的可被磁吸引的粒子。
本發明的另一個實施方案為使用上述本發明的懸浮液用於實施本文所述的本發明的方法。
本發明的另一個實施方案為各組件的試劑盒，其包含(a)緩衝鹽和離液鹽的濃儲備液，離液鹽選自高氯酸鈉、鹽酸胍、硫氰酸胍、異硫氰酸胍、和碘化鈉；(b)二氧雜環己烷；(c)緩衝溶液；和(d)色譜材料和過濾材料。
本發明的另一個實施方案為各組件的試劑盒，其包括(a)緩衝鹽和選自氯化鋰、氯化鈉、氯化鉀、醋酸鈉、脲、及其混合物的鹽的濃儲備液；(b)二氧雜環己烷；(c)緩衝溶液；和(d)色譜材料和過濾材料。
本發明的另一個實施方案為各組件的試劑盒，其包括(a)緩衝鹽和離液鹽的濃儲備液，離液鹽選自高氯酸鈉、鹽酸胍、硫氰酸胍、異硫氰酸胍、和碘化鈉；(b)上述本發明的在二氧雜環己烷中的懸浮液；(c)緩衝溶液。
本發明的另一個實施方案為各組件的試劑盒，其包括(a)緩衝鹽和選自氯化鋰、氯化鈉、氯化鉀、醋酸鈉、脲、及其混合物的鹽的濃儲備液；(b)上述本發明的在二氧雜環己烷中的懸浮液；(c)緩衝溶液。
提供以下實施例、參考文獻、和附圖以幫助理解本發明，本發明的真正保護範圍在附加的權利要求書中闡述。可以理解可對所述過程中進行修飾，而不脫離本發明的精神實質。


圖1a使用MagNA Pure System(Roche Diagnostics GmbH，Mannheim)的各方案和試劑盒從8倍複製的106海拉細胞分離RNA。對於這些分離，將MGP(磁性玻璃粒子)再懸浮於水中或N-甲基-2-吡咯烷酮(NMP)中。然後在瓊脂糖凝膠上分析具有純化RNA的洗脫液。道次1-8，即使用再懸浮於水中的MGP的RNA製劑，其帶非常弱，並幾乎不能重現。M表示尺寸標記。道次9-16表示使用再懸浮於NMP中的MGP的製劑得到的RNA帶。
圖1b使用MagNA Pure System(Roche Diagnostics GmbH，Mannheim；目錄號碼3186229)的各方案和試劑盒從4倍複製的106海拉細胞分離RNA。對於這些分離，將MGP(磁性玻璃粒子)再懸浮於異丙醇中或N-甲基-2-吡咯烷酮(NMP)中。然後在瓊脂糖凝膠上分析具有純化RNA的洗脫液。
圖2使用MagNA Pure System(Roche Diagnostics GmbH，Mannheim；目錄號碼3186229)的各方案和試劑盒從8倍複製的1ml血液中分離DNA。對於這些分離，將MGP(磁性玻璃粒子)再懸浮於異丙醇中或N-甲基-2-吡咯烷酮或水中。然後在瓊脂糖凝膠上分析具有純化DNA的洗脫液。
圖3a、3bTaqMan PCR過程中的螢光信號。X軸表示PCR周期的數目，Y軸為檢測器測得的以[mV]為單位的螢光信號。「R300」曲線反映了由淨化水中10,000拷貝陽性對照靶RNA得到的信號。「R30」曲線反映了由淨化水中1,000拷貝陽性對照靶RNA得到的信號。另外的曲線為「NMP」(1-甲基-2-吡咯烷酮)、「PC」(異丙二醇碳酸酯)、「yBL」(γ-丁內酯)、和「noBC」(沒有加入結合調節劑)的曲線。
具體實施例方式
實施例1使用玻璃纖維分離DNA用100μl的蛋白酶K溶液(Roche Id.No.745723，90mg溶解於4.5毫升水中)和1,200μl離液結合緩衝溶液(6M鹽酸胍，10mMTrisHCl，20％ Triton X 100 pH4.4)在70℃培養得自健康供體的1,000μl全血10分鐘。
加入500μl的(a)異丙醇、(b)乙腈、(c)二甲亞碸或(d)甲基乙基酮之後，將胞溶產物轉移到玻璃纖維濾管(濾管取自Macherey undNagel Cat.No.740 954.20的試劑盒)中。以1,900xg離心3分鐘之後，棄去流通液(flowthrough)並將濾管放在接收管上。將2,000μl高離子抑制劑清除緩衝溶液(5M鹽酸胍，20mMTris，60％乙醇，pH6.6)移液於玻璃纖維過濾器上並以3,000xg離心1分鐘。然後用2,000μl洗滌緩衝溶液(20mMNaCl，2mMTrisHCl，80％乙醇，pH 7.5)的兩個洗滌步驟並以3,000xg離心5分鐘。棄去流通液。使用新的接收管。DNA的洗脫使用300μl 70℃的熱Tris緩衝溶液(10mM，pH8.5)完成。培養5分鐘之後，試管以3,000xg離心5分鐘。
分離的DNA的分析由使用標準光度計從OD260nm測量結果計算DNA收率。通過計算OD260/280nm的比例評價純度。結果(n＝2)如表1中所示。
表1從1,000μl全血分離DNA

實施例2在MagNA Pure LC儀器上分離RNA將106海拉細胞(體積200μl)直接轉移到MagNA Pure LC儀器(RocheDiagnostics GmbH，Mannheim)的樣品筒。從軟體選擇各個方案，將必要的塑料一次用品和試劑盒試劑安裝在工作站上，並開始自動化的RNA分離。然後MagNA Pure LC儀器自動地進行所有的分離和純化步驟，如用特定的胞溶/結合緩衝溶液使細胞胞溶、用蛋白酶K的酶促蛋白質消化、用脫氧核糖核酸酶I的酶促DNA消化、RNA與磁性玻璃粒子(MGP)的結合、幾個洗滌步驟以除去未結合物質和雜質、純RNA在特定洗脫緩衝溶液中的洗脫和最後將洗脫液轉移到冷卻的儲存筒中。
當分析非酸性有機化合物如N-甲基-2-吡咯烷酮在核酸分離過程中的性能時，將乾燥的MGP懸浮在適當體積的各個非酸性有機化合物中，並將懸浮液與MagNA Pure試劑盒(Roche Diagnostics GmbH，Mannheim)的所有其它試劑一起用於MagNA Pure LC儀器。
與水相比，發現當使用N-甲基-2-吡咯烷酮製備磁性玻璃粒子的懸浮液時，RNA收率更高。與異丙醇相比，發現當使用N-甲基-2-吡咯烷酮製備磁性玻璃粒子的懸浮液時，RNA收率相等或更高。
表2從106海拉細胞分離RNA(也參見圖1a、圖1b)

結果也在圖1a(i、ii)和1b(iii、iv)表示。
實施例3在MagNA Pure LC儀器上分離DNA將人血(1ml)直接轉移到MagNA Pure LC儀器(Roche DiagnosticsGmbH，Mannheim)的樣品筒。從軟體選擇各個方案，將必要的塑料一次用品和試劑盒試劑安裝在工作站上，並開始DNA的自動化分離。然後MagNA Pure LC儀器自動地進行所有的分離和純化步驟，如用特定的胞溶/結合緩衝溶液使細胞胞溶、用蛋白酶K的酶促蛋白質消化、DNA與磁性玻璃粒子(MGP)的結合、幾個洗滌步驟以除去未結合的物質和雜質、純DNA在特定洗脫緩衝溶液中的洗脫和最後將洗脫液轉移到冷卻的儲存筒中。
當分析非酸性有機化合物如N-甲基-2-吡咯烷酮在核酸分離過程中的性能時，將乾燥的MGP懸浮在適當體積的各個非酸性有機化合物中，並將懸浮液與MagNA Pure試劑盒(Roche Diagnostics GmbH，Mannheim)的所有其它試劑一起用於MagNA Pure LC儀器。
對分離的DNA的分析在1％瓊脂糖凝膠上檢查分離的DNA的完整性，用溴化3，8-二氨基-5-乙基-6-苯基菲啶鎓與分子量標記物III(Roche DiagnosticsGmbH，Mannheim)一起染色。使用標準光度計從OD260hm的測量結果計算DNA收率。通過計算OD260/280nm的比例評價純度。為保證使用MagNA Pure方案和N-甲基-2-吡咯烷酮或其它非酸性有機化合物分離的DNA可被擴增，使用如LightCycler Factor V Mutation DetectionKit或LightCycler Her2neu DNA Quantification Kit(都來自RocheDiagnostics GmbH，Mannheim)對所有樣品在LightCycler儀器上進行PCR。在所有情況中擴增都獲得成功。
表3從1,000μl全血分離DNA(也參見圖2)

使用N-甲基-2-吡咯烷酮得到的DNA收率與異丙醇相同，使用水得到的收率低得多。圖2說明了這些結果。
實施例4
從血清樣品分離RNA胞溶和調節得自健康患者的200μl體積的血清與20μl的蛋白酶K溶液(酶活性6,000 U/ml，沒有脫氧核糖核酸酶和核糖核酸酶活性)混和並在37℃培養5分鐘。隨後，將600μl的胞溶緩衝溶液與經過蛋白酶K處理的樣品混和，得到胞溶溶液。胞溶緩衝溶液包含溶解於水中的以下化合物表4

隨後，向胞溶溶液加入380μl結合調節劑，並混和，得到吸附液。使用100％的γ-丁內酯(CAS 96-48-0)、100％的異丙二醇碳酸酯(CAS108-32-7)或100％的1-甲基-2-吡咯烷酮(CAS 872-50-4)作為結合調節劑。
吸附於固相將第一個600μl試樣量的經過調節的胞溶溶液轉移到具有玻璃羊毛狀物作為固相的市售自旋柱中。優選地，使用得自High Pure PCRTemplate Preparation Kit(Roche Diagnostics GmbH，Mannheim，Germany，目錄編號1796828)的High Pure Spin Filter管作為自旋柱。具有第一個600μl試樣量的自旋柱以4,300xg離心1分鐘。然後將第二個試樣量轉移到相同的自旋柱並在相同條件下重複離心步驟。
洗滌洗滌柱三次，每次使用150μl的洗滌緩衝溶液。洗滌緩衝溶液包含溶解於水中的以下化合物
表5

對於前兩個洗滌步驟，將洗滌緩衝溶液轉移到自旋柱並以4,300xg離心1分鐘。第三個洗滌步驟有所改變，柱以13,200xg離心3分鐘。
代替通過離心(第三個洗滌步驟，參見上面)的方式除去洗滌緩衝溶液，固相可選地在65℃下乾燥10分鐘。
洗脫對於這個步驟，使用包含溶解於水中的以下化合物的洗脫緩衝溶液表6

將150μl的洗脫緩衝溶液轉移到自旋柱，並以4,300xg自旋柱1分鐘。收集洗脫液用於進一步分析。
實施例5RNA分析如實施例4所述處理攙入10,000拷貝的陽性對照靶RNA(純化的C型肝炎病毒RNA)的血清樣品。洗脫液中靶RNA的含量通過TaqManPCR使用Roche HCV檢測試劑盒測定。
對於回收率(＝處理之後的量/處理之前的量)的計算，使用標準樣品運行檢測過程。圖3a和3b表示相當於10,000拷貝的「R300」曲線(即300％回收率)，和相當於1,000拷貝的「R30」曲線(即30％回收率)。
圖3a和3b表示典型實驗的結果。而沒有結合調節劑(「noBC」)的對照實驗得到非常低的回收率(沒有發現靶)，加入結合調節劑(「NMP」N-甲基-2-吡咯烷酮、「PC」異丙二醇碳酸酯、或「gBL」γ-丁內酯)得到針對對照RNA高於50％的回收率。
將雜質留在洗脫液中的樣品製備過程可損害TaqMan PCR方法過程中形成的信號。因此，監測信號形成以評價RNA製備的質量/純度。上個PCR周期之後的螢光信號值作為測量值。作為參考，使用潔淨陽性對照RNA(與攙入血清的RNA相同)在純水中的已知量。圖3a和3b說明典型實驗的結果。而在沒有結合調節劑(主要由於沒有回收)的製備中螢光信號的形成是可忽略不計的，加入結合調節劑導致信號形成的改善，其可與用純靶發現的信號形成相當。
實施例6樣品處理時間來自醫院並且其中樣品具有升高的甘油三酯值的樣品根據以下方案處理750μl體積的血清與75μl蛋白酶K溶液(酶活性6,000U/ml，沒有脫氧核糖核酸酶和核糖核酸酶活性)在37℃培養5分鐘。然後，加入1,405μl體積的胞溶緩衝溶液(根據表4)並混合。隨後，加入880μlγ-丁內酯或880μl96％乙醇並混合，得到兩種不同類型吸附液。
在+1巴的恆壓下使每個吸附液通過包含直徑為5mm和厚度為1mm的玻璃纖維羊毛狀物(得自Roche「High Pure」試劑盒)的柱裝置處理。測量全部體積通過裝置所需的時間(也稱為「結合時間」)。結果總結在表7中。
表7

*認為是正常的，**升高的甘油三酯值參考文獻Abramson，R.D.，和Myers，T.W.，Curr.Opin.Biotechnol.4(1993)41-47Alderton，R.P.等人，Anal.Biochem.201(1992)166-169Ausubel等人，Current Protocols in Molecular Biology，J.Wiley and Sons，NY，1987Barany，F.，PCR Methods and Applic.1(1991)5-16Barany，F.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88(1991)189-193Boom，R.等人，J.Clin.Microbiol.28(1990)495-503DE 3724442EP 0439182A2EP 0658164Guatelli，J.C.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87(1990)1874-1878Jakobi，R.等人，Anal.Biochem.175(1988)196-201Kwoh，D.Y.等人，Proc.Natl.Acad.Sci，USA 86(1989)1173-1177Marko，M.A等人，Anal.Biochem.121(1982)382-387Sambrook，Fritsch Maniatis，Molecular Cloning,A Laboratory Manual，第3版，CSHLPress，2001US 4,683,195US 5,130,238US 5,210,015US 5,487,972US 5,804,375Vogelstein，B.，和Gillespie，D.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 76(1979)615-619Whelen，A.C.，和Persing，D.H.，Annu.Rev.Microbiol.50(1996WO 01/37291WO 90/01069WO 91/00212WO 92/02638WO 92/08800WO 99/16781Wu，D.Y.，和Wallace，R.B.，Genomics 4(1989)560-569Yamada，O.等人，J.Virol.Methods 27(1990)203-209
權利要求
1.純化核酸的方法，其包括以下步驟(a)將核酸從組合物吸附於基材上，所述組合物含有(i)緩衝水溶液，(ii)高濃度鹽，(iii)包含式I官能團的與水混溶的非酸性有機化合物 (式I)其中W為碳原子或硫原子，和Z為氧原子或氮原子，和(iv)核酸；(b)任選地用洗滌液洗滌吸附有核酸的基材，然後，(c)將吸附有核酸的基材與含有鹽的溶液接觸，從而使核酸從基材解吸，該含有鹽的溶液中鹽的濃度低於步驟(a)的組合物中鹽的濃度，和(d)將含有解吸核酸的溶液與基材分離，從而純化核酸，和任選地(e)使解吸核酸從步驟(d)的溶液中沉澱並分離沉澱的核酸，從而進一步純化核酸。
2.權利要求1的方法，其特徵在於所述官能團選自氧代基、硫氧代基、氰基、和氨基甲醯基官能或醯胺中的但不屬於羧基官能的羰基。
3.權利要求2的方法，其特徵在於與水混溶的非酸性有機化合物選自丙酮、乙醯丙酮、乙腈、二甲亞碸、二乙酮、甲基乙基酮、甲基丙基酮、異丁基甲基酮、γ-丁內酯、γ-戊內酯、異丙二醇碳酸酯、和N-甲基-2-吡咯烷酮。
4.權利要求1到3中任一項的方法，其特徵在於步驟(a)的組合物包含1到50體積百分數的與水混溶的非酸性有機化合物。
5.權利要求4的方法，其特徵在於步驟(a)的組合物包含3到30體積百分數的與水混溶的非酸性有機化合物。
6.權利要求1到5中任一項的方法，其特徵在於步驟(a)的組合物中的鹽為離液鹽，其濃度為1到8M，並且所述離液鹽選自高氯酸鈉、鹽酸胍、硫氰酸胍、異硫氰酸胍、和碘化鈉。
7.權利要求1到5中任一項的方法，其特徵在於步驟(a)的組合物中鹽濃度為1到10M，並且所述鹽選自氯化鋰、氯化鈉、氯化鉀、醋酸鈉、脲、及其混合物。
8.權利要求1到7中任一項的方法，其特徵在於步驟(b)的洗滌液包含與水混溶的非酸性有機化合物。
9.權利要求8的方法，其特徵在於步驟(b)的洗滌液包含1到100體積百分數的與水混溶的非酸性有機化合物。
10.權利要求1到9中任一項的方法，其特徵在於基材包括選自矽膠、玻璃纖維、石英纖維和沸石的多孔或無孔無機物基材。
11.權利要求1到9中任一項的方法，其特徵在於基材包括塗有玻璃的可被磁吸引的粒子。
12.將核酸吸附於基材上的方法，其包括以下步驟(a)提供核酸的水溶液，該水溶液包含高濃度的鹽和與水混溶的非酸性有機化合物，該有機化合物包含式I官能團 (式I)其中W為碳原子或硫原子，Z為氧原子或氮原子，和所述官能團選自氧代基、硫氧代基、氰基、和氨基甲醯基官能或醯胺中的但不屬於羧基官能的羰基，和與水混溶的非酸性有機化合物選自丙酮、乙醯丙酮、乙腈、二甲亞碸、二乙酮、甲基乙基酮、甲基丙基酮、異丁基甲基酮、γ-丁內酯、γ-戊內酯、異丙二醇碳酸酯、和N-甲基-2-吡咯烷酮；然後(b)將步驟(a)的水溶液加到基材上。
13.權利要求12的方法，其特徵在於步驟(a)的水溶液包含1到50體積百分數的與水混溶的非酸性有機化合物。
14.權利要求13的方法，其特徵在於步驟(a)的水溶液包含3到30體積百分數的與水混溶的非酸性有機化合物。
15.權利要求12到14中任一項的方法，其特徵在於步驟(a)的水溶液中的鹽為離液鹽，其濃度為1到8M，並且所述離液鹽選自高氯酸鈉、鹽酸胍、硫氰酸胍、異硫氰酸胍、和碘化鈉。
16.權利要求12到14中任一項的方法，其特徵在於步驟(a)的水溶液中的鹽濃度為1到10M，並且所述鹽選自氯化鋰、氯化鈉、氯化鉀、醋酸鈉、脲、及其混合物。
17.權利要求12到16中任一項的方法，其特徵在於基材包括選自矽膠、玻璃纖維、石英纖維、和沸石的多孔或無孔無機物基材。
18.權利要求12到16中任一項的方法，其特徵在於基材包括塗有玻璃的可被磁吸引的粒子。
19.將核酸吸附於基材上的方法，其包括以下步驟(a)提供包含高濃度鹽的核酸水溶液；(b)提供粉狀材料形式的基材；(c)提供包含式I官能團的與水混溶的非酸性有機化合物， (式I)其中W為碳原子或硫原子，Z為氧原子或氮原子，和步驟(c)的與水混溶的非酸性有機化合物的所述官能團選自氧代基、硫氧代基、氰基、和氨基甲醯基官能或醯胺中的但不屬於羧基官能的羰基，和步驟(c)的與水混溶的非酸性有機化合物選自丙酮、乙醯丙酮、乙腈、二甲亞碸、二乙酮、甲基乙基酮、甲基丙基酮、異丁基甲基酮、γ-丁內酯、γ-戊內酯、異丙二醇碳酸酯、和N-甲基-2-吡咯烷酮；然後(d)將步驟(b)的基材分散在步驟(c)的與水混溶的非酸性有機化合物中形成所述基材的懸浮液；和(e)將步驟(a)的水溶液與步驟(d)的懸浮液混合。
20.權利要求19的方法，其特徵在於步驟(e)的組合物包含1到50體積百分數的與水混溶的非酸性有機化合物。
21.權利要求20的方法，其特徵在於步驟(e)的組合物包含3到30體積百分數的與水混溶的非酸性有機化合物。
22.權利要求19到21中任一項的方法，其特徵在於步驟(a)的水溶液中的鹽為離液鹽，其濃度為1到8M，並且所述離液鹽選自高氯酸鈉、鹽酸胍、硫氰酸胍、異硫氰酸胍、和碘化鈉。
23.權利要求19到21中任一項的方法，其特徵在於步驟(e)的組合物中的鹽濃度為1到10M，並且所述鹽選自氯化鋰、氯化鈉、氯化鉀、醋酸鈉、脲、及其混合物。
24.權利要求19到23中任一項的方法，其特徵在於基材包括選自矽膠、玻璃、石英、和沸石的粉狀多孔或無孔無機物基材。
25.權利要求19到24中任一項的方法，其特徵在於基材包括塗有玻璃的可被磁吸引的粒子。
26.包含粉狀材料形式的基材的懸浮液，所述基材分散在包含式I官能團的與水混溶的非酸性有機化合物中 (式I)其中W為碳原子或硫原子，Z為氧原子或氮原子，和所述官能團選自氧代基、硫氧代基、氰基、和氨基甲醯基官能或醯胺中的但不屬於羧基官能的羰基，和與水混溶的非酸性有機化合物選自丙酮、乙醯丙酮、乙腈、二甲亞碸、二乙酮、甲基乙基酮、甲基丙基酮、異丁基甲基酮、γ-丁內酯、γ-戊內酯、異丙二醇碳酸酯、和N-甲基-2-吡咯烷酮。
27.權利要求26的懸浮液，其特徵在於基材包括選自矽膠、玻璃、石英和沸石的粉狀多孔或無孔無機物基材。
28.權利要求26到27中任一項的懸浮液，其特徵在於基材包括塗有玻璃的可被磁吸引的粒子。
29.包含式I官能團的與水混溶的非酸性有機化合物在實施權利要求1到25中任一項的方法中的應用， (式I)其中W為碳原子或硫原子，Z為氧原子或氮原子，和所述官能團選自氧代基、硫氧代基、氰基、和氨基甲醯基官能或醯胺中的但不屬於羧基官能的羰基，和與水混溶的非酸性有機化合物選自丙酮、乙醯丙酮、乙腈、二甲亞碸、二乙酮、甲基乙基酮、甲基丙基酮、異丁基甲基酮、γ-丁內酯、γ-戊內酯、異丙二醇碳酸酯、和N-甲基-2-吡咯烷酮。
30.權利要求26到28中任一項的懸浮液在實施權利要求19到25中任一項的方法中的應用。
31.各組件的試劑盒，其包括(a)緩衝鹽和離液鹽的濃儲備液，離液鹽選自高氯酸鈉、鹽酸胍、硫氰酸胍、異硫氰酸胍、和碘化鈉；(b)選自丙酮、乙醯丙酮、乙腈、二甲亞碸、二乙酮、甲基乙基酮、甲基丙基酮、異丁基甲基酮、γ-丁內酯、γ-戊內酯、異丙二醇碳酸酯、和N-甲基-2-吡咯烷酮的與水混溶的非酸性有機化合物；(c)緩衝溶液；和(d)色譜材料和過濾材料。
32.各組件的試劑盒，其包括(a)緩衝鹽和選自氯化鋰、氯化鈉、氯化鉀、醋酸鈉、脲、及其混合物的鹽的濃儲備液；(b)選自丙酮、乙醯丙酮、乙腈、二甲亞碸、二乙酮、甲基乙基酮、甲基丙基酮、異丁基甲基酮、γ-丁內酯、γ-戊內酯、異丙二醇碳酸酯、和N-甲基-2-吡咯烷酮的與水混溶的非酸性有機化合物；(c)緩衝溶液；和(d)色譜材料和過濾材料。
33.各組件的試劑盒，其包括(a)緩衝鹽和離液鹽的濃儲備液，離液鹽選自高氯酸鈉、鹽酸胍、硫氰酸胍、異硫氰酸胍、和碘化鈉；(b)權利要求26到28中任一項的懸浮液；(c)緩衝溶液。
34.各組件的試劑盒，其包括(a)緩衝鹽和選自氯化鋰、氯化鈉、氯化鉀、醋酸鈉、脲、及其混合物的鹽的濃儲備液；(b)權利要求26到28中任一項的懸浮液；(c)緩衝溶液。
35.測定生物樣品中核酸的存在的方法，其包括以下步驟(a)使生物樣品胞溶；(b)形成組合物，該組合物包含(i)步驟(a)的胞溶生物樣品，(ii)緩衝水溶液，(iii)高濃度鹽，(iv)包含式I官能團的與水混溶的非酸性有機化合物， (式I)其中W為碳原子或硫原子，和Z為氧原子或氮原子；(c)將步驟(b)的組合物與基材接觸，從而將核酸吸附於基材上；(d)任選地用洗滌液洗滌吸附有核酸的基材；然後(e)將吸附有核酸的基材與舍有鹽的溶液接觸，從而使核酸從基材解吸，該含有鹽的溶液中鹽的濃度低於步驟(a)的組合物中鹽的濃度；和(f)將含有解吸核酸的溶液與基材分離，和(g)檢測步驟(f)的溶液中核酸的存在，從而測定核酸的存在。
36.權利要求35的方法，其特徵在於核酸為RNA或DNA。
37.權利要求35和36中任一項的方法，其特徵在於核酸為RNA，步驟(g)包括(i)使RNA逆轉錄形成cDNA，(ii)隨後通過聚合酶鏈式反應擴增cDNA，(iii)檢測cDNA的存在，從而測定核酸的存在。
全文摘要
本發明要解決的問題是提供可供選擇的使用在含水吸附液中的可供選擇的物質用於核酸的色譜純化的方法，目的在於促進核酸與基材如無機物載體結合。本發明提供了純化核酸的方法，其包括以下步驟(a)將核酸從組合物吸附於基材上，所述組合物包含(i)緩衝水溶液、(ii)高濃度鹽、(iii)與水混溶的非酸性有機化合物、和(iv)核酸；(b)任選地用洗滌液洗滌吸附有核酸的基材；然後，(c)將吸附有核酸的基材與含有鹽的溶液接觸，從而使核酸從基材解吸，該含有鹽的溶液中鹽的濃度低於步驟(a)的組合物中鹽的濃度；和(d)將含有解吸核酸的溶液與基材分離，從而純化核酸；和任選地(e)使解吸核酸從步驟(d)的溶液中沉澱並分離沉澱的核酸，從而進一步純化核酸。
文檔編號C12Q1/68GK1616477SQ20041008358
公開日2005年5月18日 申請日期2004年10月13日 優先權日2003年10月13日
發明者F·貝格曼, M·柯西格澤, T·瓦爾特, K·魏因德爾, R·齊倫斯基, E·薩洛芬 申請人:霍夫曼-拉羅奇有限公司