細胞因子誘導材料和細胞因子誘導裝置的製作方法
2023-05-28 20:36:36 2
專利名稱：細胞因子誘導材料和細胞因子誘導裝置的製作方法
技術領域：
本發明涉及細胞因子誘導材料和用於細胞因子誘導治療等的裝置，更具體而言，涉及可以有效地誘導細胞因子的細胞因子誘導材料及裝置。
背景技術：
細胞因子是一種用於各種細胞信號轉導的多種因子的一般性術語。細胞因子的實例包括幹擾素-α，幹擾素-β，幹擾素-γ(IFN-γ)，白介素1，白介素18，腫瘤壞死因子-α(Tumor Necrosis Factor-α，TNF-α)，腫瘤壞死因子-β(Tumor Necrosis Factor-β)，轉化生長因子-α(Transforming GrowthFactor-α)，轉化生長因子-β(Transforming Growth Factor-β，TGF-β)和各種細胞生長因子(Special 1995 number of Clinical Immunity Vol.27，「All aboutcytokines」，Kagaku Hyoron-sha，Clinical Immunity Vol.36，39-44，2001)。
已知細胞因子在活體內顯示各種活性並且與各種疾病有關。已經常規地進行細胞因子誘導治療，其引起細胞因子在活體內的活性，由此治療疾病。
在細胞因子誘導治療中，給患者服用細胞因子誘導物，以引起細胞因子在活體內的誘導。已知有各種材料作為用於這種細胞因子誘導治療的誘導細胞因子的材料。已知誘導細胞因子的材料實例包括微生物衍生的材料如OK-432，卡介苗(Bacillus Callete Guerin)(BCG)，苯丁抑制素(Bestatin)，Maruyama疫苗和romurtide，以及擔子菌類衍生的材料如Krestin，蘑菇多糖和sizofiran。
例如，已知OK-432、BCG等誘導從血液中細胞因子如白介素1，和幹擾素-γ(Gifu University Medical Report 43166-177，1995，MolecularMedicine Vol.36，extra edition，220-229，1999)。
儘管可以在活體內誘導細胞因子，但是上述的細胞因子誘導治療難以誘導足夠量的細胞因子，因而難以提供它們強的效力，這是個問題。可以增加細胞因子誘導物的劑量以有效地誘導細胞因子。但是，增加的劑量增大了副作用，導致實現有效治療的失敗。
日本專利公開60-120821描述了一種用於治療惡性瘤的白細胞刺激物，其包含與不溶性載體共價連接的刺激劑。此外，日本專利公開61-277628描述了一種用於治療癌症的白細胞刺激物，其包含與不溶性載體共價連接的白介素1，OK-432，重組白介素2或幹擾素-γ。這些白細胞刺激物誘導腫瘤細胞毒性細胞。這些現有技術的文獻沒有提供對於細胞因子誘導的描述。
發明內容
鑑於上述現有技術的現狀，本發明的一個目的在於提供一種新型的細胞因子誘導材料和細胞因子誘導裝置，其可以相對於常規的細胞因子誘導治療建立更有效的細胞因子誘導治療。
本發明的細胞因子誘導材料含有細胞因子誘導劑和水不溶性的誘導增強劑。
由於下面的發現，本申請的發明人完成了本發明含有細胞因子誘導劑和水不溶性誘導增強劑的、或者包含細胞因子誘導劑固定於其中的不溶性誘導增強劑的細胞因子誘導材料具有誘導明顯大量的細胞因子的能力。
本發明的細胞因子誘導裝置具有容器，和根據本發明構成的並且裝於容器中的細胞因子誘導材料。
以下詳細描述本發明。
儘管沒有限制，但是，本發明中的誘導增強劑包含金屬的、有機的或無機的水不溶性材料。優選誘導增強劑包含水不溶性有機材料，更優選為水不溶性聚合材料。
金屬誘導增強劑的實例包括諸如金，金合金，銀，銀合金，鈦，鈦合金和不鏽鋼的金屬。
無機誘導增強劑的實例包括活性炭，玻璃，玻璃衍生物，二氧化矽基組合物，氧化鋁和羥基磷灰石。
有機或聚合的誘導增強劑的實例包括纖維素，瓊脂糖，葡聚糖，聚苯乙烯類，丙烯酸酯，聚對苯二甲酸乙二醇酯，尼龍，聚乙烯醇類，聚碸，聚醯胺，聚丙烯腈，聚乙烯類，聚氨酯，聚丙烯類和聚酯。
聚苯乙烯類的實例包括二乙烯基苯-苯乙烯共聚物。丙烯酸酯的實例包括聚甲基丙烯酸甲酯和聚甲基丙烯酸羥乙酯。特別優選的是例如基於聚苯乙烯類，丙烯酸酯，尼龍，聚酯，纖維素和聚乙烯醇類的聚合材料。
誘導增強劑是非極性的並且可以是疏水性的。在此情況下，可以將聚苯乙烯基聚合材料用於誘導增強劑。這種誘導增強劑在通過表面修飾或表面塗層時，在其表面可以親水化。
對於誘導增強劑的形狀或形式沒有特別規定。誘導增強劑可以是眾所周知的形式，如纖維，無紡織物，海棉狀物，微粒，薄膜或中空纖維。
如果誘導增強劑是微粒，優選其大小為50μm至2mm，如果是纖維，優選其直徑最大為10μm，更優選最大為5μm。如果選擇纖維形式，優選誘導增強劑包含無紡織物。在此情況下，特別優選組分纖維的直徑最大為3μm。
特別優選誘導增強劑包含白細胞吸附材料。有用的白細胞吸附材料包括例如基於聚苯乙烯類，丙烯酸酯，聚酯，尼龍，纖維素和聚乙烯醇類的和基於纖維素如乙酸纖維素的聚合材料；和玻璃基材料。
還優選用作的誘導增強劑的是給予其表面粗糙度的材料。優選這種材料具有表面不規則性，其規定為中心線平均粗糙度Ra值在0.2μm至10μm範圍內，且不均勻度的平均間距Sm值在5μm至200μm範圍內。
Ra值是指根據JIS B 0601-1982的中心線平均粗糙度。不均勻度的平均間距Sm值定義如下不均勻度的平均間距Sm值最新的JIS對於在高度方向的表面粗糙度信息提供了標準，但對於在平面方向的表面粗糙度信息沒有提供標準。但是，本發明中的不均勻度也可以由平面方向的不規則性的間距確定，這從以下給出的實例將變得清楚。因而，本發明將不均勻度的平均間距Sm值用於規定平面方向的不規則度。
以下給出不均勻度的平均間距Sm值。
首先，在預定的間隔中，繪製上計數水平線C和下計數水平線D，以使如
圖1所示的粗糙度曲線A的中心線B上下定位。當在下計數水平線D穿過粗糙度曲線A的相鄰兩點之間存在上計數水平線C和粗糙度曲線A的一個或多個相交點時，將「峰值」定義為單位峰值。
如圖2所示，在標準長度L存在的每一個峰的中心線長度假定為Smi。然後，不均勻度的平均間距Sm值由下面的等式(1)給出Sm=1ni=1nSmi]]>(n峰的數目)…(1)即，不均勻度的平均間距Sm值是指在標準長度L中存在的峰的間距平均值。同樣，可以由不均勻度的平均間距Sm值確定沿著平面方向的不規則條件。
表面粗糙度歸因於誘導增強劑的孔隙率。例如基於聚苯乙烯類，丙烯酸酯，聚酯，尼龍，纖維素和聚乙烯醇類的多孔聚合材料適宜於用作誘導增強劑。
備選地，表面粗糙度歸因於所使用的纖維形式的材料。纖維的或無紡的材料適宜於用作誘導增強劑。特別優選纖維的或無紡的形式的聚合材料。其實例包括例如由聚苯乙烯類，丙烯酸酯，聚酯，尼龍，纖維素和聚乙烯醇類組成的纖維的和無紡的聚合材料。
如上所述，通過賦予誘導增強劑適宜的表面粗糙度，以Ra值表示的至少為0.2μm，能顯著地提高細胞因子的誘導。白細胞的大小為10μm-20μm。當考慮到這些事實時，優選誘導增強劑的Ra值為0.2μm-10μm。由於所規定的Ra值比白細胞的大小小得多，因此，這種表面粗糙度的細胞因子誘導增強作用似乎不簡單地是由接觸面積的增加而產生的。
細胞因子誘導劑的實例包括細菌及它們的成分如BCG，BCG-CWS，PPD(純化的蛋白質衍生物結核菌素)，奴卡氏菌屬-CWS，OK-432和胞壁醯二肽；多糖如PSK(Klestin)，蘑菇多糖和sizofiran；聚合物如多聚肌苷酸多聚胞苷酸(poly IC)和聚腺苷酸聚尿苷酸(poly AU)；和化學物質如左咪唑，DNCB，Azimexon，雙二乙氨乙基芴酮和苯丁抑制素。除了上面所述的生理活性物質，還可以將各種物質用作細胞因子誘導劑，包括細菌，細菌的成分，肽，核酸，蛋白質，糖和脂類。
在上面所列的物質中，優選細菌和衍生自這種細菌的物質用作細胞因子誘導劑。
也優選耐酸菌和衍生自耐酸菌的物質用作細胞因子誘導劑。它們中，特別優選結核桿菌(tubercule bacilli)和衍生自結核桿菌的物質用作細胞因子誘導劑。還特別優選的是BCG，分枝桿菌屬bovis的減毒株，和衍生自BCG的物質。
同樣，優選溶血鏈球菌及衍生自溶血鏈球菌的物質用作細胞因子誘導劑。
同樣，優選放線菌及衍生自放線菌的物質用作細胞因子誘導劑。
如果單獨使用上面的某些細胞因子誘導劑，可能難以完全地展示細胞因子誘導能力。但是，當其與不溶性誘導增強劑組合使用時，它們可以展示它們的細胞因子誘導活性。因而，這允許除常規使用的細胞因子誘導物質外的各種物質作為本發明中的細胞因子誘導劑。
可以將各種本領域眾所周知的技術如物理吸附，共價鍵接和離子鍵接用來向誘導增強劑的表面上固定細胞因子誘導劑。在共價鍵接等的情況下，如果需要，可以在將與誘導增強劑連接的細胞因子誘導劑的位置引入具有任選長度的間隔基。
如果細胞因子誘導劑包含例如細菌，可以在固定之前，任選將其進行各種預處理，如洗滌，細菌的分級和研磨操作。如果細胞因子誘導劑包含例如活細菌，可以在固定前，期間或之後，進行各種方法如熱，化學，輻射和氣體滅菌處理，以殺死那些細菌。可以由高壓滅菌處理來舉例說明熱處理。化學處理的實例包括戊二醛，福馬林和乙醛處理。輻射和氣體滅菌處理可以分別由γ射線和環氧乙烷氣體處理來舉例說明。
可以通過下面的方法將由微生物如BCG組成的細胞因子誘導劑固定誘導增強劑上將包含於細菌的外表面壁中的胺基酸或糖類物質與誘導增強劑中的官能團如羧基，氨基和/或環氧基的連接。在此操作中，需要時，可以引入具有各種鏈長度和結構的間隔基。
當微生物如BCG的外層由例如脂類覆蓋時，在進行固定之前，可以任選通過洗滌除該脂類。
優選的固定技術是物理吸附技術。可以通過物理吸附技術將細胞因子誘導劑固定在誘導增強劑上。特別是當誘導增強劑具有疏水表面時，可以有效地利用物理吸附將BCG等細胞因子誘導劑固定在這種誘導增強劑上。如果細胞因子誘導劑包含微生物或其組分，可以在其表面攜帶電荷。在此情況下，可以將這種細胞因子誘導劑通過物理吸附固定於具有相反帶電錶面的誘導增強劑。
對於誘導增強劑的用量沒有特別規定。當以微粒形式使用誘導增強劑時，誘導增強劑的總體積通常約為相當於血體積的0.02％-80％，優選為0.1％-50％。
對於細胞因子誘導劑的使用量沒有特別規定。例如，如果細胞因子誘導劑包含BCG，優選基於乾重，以0.001mg-10mg/mL的濃度加入至血液中，如果其包含OK-432，優選以0.0001KE-10KE/mL的濃度加入至血液中。
當在使用根據本發明的細胞因子誘導裝置時，使含有誘導增強劑和細胞因子誘導劑的細胞因子誘導材料與血液、血液成分等接觸，由此在血液、血液成分等中細胞因子被有效地誘導。在此情況下，優選保持接觸溫度為15-42℃。這可以使細胞因子的誘導更有效。
誘導增強劑和細胞因子誘導劑可以在允許它們與血液接觸之前混合在一起。備選地，可以允許它們單獨與血液、血液成分等接觸。
本發明中，對於用於容納細胞因子誘導材料的容器結構沒有特別規定。如圖3示意性所示，優選容器3具有一個引入血液等的進口1，和出口2，接著，從這裡將與細胞因子誘導材料接觸之後的血液4等引向容器的外面。
特別優選的是，以柱狀體，血液袋等形式構造用於容納細胞因子誘導材料的容器。
更優選地，當使血液與細胞因子誘導材料接觸，然後引向容器的外面時，細胞因子誘導裝置具有防止細胞因子誘導材料流出的機械裝置。
如圖3示意性所示，可以將防止細胞因子誘導材料流出的機械裝置5固定地安裝在容器內，以便防止細胞因子誘導材料流出。機械裝置可以配備有分離膜或過濾器。而且，可以通過離心從血液中分離細胞因子誘導材料。
如果出現治療需要，在血漿或血清成分與細胞因子誘導材料接觸之後，可以將其與血液分離。
具體而言，將含有微粒、纖維或無紡布等形式的誘導增強劑的細胞因子誘導材料包裝成具有進口和出口的血液袋。血液、血液成分等通過進口進入到袋中。如果需要，細胞因子誘導後的血液、血液成分等可以通過使用出口除去。優選血液袋的容積為50mL-1,000mL，特別優選為100mL-400mL。優選這種血液袋通過裝有微粒、纖維或無紡的細胞因子誘導材料而構成細胞因子誘導裝置。
特別重要的細胞因子實例包括幹擾素-γ(IFN-γ)，白介素2(IL-2)，白介素10(IL-10)，白介素12(IL-12)，腫瘤壞死因子-α(Tumor NecrosisFactor-α，TNF-α)和轉化生長因子-β(TGF-β)。例如，IFN-γ是一種在免疫性疾病如風溼病，炎症，變態反應病，癌症和其它各種疾病中起重要作用的細胞因子，並且可以期望其對這些疾病具有治療作用。
上述細胞因子誘導材料和細胞因子誘導裝置不僅可以誘導來自於血液、血液成分等的細胞因子，而且可以誘導來自於各種產生細胞因子的細胞的細胞因子，產生細胞因子的細胞實例包括從組織收集的細胞，如骨髓衍生的細胞，上皮細胞，成纖維細胞，肝細胞，成骨細胞，血幹細胞，胚胎幹細胞，培養的細胞和移植的細胞。
附圖簡述圖1是解釋表面粗糙度和不規則的「峰」的示意圖；圖2是解釋對於表面粗糙度的不規則的平均間距Sm值的示意圖；和圖3所示為根據本發明細胞因子誘導裝置一個實施方案的示意剖視圖。
實施本發明的最佳方式下面的實施例更具體地舉例說明本發明，但其並不意欲限制本發明。
下面的實施例中，通過使用RD Systems酶聯免疫吸附測定藥盒，Endogen酶聯免疫吸附測定藥盒和Genzyme Techne酶聯免疫吸附測定藥盒，量化人血漿和大鼠血漿中的IFN-γ，TNF-α，IL-2，IL-10和IL-12。通過使用Promega酶聯免疫吸附測定藥盒來定量地確定人血漿中的TGF-β。
(實施例1)用純水(Otsuka Pharmaceutical Co.，Ltd.的產品)，然後用甲醇(WakoPure Chemicals Industries，Ltd.的產品，HPLC用)通過潷析洗滌誘導增強劑-1(合成的芳族吸附劑，Mitsubishi Chemical Corp.的產品，產品名DIAIONHP-50)。然後，用注射用生理鹽水(Otsuka Pharmaceutical Co.，Ltd.的產品)潷析洗滌誘導增強劑-1。然後，將總體積(bulk volume)為50μL的顆粒誘導增強劑-1包裝於無菌管(DIATRON Corp.的產品，1.5ml容量的微量離心(Eppendorf)管)。
從一個健康人中採集血液，以製備含有15IU/ml肝素的靜脈血。以1mg/mL血液的濃度加入BCG(Japan BCG Manufacturing Co.，Ltd.的產品)。此處，BCG是用生理鹽水製備的。使得生理鹽水與血液的體積比為1.25％。
將約1.45mL的含BCG的血液引入至包裝有誘導增強劑-1的管中。
翻轉管子以攪拌血液，然後安裝旋轉攪拌器(Taitech Corp.的產品)，其然後在恆溫容器中以6rpm旋轉，以在37℃進行溫育24小時。溫育後，於4℃在3,500rpm(Tomy Seiko Co.，Ltd.的產品，微型高速離心機MRX-150)下離心血液15分鐘。然後從於-20℃低溫保藏的血液中收集血漿。然後，使保藏的血漿解凍，並且用Human IFN-γ酶聯免疫吸附測定藥盒(RD Systems或ENDOGEN的產品)確定血漿中IFN-γ的量。結果示於下表1中。
(比較例1)排除誘導增強劑-1並且以1.5mL的量使用結合BCG的血液。其它方面，按照實施例1的程序進行，以收集血漿並且確定在血漿中誘導的IFN-γ的量。結果示於下表1中。
(比較例2)除不向血液中加入BCG外，按照實施例1的程序進行，以確定在血漿中誘導的IFN-γ的量。結果示於下表1中。
表1
(實施例2)將在37℃溫育的持續時間從24小時改變為4小時。其它方面，按照實施例1的程序進行，得到低溫保藏的血漿。然後，使低溫保藏的血漿解凍，並且用Human TNF-α酶聯免疫吸附測定藥盒(RD Systems的產品)確定血漿中誘導的TNF-α的量。結果示於下表2中。
(比較例3)除排除誘導增強劑-1並且以1.5mL的量使用結合BCG的血液外，按照實施例2的程序進行，以確定誘導的TNF-α的量。結果示於下表2中。
(比較例4)除不向血液中加入BCG外，按照實施例2的程序進行，以確定誘導的TNF-α的量。結果示於下表2中。
表2
(實施例3)將誘導增強劑-1的總體積從50μL改變為5μL並且以1.495mL的量加入血液。其它方面，按照實施例1的程序進行，以確定血漿中誘導的IFN-γ的量。結果示於下表3中。
(實施例4)將誘導增強劑-1的總體積從50μL改變為10μL並且以1.49mL的量加入血液。其它方面，按照實施例1的程序進行，以確定血漿中誘導的IFN-γ的量。結果示於下表3中。
(實施例5)將誘導增強劑-1的總體積從50μL改變為20μL並且以1.48mL的量加入血液。其它方面，按照實施例1的程序進行，以確定血漿中誘導的IFN-γ的量。結果示於下表3中。
(實施例6)按照實施例1的程序進行，以確定血漿中誘導的IFN-γ的量。結果示於下表3中。
(實施例7)將誘導增強劑-1的總體積從50μL改變為200μL並且以1.3mL的量加入血液。其它方面，按照實施例1的程序進行，以確定血漿中誘導的IFN-γ的量。結果示於下表3中。
(比較例5)除排除誘導增強劑-1並且以1.5mL的量使用結合BCG的血液。其它方面，按照實施例3的程序進行，以確定誘導的IFN-γ的量。結果示於下表3中。
(比較例6)除了不向血液中加入BCG外，按照實施例3的程序進行，以確定誘導的IFN-γ的量。結果示於下表3中。
(比較例7)除了不向血液中加入BCG外，按照實施例4的程序進行，以確定誘導的IFN-γ的量。結果示於下表3中。
(比較例8)除了不向血液中加入BCG外，按照實施例5的程序進行，以確定誘導的IFN-γ的量。結果示於下表3中。
(比較例9)除了不向血液中加入BCG外，按照實施例6的程序進行，以確定誘導的IFN-γ的量。結果示於下表3中。
(比較例10)
除了不向血液中加入BCG外，按照實施例7的程序進行，以確定誘導的IFN-γ的量。結果示於下表3中。
表3
(實施例8)除了將誘導增強劑-1的總體積改變為20μL外，按照實施例1的程序進行，以製備包裝有誘導增強劑-1的管。
向每一種血液樣品中以0.1KE/mL的濃度加入代替BCG的Picibanil(Chugai Pharmaceutical Co.，Ltd.的產品，OK-432)。使用RPMI介質製備該OK-432。RPMI介質與血液的比率為20％。將結合了OK-432的血液傾倒入包裝有總體積為20μL的誘導增強劑-1的管中，至管刻度為1.5mL。即，以約1.48mL的量加入血液。
然後，以與實施例1相同的方式確定誘導的IFN-γ的量。結果示於下表4中。
(實施例9)將誘導增強劑-1的總體積改變為50μL並且以1.45mL的量加入結合了OK-432的血液。其它方面，按照實施例8的程序進行，以確定誘導的IFN-γ的量。結果示於下表4中。
(實施例10)將誘導增強劑-1的總體積改變為100μL並且以1.40mL的量加入結合了OK-432的血液。其它方面，按照實施例8的程序進行，以確定誘導的IFN-γ的量。結果示於下表4中。
(比較例11)除排除誘導增強劑-1並且以1.5mL的量使用結合OK-432的血液。其它方面，按照實施例8的程序進行，以確定誘導的IFN-γ的量。結果示於下表4中。
(比較例12)除了不加入Picibanil(OK-432)外，按照實施例8的程序進行，以確定誘導的IFN-γ的量。結果示於下表4中。
(比較例13)除了不加入Picibanil(OK-432)外，按照實施例9的程序進行，以確定誘導的IFN-γ的量。結果示於下表4中。
(比較例14)除了不加入Picibanil(OK-432)外，按照實施例10的程序進行，以確定誘導的IFN-γ的量。結果示於下表4中。
表4
(實施例11)
用誘導增強劑-2(合成的丙烯酸酯脂，Organo Corp.的產品，產品號AMBERLITE XAD-7)代替誘導增強劑-1。其它方面，按照實施例1的程序進行，以確定血漿中誘導的IFN-γ的量。結果示於下表5中。
(實施例12)將誘導增強劑-2的總體積從50μL改變為200μL並且以1.3mL的量加入結合了BCG的血液。其它方面，按照實施例11的程序進行，以確定誘導的IFN-γ的量。結果示於下表5中。
(比較例15)除排除誘導增強劑-2並且以1.5mL的量使用結合BCG的血液。其它方面，按照實施例11的程序進行，以確定誘導的IFN-γ的量。結果示於下表5中。
(比較例16)除了不向血液中加入BCG外，按照實施例11的程序進行，以確定誘導的IFN-γ的量。結果示於下表5中。
(比較例17)除了不向血液中加入BCG外，按照實施例12的程序進行，以確定誘導的IFN-γ的量。結果示於下表5中。
表5
下面的實施例和比較例舉例說明大鼠血液中細胞因子的誘導。
(實施例13)按照實施例1的程序進行，得到包裝有總體積為50μL的誘導增強劑-1的無菌管。
從Wister大鼠(7周齡，雄性，購自Japan SLC，Inc.)中採集含有15IU/ml肝素的靜脈血。以0.1KE/mL的濃度加入的Picibanil(Chugai PharmaceuticalCo.，Ltd.的產品，OK-432)。使用RPMI介質製備該OK-432。RPMI介質與血液的比率為20％。將結合了OK-432的血液傾倒入包裝有誘導增強劑-1的管中，至管刻度為1.5mL。
然後，按照實施例1的程序進行，收集血漿，並且使用大鼠IFN-γ定量藥盒(Genzyme Techne的產品)確定在其中誘導的IFN-γ的量。結果示於下表6中。
(實施例14)將誘導增強劑-1的總體積改變為500μL並且以1.0mL的量加入結合了OK-432的血液。其它方面，按照實施例13的程序進行，以確定誘導的IFN-γ的量。結果示於下表6中。
(比較例18)除排除誘導增強劑-1並且以1.5mL的量使用結合OK-432的血液。其它方面，按照實施例13的程序進行，以確定誘導的IFN-γ的量。結果示於下表6中。
(比較例19)除了不加入OK-432外，按照實施例13的程序進行，以確定誘導的IFN-γ的量。結果示於下表6中。
(比較例20)除了不加入OK-432外，按照實施例14的程序進行，以確定誘導的IFN-γ的量。結果示於下表6中。
表6
(實施例15)按照實施例1的程序進行，得到包裝有總體積為50μL的誘導增強劑-1的無菌管。
從Wister大鼠(7周齡，雄性，購自Japan SLC，Inc.)中採集血液，得到含有15IU/ml肝素的靜脈血。以1mg/mL的濃度加入的BCG。使用生理鹽水製備該BCG。生理鹽水與血液的比率為1.25％。將結合了BCG的血液傾倒入包裝有誘導增強劑-1的管中，至管刻度為1.45mL。
然後，按照實施例1的程序進行，收集血漿，並且使用大鼠IFN-γ定量藥盒(Genzyme Techne的產品)確定在其中誘導的IFN-γ的量。結果示於下表7中。
(實施例16)將誘導增強劑-1的總體積為從50μL改變為500μL並且以1.0mL的量加入結合了BCG的血液。其它方面，按照實施例15的程序進行，以確定誘導的IFN-γ的量。結果示於下表7中。
(比較例21)除排除誘導增強劑-1並且以1.5mL的量使用結合BCG的血液。其它方面，按照實施例15的程序進行，以確定誘導的IFN-γ的量。結果示於下表7中。
(比較例22)除了不加入BCG外，按照實施例15的程序進行，以確定誘導的IFN-γ的量。結果示於下表7中。
(比較例23)除了不加入BCG外，按照實施例16的程序進行，以確定誘導的IFN-γ的量。結果示於下表7中。
表7
(實施例17)將在37℃溫育的持續時間從24小時改變為4小時。其它方面，按照實施例15的程序進行，收集血漿，並且用大鼠腫瘤壞死因子-α量化藥盒(Genzyme Techne的產品)確定在其中誘導的TNF-α的量。結果示於下表8中。
(比較例24)排除誘導增強劑-1並且以1.5mL的量使用結合BCG的血液。其它方面，按照實施例17的程序進行，收集血漿並且確定在其中誘導的TNF-α的量。結果示於下表8中。
(比較例25)除不向血液中加入BCG外，按照實施例17的程序進行，以確定誘導的TNF-α的量。結果示於下表8中。
表8
(實施例18-23)使用的是誘導增強劑-3CA薄膜(Artplus Corp.的產品，乙酸纖維素薄膜，產品名ACETYFILM VR-R)。通過索克利特(soxhlet)萃取，在甲醇中從薄膜中萃取增塑劑24小時。除去之後，空氣乾燥薄膜15小時，再於80℃乾燥5小時。然後，使用具有220-，500-，1200-，2400-或4000-目的砂紙保護的Struers(Denmark)自動拋光機(產品名PLANOPOL-PEDEMAX)，拋光CA薄膜，提供在其兩個表面都具有表面粗糙度的拋光CA薄膜。用甲醇洗滌該薄膜，然後再分為2.5mm×2.5mm的碎片。用注射用生理鹽水洗滌測量的總體積為約200μL碎片，然後包裝於1.5mL容量的無菌管中。
從一個健康人中採集血液，以製備含有15IU/ml肝素的靜脈血。向血液中以1mg/mL的濃度加入BCG(Japan BCG Manufacturing Co.，Ltd.的產品)。將約1.3mL得到的血液加入到管中。隨後，以與實施例1相同的方式確定誘導的的IFN-γ的量。結果示於下表9中。
表9
(實施例24-29)使用的是誘導增強劑-4PET薄膜(Unitika Ltd.的產品，聚對苯二甲酸乙二醇酯薄膜，產品名EMBLET S-75)。用甲醇洗滌其表面。然後，使用具有220-，500-，1200-，2400-或4000-目的砂紙保護的Struers(Denmark)自動拋光機，拋光該PET薄膜，以提供在其兩個表面都具有表面粗糙度的拋光CA薄膜。用甲醇洗滌該薄膜，然後再分為2.5mm×2.5mm的碎片。用注射用生理鹽水洗滌測量的總體積為約200μL的這些碎片，然後包裝於1.5mL容量的無菌管中。從一個健康人中採集血液，以製備含有15IU/ml肝素的靜脈血。向血液中以1mg/mL的濃度加入BCG(Japan BCG ManufacturingCo.，Ltd.的產品)。將得到的約1.3mL的血液加入到管中。隨後，以與實施例1相同的方式確定誘導的IFN-γ的量。結果示於下表10中。
表10
(實施例30-35)使用的是誘導增強劑-5聚苯乙烯薄膜(Mitsubishi-Monsanto Co.，Ltd.的產品，產品名SANTOCLEAR)。用純水洗滌其表面。然後，使用具有220-，500-，1200-，2400-或4000-目的砂紙保護的Struers(Denmark)自動拋光機，拋光聚苯乙烯薄膜，以提供在其兩個表面都具有表面粗糙度的拋光聚苯乙烯薄膜。用純水洗滌該薄膜，然後再分為2.5mm×2.5mm的碎片。用注射用生理鹽水洗滌測量的總體積為約200μL的這些碎片，然後包裝於1.5mL容量的無菌管中。從一個健康人中採集血液，以製備含有15IU/ml肝素的靜脈血。向血液中以1mg/mL的濃度加入BCG(Japan BCG ManufacturingCo.，Ltd.的產品)。將得到的約1.3mL血液加入到管中。隨後，以與實施例1相同的方式確定誘導的的IFN-γ的量。結果示於下表11中。
表11
(實施例36)將乙酸纖維素小球(Artplus Corp.的產品，含有30％作為增塑劑的檸檬酸乙醯基三乙酯)進行注模，以製備2.5mm直徑的球形珠粒。通過索克利特萃取，於50℃在300mL甲醇中從50g的這些珠粒中萃取增塑劑24小時。萃取增塑劑之後，將這些珠粒轉移至不鏽鋼絮狀物(batting)上，空氣乾燥15小時，再於80℃乾燥5小時。
將200mL的這種珠粒和等體積的研磨劑WHITE ABRAX(WA)#34(Japan Abrasive Company的產品)加入到球磨機(Toyo Engineering Corp.的產品，產品名51-陶瓷球磨機BP-5)。此外，加入數個用於陶瓷球磨機的圓球(Toyo Engineering Corp.的產品，產品名BB-13)。通過球形拋光機(由Nitto Kagaku Co.，Ltd.製備的球磨機，產品名AN-3S)，進行拋光5小時。結果，得到Ra值為1.36μm和Sm值為97.2μm的珠粒(誘導增強劑-6)。
將得到的球粒用甲醇洗滌三次，然後用注射用生理鹽水洗滌5次。以與實施例1相同的方式，將這些測量的總體積為400μL的珠粒包裝於1.5mL容量的無菌管中。然後，除了以1.1mL的量加入血液外，按照實施例1的程序進行，確定誘導的IFN-γ的量。結果示於下表12中。
(實施例37)除了不進行拋光外，按照實施例36的程序進行，製備Ra值為0.186μm和Sm值為298.7μm的誘導增強劑-6。以與實施例36相同的方式，允許該誘導增強劑與血液接觸。結果示於下表12中。
(比較例26)除排除誘導增強劑-6並且以1.5mL的量使用結合BCG的血液。其它方面，按照實施例36的程序進行，以確定誘導的IFN-γ的量。結果示於下表12中。
表12
(實施例38-42)使用下列誘導增強劑，按照實施例1的程序進行誘導增強劑-1(合成的芳族吸附劑，Mitsubishi Chemical Corp.的產品，產品名DIAIONHP-50)，誘導增強劑-2(合成的丙烯酸酯樹脂，Organo Corp.的產品，產品名AMBERLITE XAD-7)，誘導增強劑-7(合成的芳族樹脂，Organo Corp.的產品，產品名AMBERLITE XAD-2)，誘導增強劑-8(合成的芳族樹脂，Organo Corp.的產品，產品名AMBERLITE XAD-4)或誘導增強劑-9(合成的芳族樹脂，Organo Corp.的產品，產品名AMBERLITE XAD-16HP)。結果示於表13中。
(比較例27)除排除誘導增強劑並且以1.5mL的量使用結合BCG的血液。其它方面，按照實施例38的程序進行。結果示於下表13中。
表13
(實施例43)將BCG懸浮於生理鹽水中，用磷酸鹽緩衝溶液稀釋，並且於4,000rpm離心15分鐘。除去浮在表面上的液體之後，將所得到的物質再次懸浮於磷酸鹽緩衝溶液中，並且於4,000rpm(Tomy Seiko Co.，Ltd.的產品，微型高速離心機MRX-150)離心15分鐘。重複此操作3次。將得到的物質懸浮於含50％乙醇的磷酸鹽緩衝溶液中，然後於4,000rpm離心15分鐘。然後，將得到的物質懸浮於乙醇中，並且於4,000rpm離心15分鐘。重複此操作兩次。再次用磷酸鹽緩衝溶液進行3次洗滌。由碳二亞胺工藝，將2mg經過這種處理的BCG與引入羧基的誘導增強劑-1(總體積1mL)共價鍵接。用乙醇胺處理保留的反應基。用磷酸鹽緩衝溶液洗滌得到的物質，然後懸浮於磷酸鹽緩衝溶液中。將測量為100μL由此得到的誘導增強劑包裝於無菌管中。
不以其單獨的形式加入BCG。以1.4mL的量加入血液。其它方面，以與實施例1相同的方式確定誘導的的IFN-γ的量。結果示於表14中。
(比較例28)除了不共價鍵接處理過的BCG外，按照實施例43的程序進行，以確定誘導的IFN-γ的量。結果示於表14中。
(比較例29)不加入誘導增強劑，並且以1.5mL的量使用結合了BCG(1mg/mL)的血液。其它方面，以與實施例43相同的方式確定誘導的的IFN-γ的量。結果示於表14中。
表14
(實施例44)在37℃下，在1mL的生理鹽水中充分混合測量的總體積為1mL的聚苯乙烯-二乙烯苯共聚物誘導增強劑-8(Organo Corp.的產品，產品號AMBERLITE XAD-4)，和BCG(10mg/mL)20小時，以便將BCG物理吸附於顆粒表面。充分混合之後，將這些顆粒用生理鹽水徹底洗滌，並且再懸浮於生理鹽水中。將測量的總體積為100μL的由此得到的誘導增強劑包裝於無菌管中。
不以其單獨的形式加入BCG。以1.4mL的量加入血液。其它方面，使用來自於兩個健康人的血液，以與實施例1相同的方式確定誘導的的IFN-γ的量。結果示於表15中。
(比較例30)除了不加入BCG外，按照實施例44的程序進行製備顆粒。使用由此得到的顆粒，以與實施例44相同的方式確定誘導的的IFN-γ的量。結果示於表15中。
(比較例31)不加入誘導增強劑，並且以1.5mL的量使用結合了BCG(1mg/mL)的血液。其它方面，以與實施例44相同的方式確定誘導的的IFN-γ的量。結果示於表15中。
表15
(實施例45)在4℃下，在1mL含有1％福馬林(中性福馬林緩衝溶液，Wako PureChemicals Industries，Ltd.的產品)的生理鹽水中充分混合測量的總體積為1mL的聚苯乙烯-二乙烯苯共聚物誘導增強劑-8和BCG(10mg/mL)20小時，以便將BCG物理吸附於顆粒表面。充分混合之後，將這些顆粒用生理鹽水徹底洗滌。然後，將測量的總體積為100μL的這些顆粒包裝於無菌管(DIATRON Corp.的產品，適宜於1.5mL容量)中。
不以其單獨的形式加入BCG。以1.4mL的量加入血液。其它方面，以與實施例1相同的方式確定誘導的的IFN-γ的量。結果示於表16中。
(比較例32)除了不加入BCG外，按照實施例45的程序進行，確定誘導的的IFN-γ的量。結果示於表16中。
(比較例33)排除誘導增強劑-8，並且以1.5mL的量使用結合了BCG(1mg/mL)的血液。其它方面，以與實施例45相同的方式確定誘導的的IFN-γ的量。結果示於表16中。
表16
(實施例46)以與實施例45相同的方式處理誘導增強劑-8，以便在顆粒的表面上物理吸附BCG。將測量的總體積為4mL的處理過的誘導增強劑包裝於血液包(Terumo Corp.的產品，單包200mL容量)中。收集來自於健康人的血液，得到含有15IU/mL的靜脈血。將50mL的靜脈血引入血液包中。溫育血液包中的物質，同時於37℃溫和攪拌24小時。以與實施例1相同的方式確定血液中存在的IFN-γ的量。結果示於表17中。
(比較例34)使用沒有BCG物理吸附的誘導增強劑-8。其它方面，按照實施例46的程序進行。結果示於表17中。
(比較例35)排除誘導增強劑-8並且以50mL的量使用含有1mg/mL的BCG的血液。其它方面，按照實施例46的程序進行，以確定IFN-γ的量。結果示於表17中。
表17
(實施例47)
除了定量地確定存在於血液中的白介素2和白介素12外，按照實施例1的程序進行。結果示於表18中。
(比較例36)除了不加入BCG外，按照實施例47的程序進行。結果示於表18中。
(比較例37)不加入誘導增強劑-1並且以1.5mL的量使用結合了BCG的血液。其它方面，按照實施例47的程序進行。結果示於表18中。
表18
(實施例48)除了將BCG的濃度改變為0.1mg/mL並且定量地確定存在於血液中的TGF-β外，按照實施例1的程序進行。結果示於表19中。
(比較例38)不加入誘導增強劑-1並且以1.5mL的量使用結合了BCG的血液。其它方面，按照實施例48的程序進行。結果示於表19中。
表19
(實施例49)除了使用0.1KE/mL量的OK-432代替BCG外，按照實施例48的程序進行。結果示於表20中。
(比較例39)不加入誘導增強劑-1並且以1.5mL的量使用結合了OK-432的血液。其它方面，按照實施例49的程序進行。結果示於表20中。
表20
(實施例50)除了使用0.01KE/mL量的OK-432代替BCG並且定量確定IL-10外，按照實施例1的程序進行。結果示於表21中。
(比較例40)不加入誘導增強劑-1並且以1.5mL的量使用結合了OK-432的血液。其它方面，按照實施例50的程序進行。結果示於表21中。
表21
(實施例51和52)除了以0.1mg/mL或1mg/mL的濃度加入BCG外，按照實施例1的程序進行。結果示於表22中(比較例41)除了不加入BCG外，按照實施例51的程序進行。結果示於表22中。
(比較例42)
不加入誘導增強劑-1並且以1.5mL的量使用結合了BCG(0.1mg/mL)的血液。其它方面，按照實施例51的程序進行。結果示於表22中。
(比較例43)不加入誘導增強劑-1並且以1.5mL的量使用結合了BCG(1mg/mL)的血液。其它方面，按照實施例52的程序進行。結果示於表22中。
表22
(實施例53和54)除了使用0.01KE/mL或0.1KE/mL濃度的OK-432代替BCG，按照實施例1的程序進行。結果示於表23中。
(比較例44)除了不加入OK-432外，按照實施例53的程序進行。結果示於表23中。
(比較例45)不加入誘導增強劑-1並且以1.5mL的量使用結合了OK-432(0.01KE/mL)的血液。其它方面，按照實施例53的程序進行。結果示於表23中。
(比較例46)不加入誘導增強劑-1並且以1.5mL的量使用結合了OK-432(0.1KE/mL)的血液。其它方面，按照實施例54的程序進行。結果示於表23中。
表23
(實施例55)將0.04g(當包裝於1.5mL管中時，按總體積計約300μL)的尼龍毛(Wako Pure Chemicals Industries，Ltd.的產品)用作誘導增強劑-10。以1.2mL的量使用結合了BCG的血液。其它方面，按照實施例1的程序進行。結果示於表24中。
(實施例56)將0.04g(1cm×3cm，以總體積計約300μL)的聚酯無紡織物(JapanVilene Co.，Ltd.的產品，產品名稱EL-5600)用作誘導增強劑-11。以1.2mL的量使用結合了BCG的血液。其它方面，按照實施例1的程序進行。結果示於表24中。
(實施例57)將0.04g(1cm×3cm，以總體積計約220μL)的聚酯無紡織物(JapanVilene Co.，Ltd.的產品，產品名稱EW-7180)用作誘導增強劑-12。以1.28mL的量使用結合了BCG的血液。其它方面，按照實施例1的程序進行。結果示於表24中。
(比較例47)除了不加入BCG外，按照實施例55的程序進行。結果示於表24中。
(比較例48)除了不加入BCG外，按照實施例56的程序進行。結果示於表24中。
(比較例49)除了不加入BCG外，按照實施例57的程序進行。結果示於表24中。
(比較例50)不加入誘導增強劑並且以1.5mL的量使用結合了BCG的血液。其它方面，按照實施例55的程序進行。結果示於表24中。
表24
(實施例58)於30℃，在100mL含有0.2％酵母抽提物的澱粉-銨介質中，將從Instituteof Physical and Chemical Research得到的放線菌Actinomyces S.nobilis(JCM 4274)搖動培養40小時，得到細菌。除了以1mg/mL的乾重向血液中加入這種細菌代替BCG外，按照實施例1的程序進行，確定IFN-γ的量。結果示於表25中。
(比較例51)除了不加入放線菌的細菌外，按照實施例58的程序進行。結果示於表25中。
(比較例52)不加入誘導增強劑-1並且以1.5mL的量使用結合了放線菌的血液。其它方面，按照實施例58的程序進行。結果示於表25中。
表25
(實施例59)對於誘導增強劑-13(聚乙烯醇的凝膠顆粒，顆粒直徑為約1.1mm)，按照Hiroshi Yokoi(Polymer Processing，Vol.40，No.11，1991)的「Complex gelsof PVA and PAA」製備聚乙烯醇-Fe(III)複合物的凝膠顆粒。將誘導增強劑-13懸浮於生理鹽水中。接著，將測量的總體積為300μL聚乙烯醇-Fe(III)複合物的凝膠顆粒包裝於1.5mL容量的無菌管中。然後，除了以1.2mL的量加入血液外，按照實施例1的程序進行。結果示於表26中。
(比較例53)除了不加入BCG外，按照實施例58的程序進行。結果示於表26中。
(比較例54)不加入誘導增強劑-13並且以1.5mL的量使用結合了BCG的血液。其它方面，按照實施例58的程序進行。結果示於表26中。
表26
工業適用性通過使用根據本發明的細胞因子誘導材料，可以比常規的細胞因子誘導劑更有效地誘導細胞因子。因為本發明的細胞因子誘導材料，當允許與血液或血液組分接觸時，可以有效地誘導細胞因子，根據本發明的細胞因子誘導材料和細胞因子誘導裝置可以適宜用於治療對於細胞因子治療有效的各種疾病。
權利要求
1.一種細胞因子誘導材料，其特徵在於，其包含細胞因子誘導劑和水不溶性誘導增強劑。
2.根據權利要求1所述的細胞因子誘導材料，其特徵在於，所述細胞因子誘導劑固定於所述誘導增強劑上。
3.根據權利要求2所述細胞因子誘導材料，其特徵在於，所述細胞因子誘導劑通過物理吸附固定於所述誘導增強劑上。
4.根據權利要求1-3任何一項所述細胞因子誘導材料，其特徵在於，所述誘導增強劑包含聚合材料。
5.根據權利要求1-4任何一項所述細胞因子誘導材料，其特徵在於，所述誘導增強劑具有中心線平均粗糙度為0.2μm至10μm的表面。
6.根據權利要求1-5任何一項所述細胞因子誘導材料，其特徵在於，所述誘導增強劑包含至少一種選自聚苯乙烯類，丙烯酸酯，聚酯，尼龍，纖維素和聚乙烯醇類中的聚合材料。
7.根據權利要求1-6任何一項所述細胞因子誘導材料，其特徵在於，所述細胞因子誘導劑包含細菌或衍生自細菌的物質。
8.根據權利要求7所述細胞因子誘導材料，其特徵在於，所述細胞因子誘導劑包含耐酸菌或衍生自耐酸菌的物質。
9.根據權利要求7所述細胞因子誘導材料，其特徵在於，所述細胞因子誘導劑包含溶血鏈球菌或衍生自溶血鏈球菌的物質。
10.根據權利要求7所述細胞因子誘導材料，其特徵在於，所述細胞因子誘導劑包含放線菌或衍生自放線菌的物質。
11.根據權利要求1-10任何一項所述細胞因子誘導材料，其特徵在於，所述細胞因子包含至少一種選自幹擾素-γ，白介素-2，白介素-10，白介素-12，腫瘤壞死因子-α和轉化生長因子-β中的細胞因子。
12.一種細胞因子誘導裝置，其特徵在於，其具有容器和根據權利要求1-11任何一項所述並且裝於所述容器中的細胞因子誘導材料。
13.根據權利要求12所述細胞因子誘導裝置，其特徵在於，使所述裝於容器中的細胞因子誘導材料與血液或血液組分接觸。
全文摘要
用於細胞因子誘導治療等的細胞因子誘導材料和細胞因子誘導裝置。更具體而言，一種細胞因子誘導材料，其特徵在於，其包含含有細胞因子誘導劑如BCG，聚合物等的水不溶性誘導增強劑；和具有包裝於容器中的這種誘導材料的細胞因子誘導裝置。通過使誘導材料與例如血液或血液組分接觸，可以比常規情況更有效地誘導細胞因子。
文檔編號A61K31/745GK1582167SQ0282201
公開日2005年2月16日 申請日期2002年10月31日 優先權日2001年11月2日
發明者新村和夫, 阿部佳子, 慄山澄 申請人:積水化學工業株式會社