一種防治油茶軟腐病的內生拮抗菌株及其應用的製作方法
2023-09-11 13:00:20 1
專利名稱：一種防治油茶軟腐病的內生拮抗菌株及其應用的製作方法
技術領域：
本發明屬 於植物保護領域，具體涉及一種防治油茶軟腐病的內生拮抗菌株及其應用，尤其涉及一種高效防治油茶軟腐病的解澱粉芽孢桿菌L46及應用。
背景技術：
油茶(Camellia oleifera)是我國特有的食用油料樹種，亦是世界四大木本油料樹種之一，已有2000多年的利用和栽培歷史。它適應性廣，抗逆性強，適種於廣大的紅壤丘陵低地區。主要生長在南方，以湖南、江西、廣西為主，其中湖南省是國內最大的油茶產地和最大的茶油消費區。目前，油茶的病害種類繁多，其危害程度也愈發嚴重。每年因病害而造成的經濟損失難以估計，其中油茶軟腐病是一種常見的油茶病害。油茶軟腐病是病原為油茶傘座孢菌 (Agari-codochium camelIiae Liu, Wei et Fan),屬半知菌絲抱綱叢梗抱目傘座抱屬。在成年油茶林內，此病甚少對整片茶林造成威脅，但感病單株大量落葉落果，造成很大損失。 油茶軟腐病現已成為補充檢疫對象。在我國南方各省，油茶軟腐病均有不同程度危害。該病主要危害油茶葉片和果實， 受害部位腐爛，並造成大量落葉和落果，甚至葉、果落光。在苗圃中，油茶職業受害相當嚴重，甚至整株枯死。油茶軟腐病現已成為補充檢疫對象。目前，對油茶軟腐病的防治主要以化學防治為主，但是長期、反覆和大量使用化學農藥存在著潛在的危害，它引起土壤、水體和大氣的汙染，農副產品中農藥殘留增加，造成食品安全性問題日益嚴重，以及化學農藥在殺病原菌的同時也破壞了生態平衡。同時病原真菌和細菌抗藥性不斷加深和擴大，從而會造成化學農藥應用的惡性循環。利用生物防治即微生物代謝產物(農用抗生素)或微生物活菌製劑防治植物病害不僅避免了化學農藥帶來了一系列問題，已經發展成為植病防治中十分重要的有效措施之一。生物防治以其安全、高效及無汙染等特點已經成為植物病害防治的重要途徑，其中拮抗細菌在植物病害生物防治中起到非常重要的作用，其主要優勢在於1)種類和數量眾多，在植物葉際、葉內大量存在；2)對病原菌的作用方式多種多樣，包括競爭、拮抗、寄生、誘導植物抗性的產生等；3)繁殖速度快；4)許多細菌在植物的葉內或葉際定殖力強；5)細菌大多能夠人工培養，易於操作，便於生產應用；6)有些細菌不僅能夠防治病害而且可以增加作物產量。從油茶植株內分離篩選獲得對油茶軟腐病菌具有拮抗作用的生防菌株，對油茶軟腐病的防治具有重要的意義，但目前相關技術仍舊很薄弱甚至空白，至今20多年能有效防治油茶軟腐病病的拮抗細菌未見報導，也沒有防治油茶軟腐病的生物農藥的報導。
發明內容
本發明的目的是針對現有技術的空白，提供一種高效防治油茶軟腐病的內生拮抗菌株解澱粉芽孢桿菌L46，解澱粉芽孢桿菌L46是一種從油茶植株內分離篩選獲得對油茶軟腐病菌具有拮抗作用的生防細菌菌株，對油茶軟腐病的防治具有重要意義。
本發明另一個目的是提供所述高效防治油茶軟腐病的解澱粉芽孢桿菌L46在防治軟腐病災害方面的多種應用。本發明的高效防治油茶軟腐病的解澱粉芽孢桿菌L46，Bacillus amyloliquefaciens sp. L46，已於2010年11月30日，在中國典型培養物保藏中心進行了保藏，保藏 號CCTCC M 2010324。其在牛肉膏蛋白腖培養基上菌落呈乳白色，圓形或近圓形， 邊緣不規則，中央隆起，乾燥折皺，不透明，不產生色素，菌落直徑一般2 3mm，菌體杆狀， 芽孢中生，革蘭氏染色陽性。本發明所述高效防治油茶軟腐病的解澱粉芽孢桿菌L46通過平板對峙試驗篩選獲得。本發明還提供了所述高效防治油茶軟腐病的解澱粉芽孢桿菌L46的應用，其一是對油茶軟腐病病菌菌絲的抑制作用。 其二是對油茶軟腐病病菌菌絲的致畸作用。其三是對油茶軟腐病病菌菌絲分生孢子萌發的抑制作用。本發明的有益效果是(1)解澱粉芽孢桿菌L46為植物內生細菌，對油茶軟腐病菌抑制作用強，對多種病原真菌具有拮抗作用，具有拮抗細菌在植物病害生物防治中所起到的非常重要的作用，例如種類和數量眾多，在植物葉際、葉內大量存在；對病原菌的作用方式多種多樣；繁殖速度快等優點，尤其是對油茶軟腐病的防治具有重要意義。(2)菌株培養條件簡單，容易保存，易於工業化生產，具有良好的開發應用前景。
圖1為L46菌株的菌落形態圖片；圖2為L46菌株的系統發育樹圖片；圖3為L46菌株對油茶軟腐病菌的平板對峙拮抗作用圖片；圖4為IOX 100倍顯微鏡下觀察到的解澱粉芽孢桿菌L46對油茶軟腐病菌絲的致畸作用圖片；其中1 正常菌絲的病原菌菌絲(10X100) ；2 前期菌絲膨大突出(10X100)。
具體實施例方式本發明提供解澱粉芽孢桿菌L46新菌株，其展現出對油茶軟腐病具有較強的拮抗活性。本發明的菌株分離自油茶葉。本發明的解澱粉芽孢桿菌L46顯示出以下形態和生化特徵在牛肉膏蛋白腖培養基上菌落呈乳白色，圓形或近圓形(見圖1)，邊緣較整齊，中央隆起，乾燥褶皺，不透明，不產生色素，菌落直徑一般2 3mm，菌體杆狀，革蘭氏染色陽性，芽孢中生。菌株的生化反應過氧化氫酶、葡萄糖發酵、需氧性測定呈陽性，V-P、甲基紅反應陰性，其生長能水解澱粉、明膠。本發明的解澱粉芽孢桿菌L46，經16S rDNA序列分析，構建系統發育樹，表明其與 Bacillusamyloliquefaciens具有很高的親緣性(見圖2)。
下面結合實施例對本發明作進一步的詳細說明，而不會限制本發明。實施例1解澱粉芽孢桿菌L46的分離取普通油茶健康葉，採用常規法進行分離、純化和保存。油茶葉用水衝洗乾淨後，選取適量的健康組織，分別稱量後，剪成5mmX5mm的組織塊，在75%乙醇中浸泡lmin，然後在0. 升汞溶液中浸泡40s 70s，再放入75%乙醇浸泡30s，取出後用無菌水衝洗4次。在無菌研缽內加入IOml的無菌水和少許滅過菌的石英砂研磨成勻漿，加蓋靜置30min，將勻漿10倍系列稀釋後，用移液槍分別吸取0. Iml至準備好的NA平板上，塗抹均勻後放入培養箱培養，48h後記錄菌量，並根據菌落形態、顏色和大小選取，在平板上進行純化保存，共分離5個批次。實施例2解澱粉芽孢桿菌L46的篩選初篩採用對峙培養法。對內生菌拮抗病原真菌篩選。將打好直徑為6mm的油茶軟腐病菌菌餅放於平板中央，然後用接菌環蘸取待測細菌的懸浮液等距離(距平板中央3cm) 點接2 3種內生細菌，放於培養箱中25°C黑暗培養，4d後觀察記錄抑菌帶的有無及大小， 共重複3次。選出抑菌帶寬度大於等於4mm的10個菌株進行復篩，依次為L1、L6、L12、L19、 L29、L33、L35、L39、L46、L48、進行復篩(見表 1)。表1內生細菌對油茶軟腐病菌的抑菌作用
抑菌帶寬度L (mm)菌株編號
L<4L2、L3、L4、L5、L7、L8、L9、L10、LlK L13、
L14、 L15、
L16、L17、L18、L20、L21、L22、L23、L24、L25、L26、L27、
L28、L30、L31、L32、L34、L36、L37、L38、L40、
L41、L42、L43、L44、L45、L47、L49
4<L<7Li、L6、L29、L33、L39、L48、
7<L<10L12、L19、L35
10<LL46復篩採用發酵法。將初步篩選出的10株菌分別在NA培養基上培養2d後，用接菌環移取一環置入裝有150mlNB培養液的三角瓶中(250ml)，在28°C、150rpm的搖床上振蕩培養48h。培養液用0. 22 μ m細菌過濾器過濾得到培養濾液，將濾液與約50°C PDA培養基按1 19混勻倒入培養皿，冷卻後在平板中央放入d = 6mm的軟腐菌菌餅，4d後測量病菌菌落直徑，以無菌水為對照，L46菌株發酵液的抑菌效果最明顯，抑制率達到83. 4% (見表 2)。表2發酵液對油茶軟腐病菌的抑制作用
權利要求
1.一種防治油茶軟腐病的內生拮抗菌株及其應用，其特徵在於，所述菌株為解澱粉芽孢桿菌 Bacillus amyloliquefaciens sp. L46，保藏號 CCTCC M 2010324。
2.權利要求1所述的菌株應用於拮抗油茶軟腐病病菌。
3.根據權利要求2所述的應用方法，其特徵在於，將所述菌株應用於抑制或致畸油茶軟腐病病菌的菌絲。
4.根據權利要求2所述的應用方法，其特徵在於，將所述菌株應用於抑制油茶軟腐病病菌菌絲分生孢子的萌發。
全文摘要
本發明公開了一種防治油茶軟腐病的內生拮抗菌株及其應用，該菌株為解澱粉芽孢桿菌L46，Bacillus amyloliquefaciens sp.L46，保藏號CCTCC M2010324。所述解澱粉芽孢桿菌L46經平板對峙試驗篩選所得，能夠有效抑制油茶軟腐病菌的生長，防效高，環境安全性好，具有良好的開發應用前景。
文檔編號C12N1/20GK102174427SQ20101060510
公開日2011年9月7日 申請日期2010年12月24日 優先權日2010年12月24日
發明者劉君昂, 周國英, 宋光桃, 李琳, 李雪嬌 申請人:中南林業科技大學