通過拉曼散射增強核苷酸信號的方法

2023-05-29 11:09:06

專利名稱：通過拉曼散射增強核苷酸信號的方法
技術領域：
本發明的方法和裝置涉及分子和生物學和基因組學領域。更具體說，這些方法和裝置涉及核酸測序。
背景遺傳信息以極長的脫氧核糖核酸(DNA)分子貯存，組成在染色體中。人類基因組含有大約30億個鹼基的DNA序列。此DNA序列信息決定了各個體的多種特徵。許多常見病的基礎至少部分在於DNA序列中的變異所致。
測定人類基因組的全序列為鑑定這類疾病的遺傳原因提供了基礎。然而，鑑定與各疾病相關的遺傳變異仍有大量工作要做。這需要測定顯示各疾病個體或家族的染色體部分中的DNA序列，以鑑定DNA序列中促進此病的特異性變化。也可測定核糖核酸(RNA)，一種遺傳信息加工中的中間分子，的序列來鑑定各種疾病的遺傳基礎。
目前基於檢測已按大小分離的螢光標記核酸的核酸測序方法，受到可測序核酸長度的限制。通常一次只能測定500-1,000個鹼基的核酸序列。這比稱為基因，可長達數萬或甚至數十萬個鹼基的功能性DNA單位的長度短得多。採用目前的方法測定完整基因序列要求產生該基因的許多拷貝，將其切成重疊的片段並測序，然後可將重疊的DNA序列裝配成完整的基因。此過程費力、費錢、效率低和費時。
附圖的簡要說明以下附圖構成本說明書的一部分並包括在其中，以進一步說明本發明公開實施方式的某些方面。參見這些附圖的一個或多個，結合本文提供的對本發明實施方式的詳細描述，可更好地了解本發明的實施方式。


圖1說明採用共價結合於拉曼標記的核苷酸16，測定核酸13序列的示範性裝置10(未設比例尺)和方法。
圖2說明測定核酸13序列的示範性裝置100(未設比例尺)和方法，其中釋放的核苷酸130共價結合於納米微粒140，然後用表面增強拉曼光譜(SERS)180檢測。
圖3說明核酸13測序的其它示範性裝置210(未設比例尺)。
說明性實施方式的描述本文公開的方法和裝置用於快速自動化測定核酸13的序列。本發明的具體實施例中，這些方法和裝置10、100、210適合於獲得非常長的，1,000以上、2,000以上、5,000以上、10,000以上、20,000以上、50,000以上、100,000以上甚至更長的核酸分子的序列。超過現有方法的優點包括能在上次測序過程中讀取長核酸13的序列；獲得序列數據的速度更快；測序費用降低和每單位序列數據所需操作時間內效率更高。
本發明的各種實施例中，可在一次測序過程中，用一個核酸分子13獲得序列列信息。在本發明其它實施例中，可平行或依次測定多個拷貝核酸分子13的序列，以驗證該核酸序列或獲得完整的序列數據。在本發明另外的實施例中，可測定核酸分子13及其互補鏈的序列發言權驗證序列信息的準確性。
本發明某些實施例中，侍測序的核酸13是DNA，雖然考慮也可測定含RNA或合成性核苷酸同類物的其它核酸。以下詳述包括許多細節以提供對本發明公開實施方式的更全面了解。然而本領域技術人員懂得無須這些具體細節即可實施本發明的實施方式。此外，本文對本領域熟知的裝置、方法、程序和各種組分不作詳述。
圖1所示本發明的各種實施例中，核苷酸可共價結合於拉曼標記，以提高表面增強拉曼光譜(SERS)、表面增強共振拉曼光譜(SERRS)、相干反斯託克斯拉曼光譜(CARS)或其它已知的拉曼檢測技術可檢測到的拉曙信號。在本發明的一些實施例中，可將這類標記的核苷酸，用標準的核酸聚合技術加入到新合成的核酸鏈13中。通常使特定序列的旨物或一種或多種隨機引物與模板核酸雜交。加入聚合酶和標記的核苷酸後，拉曼標記的核苷酸結合於引物的3』端，導致形成序列上與該模板互補的標記的核酸鏈13。
合成後，標記的核酸鏈13可用一種或多種外切核酸酶15消化。該領域技術人員知道上述方法不限於外切核酸酶15本身，而且可採用能從核酸13的至少一端依次去除核苷酸16、130的任何酶或其它試劑。在本發明的一些實施例中，從標記的核酸13的3』端17位依次釋放拉曼標記核苷酸16、130。與標記核酸13分離後，用檢測單元18、180、300檢測拉曼標記核苷酸16、130。依次檢測標記核苷酸16、130的信息可用於編輯標記核酸13的序列，其與模板鏈的序列互補。
在本發明的一些實施例中，在外切核酸酶15外理前，可將標記的核酸鏈13與未標記的模板鏈及未摻入的核苷酸相分離。這可通過用已與表面14交聯的或含生物素或類似基團能與表面14結合的引物來實現。生物素標記的引物能結合於已用親和素或鏈黴親和素修飾的表面14。標記的核酸13可用已知技術與未標記的模板鏈相分離。
在本發明某些實施例中，四種核苷酸可各自結合一可鑑別的拉曼標記。在本發明的其它實施例中，可只標記嘌呤核苷酸(胞嘧啶和/或胸腺嘧啶和/或尿嘧啶。在一示範性實施例中，該標記核苷酸可含有生物素標記的脫氧胞嘧啶-5』-三磷酸(生物素-dCTP)和地高辛標記的脫氧尿嘧啶-5』-三磷酸(地高辛-dUTP)。
在圖2所示本發明的其它實施例中，可通過將核苷酸16、130共價結合於納米微粒140而增強拉蠱惑信號。在本發明的一些實施例中，這種結合可在如圖1所示外切核酸酶15處理核酸13之後。在本發明的一些實施例中，納米微粒140是銀或金，但可考慮已知能提供表面增強拉曼信號的其它納米微粒140。納米微粒可以是單個納米微粒140，納米微粒140的凝聚物，或單個和凝聚的納米微粒140的某些混合物。在本發明的某些實施例中，可採用接頭化合物將核苷酸16、130結合於納米微粒140。在本發明的各種實施例中，此接頭化合物可以長1-1000納米(nm)之間，2-90nm、3-80nm、4-70nm、5-60nm、10-50nm、15-40nm或20-30nm。在本發明的某些實施例中，此接頭化合物可長1-50nm、1-5nm、2-10nm、10-20nm或約5nm。在本發明其它實施例中，二個或多個納米微粒可用接頭化合物結合在一起。
共價結合後，可使納米微粒-核苷酸複合物150通過流通小室170、290，在其中受到檢測單元18、180、300的SERS、SERRS和/或CARS檢測。在本發明的一些另外實施例中，可不修飾核苷酸16、130；而在在本發明其它的另外實施例中，可用一種或多種拉曼標記修飾核苷酸16、130。在本發明某些實施例中，可將各種核苷酸結合於可鑑別的拉曼標記。其它實施例中，只標記嘧啶16、130。
定義如本文所用，「一個」或「一種」可表示一個或一個以上項目。
如本文所用，「操作性連接於」指二個或多個單位之間的功能性相互作用。例如，如果檢測儀21、310安置的位置當分析物如核苷酸16、130經過流通小室170、290時能檢測它們，則稱檢測儀21、310與流通小室170、290「操作性相連接」。
「核酸」13包括DNA、RNA、單鏈、雙鏈或三鏈及它們的任何化學修飾物。實際上考慮了核酸13的任何修飾。如本文所用，單鏈核酸13可用前綴「ss」表示，雙鏈核酸13可用前綴「ds」表示，三鏈核酸13可用前綴「ts」表示。
「核酸」13可以是幾乎任何長度，可長10、20、30、40、50、60、75、100、150、200、250、300、400、500、600、700、800、900、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000、6000、7000、8000、9000、10,000、15,000、20,000、30,000、40,000、50,000、75,000、100,000、150,000、200,000、500,000、1,000,000、1,500,000、2,000,000、5,000,000個或更多個鹼基，直至全長染色體DNA分子13。
「核苷酸」16、130是含有嘌呤或嘧啶鹼基(腺嘌呤--「A」，胞嘧啶--「C」，鳥嘌呤--「G」，胸腺嘧啶--「T」或尿嘧啶--「U」)或它們的任何化學修飾物或結構同類物，與五糖如脫氧核糖、核糖或五糖的衍生物或同類物共價結合的分子。
「核苷酸」16、130指還包含一共價結合五糖的磷酸基團的核苷酸16、130。在本發明的一些實施例中，核苷酸16、130是核糖核苷單磷酸16、130或脫氧核糖核苷單磷酸16、130，雖然預計可能產生核苷二磷酸或三磷酸並檢測。在本發明其它實施例中，楞從核酸分子13釋放核苷酸16、130。考慮可在核苷酸16、130結構中製造各種取代或修飾，只要能利用聚合酶作用將它們摻入核酸13中並用外切核酸酶15或等價試劑使用使其釋放。
「拉曼標記」是能產生可檢測拉曼信號的有機或無機分子、原子、複合物或結構，包括但不限於合成的分子、染料、天然產生的色素如藻紅蛋白、有機納米結構如C60、巴克球(buckyball)和碳納米管、金屬納米結構如金或銀納米微粒、或納米稜鏡和繆米半導體如量子小球。下面將描述拉曼標記的許多實例。該領域技術人員知道這些實例無限制性，「拉曼標記」包括該領域已知的可用拉曼光譜檢測的有機或無機原子、分子、化合物或結構。
核酸侍測序的核酸分子13可用該領域已知技術製備。在本發明某些實施例中，核酸13是天然產生的DNA或RNA分子。實際上任何天然產生的核酸13均可用已發表的方法製備和測序，不限於染色體、線粒體和葉綠體DNA和核糖體、轉運性異質性核內和信使RNA(mRNA)。製備和分離不同形式的核酸13的方法是已知的(見例如，Guide toMolecular Cloning Techniques，Berger和Kimmel編，Academic Press，New York，NY，1987；Molecular CloningA Laboratory Manual，第二版，Sambrook，Fritsch和Maniatis編，Cold Spring Harbor Press，Cold Spring Harbor，NY，1989)。所引用參考文獻中公開的方法只是示範性的，可採用該領域已知的改進。當侍測序單鏈DNA(ssDNA)時，可用已知方法從雙鏈DNA(dsDNA)製備ssDNA13。這些方法包括加熱dsDNA使此鏈分離，或也可用已知的擴增或複製方法，例如克隆入M13中，從dsDNA製備ssDNA。
雖然本發明的某些實施例涉及製備天然產生的核酸13，實際上可測定可作為外切核酸酶或等價試劑15底物的任何類型的核酸13。例如，可測定用各種擴增技術如聚合酶鏈反應(PCRTM)擴增製備的核酸13的序列。(見美國專利4,683,195；4,683,202和4,800,159)。或可將侍測序的核酸13克隆入標準載體如質粒、粘粒、BAC(細菌的人造染色體)或YAC(酵母菌人造染色體)中。(見例如，Berger和Kimmel，1987；Sambrook等，1989)。可用例如適當的限制性內切酶切割，然後作瓊脂糖凝膠電泳，從載體DNA中分離得到核酸插入物13。插入物核酸13的分離方法是眾所周知的。
分離單個核酸分子在本發明某些實施例中，可採用一米射流或納米射流技術選揀和分離核酸分子13。可利用流體動力學將核酸13移動進入微通道、毛細管或微孔中。在本發明的一實施例中，利用流體動力使核酸13通過梳狀結構而分成單個核酸分子13。一旦核酸分子13被分離，可利用流體動力將分子13定位於反應室11、220中。也可利用熱能、電能、壓力或真空力提供操縱核酸13的動力。在本發明的示範性實施例中，為測序操縱核酸13可包括利用通道構塊設計，摻入顯微製作的通道和整合的凝膠材料(見美國專利5,867,266和6,214,246)。
在本發明的其它實施例中，可稀釋含核酸分子13的樣品，然後將其偶聯於固定表面14。在本發明的示範性實施例中，該固定表面可以是磁性或非磁性珠或其它不不連續的結構單元。適當稀釋後，每個珠14具有結合零個或一個核酸分子13的統計學概率。可用例如，螢光染料和流式細胞計數儀選揀或磁性選取揀，鑑定具有一個結合的核酸分子13的珠14。取決於珠14和核酸13的相對大小和均勻性，可採用磁性濾器和質量分離來分離含一個結合的核酸分子13的珠14。在本發明的其它實施例中，可測定結合一個珠或其它固定表面14的多個核酸13的序列。
在本發明的另外實施例中，可利用包被的纖維尖頭14產生一分子核酸13用於測序(如美國專利6,225,068)。在另外其它實施例中，可製備固定的表右14使含有一分子親和素或其它交聯試劑。這樣表面14可結合一個侍測序的生物素化核酸分子13。此實施例不限於親和素-生物素系統，可適合於任何已知的偶聯繫統。
在本發明另外其它實施例中，可利用光陷井(濾波器)操縱侍測序的一分子核酸分子13(如美國專利5,776,674)。典型的光陷井系統可從Cell Robotics，Inc.(Albuquerque，NM)，S+L GmbH(海德堡，德國)和P.A.L.M.Gmbh(Wolfratshausen，德國)獲得商品。
拉曼(Raman)標記本發明某些實施方式可涉及使一標記結合於核苷酸16、130以有利於通過檢測單元18、180、300對它們的檢測。能用於拉曼光譜的標記的非限制性例子包括TRIT(四甲基羅丹明異硫氰酸鹽)、NBD(7-硝基苯-2氧雜-1，3-二重氮)、德克薩斯紅染料、苯二甲酸、對苯二甲酸、間苯二酸、甲苯基快紫、甲苯基蘭紫、亮甲苯蘭、對氨基苯甲酸、視紅質、生物素、地高辛、5-羧基-4』，5』-二氯-2』，7』-二甲氧螢光素、5-羧基-2』，4』，5』，7』-四氯螢光素、5-羧基螢光素、5-羧基羅丹明、6-羧基史丹明、6-羧基四甲基氨基酞菁、偶氮甲鹼、花菁、黃嘌呤(Zanthine)、琥珀醯螢光素和氨基吖啶。這些和其它拉曼標記可獲自商品來源(如Molecular Probes，Eugene，OR)。
如該領域所知，聚環芳香化合物可起著拉曼標記功能。可用於本發明具體實施例的其它標記包括氰化物、硫醇、氯、溴、甲基、磷和硫。本發明的某些實施例中，碳納米管可用作拉曼標記。諸標記在拉曼光度法中的用途是已知的(如美國專利5,306,403和6,174,677)。該領域技術人員知道所用的拉曼標記應產生可監別的拉曼光譜，並可特異性結合或連接不同類型的核苷酸16、130。
可將標記直接結合於核苷酸16、130或可通過各種接頭化合物結合。用於所述方法的交聯試劑和接頭化合物下面將進一步描述。或者，共價結合於拉曼標記的的核苷酸可得自標準的高品化來源(如Soche Molecular Biochemicals，Indianapolis，IN；Promega Corp.，Madison，WI；Ambion，Inc.，Austin，TX；Amersham PharmaciaBiotech，Piscataway，NJ)。含設計的能與其它分子如核苷酸16、130共價反應的反應基團的拉曼標記可從商業上獲得(如Molecular Probes，Eugene，0R)。製備標記核苷酸並將它們加入核酸13中的方法是已知的(如美國專利4,962,037；5,405.747；6,136,543；6,210,896)。
納米微粒本發明某些實施方式涉及利用納米微粒140來增強獲自核苷酸16、130的拉曼信號。在本發明某些實施例中，此納米微粒140是銀或金納米微粒140，雖然可採用能提供表面增強拉曼光譜(SERS)的任何納米微粒。本發明另一些些實施例中，該納米微粒140可以是納米稜晶(Jin等，Science 294；1902-3，2001)。在本發明各種實施例中，可用的納米微粒140的直徑在1納米至2微米之間。在本發明其它實施例中，考慮納米微粒140的直徑在2nm-1μm、5nm-500nm、10-200nm、20nm-100nm、30-80nm、40-70nm或50-60nm。在本發明某些實施例中，考慮納米微粒140的平均直徑為10-50nm、50-100nm或約100nm。納米微粒140開態可以是大略的球形，捧狀，稜角形，多面體形或尖頭形，雖然可採用任何形狀或不規則形狀的納米微粒140。製備納米微粒的方法是已知的(如美國專利6,054,495；6,127,120；6,149,868；Lee和Meisel，J.Phys.chem.86；3391-3395，1982；Jin等，2001)。納米微粒也可獲自商業來源(如Nanoprobes Inc.，Yaphank，NY；Polysciences，Inc.，Warrington，PA)。
本發明某些實施例中，納米微粒140可以是單個的納米微粒140和/或納米微粒140的隨機凝聚物(膠質納米微粒140)。在本發明其它實施例中，可將納米微粒140交聯產生納米微粒140的顆粒狀凝聚物，如二聚體、三聚體、四聚體或其它凝聚體。本發明某些其它實施例可採用不同大小凝聚物的不均一混合物，而其它另外實施例可採用納米微粒140的均質群。本發明某些實施例中，可用已知方法如蔗糖溶液超離心，富集或純化含有所選數量納米微粒140(二聚體，三聚體等)的凝聚物。在本發明各種實施方式中，納米微粒140凝聚物的大小考慮約為100、200、300、400、500、600、700、800、900至1000nm或更大。
交聯納米微粒140的方法是已知的(如Feldheim，「Assembly of metalnanoparticle arrays using molecular bridges，」The Electrochemical SocietyInterface，Fall，2001，22-25頁)。金納米微粒140你如可用帶有末端巰基或硫氫基的雙功能接頭化合物交聯。與金納米微粒140反應時，接頭形成的納米微粒140二聚體被該接頭的長度分開。在本發明其它實施方式中，可採用具有三個、四個可多個巰基的接頭同時結合多個納米微粒140(Feldheim，2001)。採用比接頭化合物過量的納米微粒140可防止形成多種交聯和納米微粒140沉澱。可用該領域已知的標準合成方法形成銀本發明某些實施方式可涉及140的凝聚物。
在本發明另一些實施例中，可修飾納米微粒140使其含各種反應基團，然後使它們結合接頭化合物。修飾的納米微粒140可從商業上獲得，如Nanoprobes，Inc.(Yaphank，NY)的Nanogold納米微粒140。可獲得的Nanogold納米微粒140每全顆粒結合有一個或多個馬來醯亞胺基、氨基或其它基團。也可獲得陽電荷或陰電荷形式的Nanogold納米微粒140。這種修飾的納米微粒140可結合於多種已知的接頭化合物而提供納米微粒140的二聚體、三聚體或其它凝聚物。
所用的接頭化合物類型無限制，只要其可導致產生不會在溶液中沉澱的納米微粒140的小凝聚物。本發明某些實施例中，接頭基團可包括苯乙炔聚合物(Feldheim，2001)。另外，接頭基團可含聚四氟乙烯、聚乙烯酯、吡咯烷酮、聚苯乙烯、聚丙烯、聚丙醯胺、聚乙烯或其它已知聚合物。所用接頭化合物不限於聚合物，也可包括其它類型分子，如矽烷、烷類、衍生的矽烷或衍生的烷類。
本發明各種實施例中，納米微粒140可共價結合於核苷酸16、130。本發明另外實施例中，核苷酸16、130可直接結合於納米微粒140，或可結合共價或非共價連接於納米微粒140的接頭化合物。在本發明此類實施例中，接頭化合物不是用於將二個或多個納米微粒140交聯在一起，而是用於將核酸16、130結合於納米微粒140或納米微粒140凝聚物。在本發明具體實施例中，用衍生的矽烷包被納米微粒140。這種修飾的矽烷可用標準方法共價結合於核苷酸16、130。也可採用下述各種將核酸13交聯於表面14的已知方法，使核苷酸16、130結合於納米微粒140。考慮用於結合核苷酸16、130的接頭化合物可以是任何長度，範圍從約0.05、0.1、0.2、0.5、0.75、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、27、30、35、40、45、50、55、60、65、70、80、90至100nm或甚至更長。本發明某些實施方式可採用不均一長度的接頭。
在本發明其它實施例中，可將核苷酸16、130吸附在納米微粒140的表面，或可密切靠近納米微粒140(約0.2-1.0nm之間)。該領域技術人員知道為了產生SERS、SERRS或CARS的增強的拉曼信號，不需要將核苷酸16、130共價結合於納米微粒140。
在圖2所示本發明示範性實施方式中，核苷酸130結合實際於納米微粒140，隨著它們運行到微射流通道160時形成核苷酸一納米微粒複合物150。在本發明某些實施例中，發生交聯反應所需時間長度可能是非常有限的。這類實施方式可採用具有快速反應率的高度反應交聯基團，如環氧基、疊氮基、芳基偶氮基、三嗪基或重氮基。在本發明某些實施方式中，交聯基團可以通過暴露於強光，如雷射，而被光激活。例如，光激活重氮或疊氮化合物導致分別形成高反應性卡賓(carbene)和氮賓(nitrene)基團。本發明某些實施例中，可選擇反應基團，使它們可只將納米微粒140結合於核苷酸16、130，而不會使納米微粒140相互交聯。選擇和製備能結合核苷酸16、130的反應性交聯基團是該領域所知的。本發明另外的實施例中，可共價修飾核苷酸14、130本身，例如利用可結合金納米微粒140的硫氫基。
本發明某些實施例中，可用該領域已知的方法，如微射流學、納米射流學、流體動力學聚焦或電滲透法使納米微粒140進入微射流通道120、160、270、280。在本發明某些實施例中，採用帶電的接頭化合物或帶電的納米微粒140通過採用電場梯度可能有利於操縱納米微粒140。
核酸的固定如圖1所示的本發明某些實施例中，可將一種或多種核酸分子13結合於表面14，如功能人的玻璃、矽、矽酸鹽、PDMS(聚二甲基矽烷)、聚偏二氟乙烯(PVDF)、銀或其它金屬包被的表面、石英、塑料、PIFE(聚四氟乙烯)、PVP(聚乙烯吡咯烷酮)、聚氯乙烯、聚甲基異丁烯酸鹽、聚二甲基矽烷、聚苯乙烯、聚丙烯、聚丙烯醯胺、乳膠、尼龍、硝酸纖維、玻璃珠、磁珠、含有光反應基團如氮賓、亞碳化和羰遊基(ketyl)能與核酸分子13形成共價連接的光聚合物(見美國專利5,405,766和5,986,076)或該領域已知的可能具有能加入此表面14的功能基團如氨基、羧基、巰基、羥基或Diels-Aider反應劑的任何其它物質。
在本發明某些實施例中，表面功能基團可共價結合交聯化合物，這樣核酸分子13和外切核酸酶15和/或聚合酶之間的結合相互反應可發生而無空間障礙。典型的交聯基團包括乙二醇寡聚物和二胺。結合可以是共價或非共價結合。使核酸分子13與表面14結合的各種方法是該領域已知的，可以採用。本發明某些實施例中，核酸分子13被固定和浸沒的位置在微液體流下遊的流徑13和/或微射流通道110、160、260、280中，它們將釋放的核苷酸16轉運通過檢測單元18、180、300。在非限制性實例中，此微液體流可產生自眾多溶劑流向下遊流徑12和/或微射流通道110、160、260、280。
在本發明其它實施例中，大量培養液只緩慢流動或不流動，但溶液中的帶電物質(如帶負電的核苷酸16、130)對外加電場的反應是流向下遊的流徑12和/或微射流通道110、160、260、280。
可採用各種方法實現核酸分子13的固定。在本發明一示範性實施例中，可用鏈黴親和素或親和素包被表面14，然後結合生物素化核酸13而實現固定(Holmstrom等，Anal.Biochem.209278-83，1993)。實現固定也可用聚L-賴氨酸或聚L-Lys，苯基丙氨酸包被矽、玻璃或其它表面，然後用雙功能交聯試劑共價結合氨基或巰基修飾的核酸13(Running等，Biotechniques 8276-277，1990；Newton等，Nucleic AcidsRes.211155-62，1993)。胺殘基可通過利用氨基矽烷包被在表面14上。
可將5』-磷酸化的核酸13直接共價結合於化學修飾的表面14(Rasmussen等，Anal.Biochem.198138-142，1991)。與水溶性碳二亞胺凝縮可形成核酸13與表面14之間的共價結合。此法有利於核酸13通過其5』-磷酸的優勢5』-結合。
DNA13常通過先矽化玻璃表面14，然後用碳二亞胺或戊二醛活化而結合於玻璃。另外的方法可採用試劑如3-環氧丙氧基三甲氧基矽烷(GOP)或氨基丙基三甲氧基矽烷(APTS)，通過加入在該分子3』或5』端的氨基接頭與DNA13連接。DNA13可用紫外光照直接結合實際於膜表面14。其它核酸13固定技術的非限制性實例見美國專利5,610,287；5,776,674和6,225,068。
在本發明的各種實施例中可用雙功能交聯試劑將例如核酸分子13結合於表面14雙功能交聯試劑可按它們的功能基團如氨基、胍基、吲哚基或羧基的特異性分離。交聯分子的示範性方法見美國專利5,603,872和5,401,511。交聯試劑包括戊二醛(GAD)、雙功能環氧乙烷(OXR)、乙二醇二環氧甘油醚(EGDE)和碳二亞胺如1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳二亞胺(EDC)。
核酸的的合成聚合酶本發明某些實施方式包括合成性試劑如DNA聚合酶與引物分子結合，將拉曼標記的核苷酸加入到該引物的3』端。聚合酶的非限制性例子包括DNA聚合酶、RNA聚合酶、逆轉錄酶和RNA-依賴的RNA聚合酶。這些聚合酶在它們的「校對」活性和需要或不需要引物和啟動子序列方面的差異是該領域知道的。當RNA聚合酶用作聚合酶時，待測序的模板分子可以是雙鏈DNA。聚合酶的非限制性例子包括Thermatogamaritime DNA聚合酶、AmplitaqFSTMDNA聚合酶、TaquenaseTMDNA聚合酶、ThermoSequenaseTM、Taq DNA聚合酶、QbetaTM複製酶、T4DNA聚合酶、Thermusthermophilus DNA聚合酶、RNA-依賴的RNA聚合酶和SP6RNA聚合酶。
許多聚合酶可從商業上獲得，包括Pwo DNA聚合酶(Boehringer MannheimBiochemicals，Indianapolis，IN)、Bst聚合酶(Bio-Rad Laboratories，Hercules，CA)；IsoThermTMDNA聚合酶(Epicentre Technologies，Madison，WI)、莫洛尼小鼠白血病病毒逆轉錄酶、Pfu DNA聚合酶、禽髓母細胞症病毒逆轉錄酶、Thermus flavus(Tfl)DNA聚合酶和Thermococcus litoralis(Tli)DNA聚合酶(Promega Corp.，Madison，WI)、RAV2逆轉錄酶、HIV-1逆轉錄酶、T7RNA聚合酶、T3RNA聚合酶、SP6RNA聚合酶、大腸桿菌RNA聚合酶、Thermus aquqticus DNA聚合酶、T7DNA聚合酶、+/-3』→5』外切核酸酶、DNA聚合酶I的Klenow片段、Thermus『ubiquitous』DNA聚合酶和DNA聚合酶I(Amersham Pharmacia Biotech，Piscataway，NJ)。可採用該領域已知的能使標記核苷酸模板依賴性聚合的任何聚合酶。(見例如，Goodman和Tippin，Nat.Rev.Mol.Cell Biol.1(2)101-9，2000；美國專利6,090,589)。採用聚合酶從標記的核苷酸合成核酸13的方法是已知的(如美國專利4,962,037；5,405,747；6,136,543；6,210,896)。
引物通常引物長10-20個鹼基之間，雖然可採用更長的引物。本發明某些實施例中，設計的引物在序列上與模板核酸分子的已知部分互補。可採用已知的引物序列，例如當所選的引物用於監定與已知的染色體恆定序列相毗連的序列的變異時；當將未知核酸序列插入已知序列的載體時；或當部分測序天然核酸時。合成任何序列的引物方法是已知的。本發明的其它實施例中包括測定缺乏已知引物結合位點的核酸13的序列。此時，可採用隨機引物，例如隨機六聚體或隨機寡聚體來啟動聚合。
核酸的消化圖1所示本發明某些實施例中，核酸13測序的方法包括使用權外切核酸酶15或等價試劑結合於核酸分子13的游離端17，並一次去除核苷酸16、130。可採用的核酸消化酶15的非限制性例子包括大腸桿菌外切核酸酶I、III、V或VII，Bal 31外切核酸酶、綠豆核酸酶、S1核酸酶、大腸桿菌DNA聚合酶I的全酶或Klenow片段、RecJ、外切核酸酶T、T4或T7DNA聚合酶、Taq聚合酶、外切核酸酶T7基因6、蛇毒磷酸二酯酶、脾磷酸二酯酶、Thermococcus litoralis DNA聚合酶、火球菌屬(Pyrococcus sp.)GB-D DNA聚合酶、λ外切核酸酶、S.aureus微球菌核酸酶、DNA酶I、核糖核酸酶A、T1微球菌核酸酶、或其它該領域已知的外切核酸酶。外切核酸酶15可從商業來源上獲得，如New England Biolabs(Beverly，MA)、AmershamPharmacia Biotech(Piscataway，NJ)、Promega(Madison，WI)、Sigma Chemicals(St.Louis，MO)或Boehringer Mannheim(Indianapolis，IN)。
本領域技術人員知道，具有外切核酸酶15活性有酶能除去核酸分子13的5』端、3』端或任一端的核苷酸16、130。它們可能顯示對RNA、DNA或RNA與DNA13二者的特異性。它們的活性取決於所用的單鏈或雙鏈核酸13。它們可能受到鹽濃度、溫度、pH或二價陽離子的不同影響。外切核酸酶15的這些和其它性能是本領域知道的。本發明某些實施例中，可操縱外切核酸酶15活性的速率，與通過檢測單元18、180、300分析核苷酸16、130的最佳速率相一致。已知有多種方法可調節外切核酸酶15活性的速率，包括調節反應室11、220中的溫度、壓力、pH、鹽或二價陽離子的濃度。
雖然通常由外切核酸酶15從核酸13釋放核苷單磷酸16、130，但本發明實施方式不限於檢測任何特定形式的游離核苷酸或核苷16、130，而是包括檢測可能從核酸13釋放的單體16、130。
反應室和集成晶片如圖1所示，本發明某些實施例是關於設施10、100、210，其包括一反應室11、220，設計包含在水環境中的固定表面14、核酸分子13、外切核酸酶15和核苷酸16、130。本發明某些實施例中，該反應室11、220的溫度是可控制的，例如通過加入顆粒小丸成分或該領域已知的其它方法。控制低容量液體溫度的方法是已知的。(見例如美國專利5,038,853；5,919,622；6,054,263和6,180,372。
本發明某些實施例中，如計算機晶片製造和/或微細管晶片製造領域所知，反應室11、220和相關的流體腔室，如流徑12、微射流腔室110、160、260、280或腔室120、230、240、270、350、360都在一批製造過程中製造成與廢物口、與核酸13裝載口、與納米微粒貯藏器370、與外切核酸酶15源或其它流體臉室相連。本發明某些實施例中，反應室11、220和裝置10、100、210的其它組件，如流徑12和/或微射流腔室120、160、260、280可製備成一張集成晶片。可用本領域已知方法，例如光刻平板印刷和蝕刻。然而，製備方法不限於此，可採用該領域已知其它方法，如雷射燒蝕、注模、澆鑄、分子射線晶體取向附生、蘸水筆納米平板印刷、化學蒸發沉積(CVD)製造術、電子束或聚焦離子束技術或印刻技術。本發明某些實施例可採用製造納米電子機械系統的方法(見例如Craigjead，Science2901532-36，2000)。顯微製作晶片可從商業上獲得，例如Caliper Technologies Inc.(Mountain View，CA)ACLARA BioSciences Inc.(Mountain View，CA)。
為有利於通過檢測單元18、180、300檢測核苷酸16、130，含流徑12或流通小室170、290的材料可選用對用於檢測單元18、180、300的激發和發射頻率電磁射線可穿透的材料。玻璃、二氧化矽和通常對用於拉曼光譜的波長可穿透的任何其它材料都可用。本發明某些實施例中，正對著檢測單元18、180、300的流徑12或流通小室的表面，可用銀、金、鉑、銅、鋁或對檢測單元18、180、300相對不能透過的其它材料包被。在此部位採用不透過材料可增強拉曼信號，例如SERS，同時不幹擾檢測單元18、180、300的功能。或者，流徑12或流通小室170、290可包含由銀、金、鉑、銅、鋁或其它拉曼信號增強金屬組成的網罩。
流徑和微射流通道本發明某些實施例中，核酸13所釋放的核苷酸16、130向下流入流徑12和/或微射流通道110、160、260、280通過檢測單元18、180、300。轉運核苷酸16、130技術的非限制性例子包括微射流技術。流徑12和/或微射流通道110、160、260、280可包含一微毛細管(如購自ACLARA BioSciences Inc.，Mountain View，CA)或一流體整合環路(如Caliper Technologies Inc.，Mountain View，CA)。
本發明某些實施例中，待測的核苷酸16、130隨大量流入的溶劑向下流入流徑12和/或微射流通道110、160、260、280。本發明其它實施例中，可用微毛細管電泳將核苷酸16、130轉運流入流徑12和/或微射流通道110、160、260、280。微毛細管電泳通常涉及可裝有或不裝有特殊分離介質的薄毛細管或通道。帶適當電荷的分子，如帶負電的核苷酸16、130在對施加的電場反應中泳動，負電的到裝置10、100、210的反應室11、220側，而正電的到檢測單元18、180、300側。雖然常採用電泳來根據分子大小分離同時加入毛細管中的混合物組分，但也可用電泳來轉運依次從核酸13釋放的類似大小的核苷酸16、130。因為嘌呤核苷酸(A、G)16、130比嘧啶核苷酸(C、T、U)16、130大而移動更慢，可將流徑12和/或微射流通道110、160、260、280的長度，及通過檢測單元18、180、300的相應運送時間保持最小，以防止因混淆核酸13釋放核苷酸16、130的順序而產生的遷移差異。或者，可選擇充填微毛細管的介質，使嘌呤和嘧啶核苷酸向流徑12和/或微射流通道110、160、260、280遷移的速率相似或相同。毛細管電泳的方法已公開，例如可參見Wooley和Mathies(Proc.Natl.Acxad.Sci.USA 9111348-352，1994)。
本發明某些實施例中，流徑12和/或微射流通道110、160、260、280可含有粘度較高的水性溶液如甘油溶液。這種高粘度溶液的作用是降低流速和增加核苷酸16、130與納米微粒140交聯所需的反應時間。
顯微製作微射流裝置包括毛細管電泳裝置的方法已公開，例如見Jacobsen等(Anal.Biochem，209278-83，1994)；Effenhauser等(Anal.Chem.662949-53，1994)；Harrison等(Science 261895-97，1993)和美國專利5,904,824。這些方法包括用標準光刻平板照相術製作的含矽網罩的微鑄模技術，或聚焦離子束技術，或二氧化矽、矽或其它晶體基質或晶片上的微米級通道光刻平板蝕刻術。這些技術可不難採用於上述方法和設施中。本發明某些實施例中，可以製作反應室11、220所用的相同材料，用該領域已知技術製作毛細管。
檢測單元本發明各種實施例中，設計檢測單元18、180、300用拉曼光譜來檢測和定量核苷酸16、130。用拉曼光譜檢測核苷酸16、130的方法是該領域已知的(見例如美國專利5,306,403；6,002,471；6,174,677)。已公開了表面增強拉曼光譜(SERS)、表面增強共振拉曼光譜(SERRS)和相干反斯託克斯拉曼光譜(CARS)上的變化。對於毗鄰粗糙的金屬表面，如銀、金、鉑、銅或鋁表面的分子，拉曼檢測的靈敏度增強系素為106。
拉曼檢測單元18、180、300的非限制性實例公開在美國專利6,002,471中。頻率倍增的釹釔鋁石榴石雷射19,320產生531nm波長，或頻率倍增的鈦蘭寶石雷射19,320產生波長365nm的激發光束20、330。可採用脈衝式雷射光束20、330或連續雷射光束20、330。激發光束20、330通過共聚焦光片和顯微鏡目鏡聚焦在光徑12和/流通小室170、290上。顯微鏡目鏡和共聚焦光片收集核苷酸16、130的拉曼發射光，耦合於單色器進行光譜解離。該共聚焦光片包括二色性濾片、屏蔽濾片、共聚焦針孔、透鏡和減少背景信號的鏡子。也可採用標準的全視野光片作為共聚焦光片。拉曼檢測器21、310所檢測的拉曼發射信號包括與計算機介面的崩塌光電二極體以計數信號和使其數位化。
拉曼檢測單元18、180、300的另一實例見美國專利5,306,403所述，包括Spex1403型雙光柵分光光度計21、310和砷化鎵光電倍增管(RCA C31034型或BurleIndustries C3103402型)，以單光子計數模式操作。激發源19,320包括SpectraPhysics 166型514.5nm線性氬離子雷射器19,320和氪離子雷射器19,320的647.1nm線(Innova 70，Coherent)。
替代激發源19,320包括337nm的氮雷射器19,320(Laser Science Inc.)和325nm氦-鎘雷射器19,320(Liconox)(美國專利法6,174,677)，光發射二極體19,320，釹YLF雷射器19,320，和/或各種離子雷射器19,320和/或染料雷射器19,320。激發光束20、330可用帶通濾波器(Corion)作光譜純化，並可用6倍物鏡(Newport，L6X型)聚焦在流徑12和/或流通小室170、290上。此物鏡可同時用於激發核苷酸16、130和收集拉曼信號，採用全息光束分解器(Kaiser Opital Systems，Inc.，HB647-26N18型)產生激發光束20、330和發射的拉曼信號正確角度幾何形狀。可用全息凹口濾光器(Kaiser Optical Systems，Inc.)來減少Rayleigh散發光。其它拉曼檢測器21、310包括配備有紅色增強強化電偶合裝置(RE-ICCD)檢測系統(PrincetonInstruments)的ISA HR-320攝譜儀。可採用其它類型檢測21、310，例如傅立葉-轉化攝譜儀(依據Michaelson幹涉儀)、帶電注射裝置、光電二極體陣列、InGaAs檢測儀、電子倍增CCD、強化CCD和/或光電電晶體陣列。
該領域已知的任何合適形式或構型的拉曼光譜測定法或相關技術均可用於檢測核苷酸16、130，包括但不限於正態拉曼散射、共振拉曼散射、表面增強拉曼散射、表面增強共振拉曼散射、相干反斯託克斯拉曼光譜(CARS)、激發的拉曼散射、逆向拉曼光譜、激發的增益拉曼光譜、超拉曼散射、分子性可見雷射檢測儀(MOLE)或拉曼顯微探測或拉曼顯微鏡或共聚焦拉曼顯微分光計、三維或掃描拉曼、拉曼色飽和光譜、時間分辨共振拉曼、拉曼去偶合光譜或UV-拉曼顯微鏡。
信息加工、控制系統和數據分析本發明某些實施例中，核酸測序裝置10、100、210可包括-信息加工系統。上述方法和裝置10、100、210不限於所用的信息加工系統的類型。示範性信息加工系統可加入一含有交流信息的匯流線和加工信息的處理器。本發明一實施方式中，從奔騰(Pentium)處理器家族選擇處理器，包括但不限於可從Intel公司獲得的奔騰處理器II家族、奔騰處理器III家族和奔騰處理器4家族(Santa Clara，CA)。本發明其它實施例中，此處理器可以是Celeron、Itanium或奔騰Xeon處理器(IntelCorp.，Santa Vlara，CA)。本發明其它各種實施方式中，此處理器可基於Intel結構體系，如Intel IA-32或Intel IA-64結構。或者可採用其它處理器。信息加工和控制系統還可包括該領域已知的外圍裝置，如存貯器、顯示器、鍵盤和/或其它裝置。
在本發明的具體實施例中，檢測單元18、180、300可操作性連接于于信息處理系統。處理器加工檢測單元18、18、300的數據並將數據存放在貯存器中。標準核苷酸16、130發射光圖數據也可存放在貯存器中。處理器可比較核苷酸16、130在流徑12和/或流通小室170、290中的發射光譜以鑑定核酸分子13釋放的核苷酸16、130的類型。貯存器也可保存核酸分子13釋放的核苷酸16、130的序列。貯存器可分析檢測單元18、180、300的數據，以確定核酸13的序列。該信息處理系統也能執行標準程序如當測定重疊的信號時減去本底信號和「基線召喚(Base-calling)」測定。
雖然可在程序處理器的控制下進行上述方法，但在本發明其它實施例中，這些方法可全部或部分通過任何可編程的或硬編碼(hardcoded)的邏輯，例如欄位可編程門控陣列(Field Programmable Gate Arrays，FPGAs)、TTC邏輯、或應用特異性集成環路(Application Specific Integrated Circuits，ASICs)，來執行。
數據收集操作後，通常將該數據報告給數據分析運算指令。為了促進該分析運算指令，通常如上所述，用數字計算機分析檢測單元18、180、300獲得的數據。通常，該計算機將經過適當編程接受和貯存檢測單元18、180、300的數據，以及分析和報告收集的數據。
在本發明某些實施例中，可採用為顧客設計的軟體包來分析檢測單元18、180、300獲得的數據。在本發明其它實施例中，可用信息處理系統和公眾可得到的軟體包進行數據分析。DNA序列分析可得到的軟體的非限制性例子包括PRISMTMDNA測序分析軟體(Applied Biosystems，Foster City，CA)、SequencherTM軟體包(Gene Codes，ANNArbor，MI)和通過National Biotechnology Information Facility網址www.nbif.org/links/1.4.1.php.得到的各種軟體包。
實施例實施例1用拉曼標記的核苷酸進行核酸測序圖1所示本發明的某些實施例，涉及測定結合於反應室11、220中固定表面14和解構室中拆卸的各單鏈核酸分子的序列。在本發明這些實施例中，反應室11、220中含有一種或多各外切核酸酶，其可從核酸分子13的非結合端17依次每次去除一個核苷酸16、130。
核苷酸16、130釋放後，它們進入流徑12通過檢測單元18、180、300。檢測單元18、180、300包含激發光源19,320，如雷射器，其發射激發光束20、330。激發光束與釋放的核苷酸16、130相互反應，激發電子至較高能量狀態。電子返回較低能量狀態產生的拉曼發射光譜，可用拉曼光譜檢測儀21、310，如分光計、單色儀或電荷偶合器件(CCD)如CCD攝影儀檢測。
反應室和流徑的製備在濃HF(氫氟酸)中短時預先蝕刻硼浮法玻璃晶片(Precision Glass Optics，Santa Ana，CA)，並清洗，然後在等到離子增強化學蒸發沉積(PECVD)系統(PEII-A，Technics West，San Jose，CA)中沉積無定形二氧化矽保護層。晶片用六甲基二矽烷(HMDS)預處理，用光阻材料(Shipley 1818，Marlborough，MA)旋轉包被，並軟烘乾。可用通訊蔽光校直儀(Quintel Corp.San Jose，CA)使帶有一個或多個蔽光圖案的光阻材料暴露，用濃顯微定位顯影劑(Microposit developer concentrate，Ahipley)和水的混合物除去暴光的光阻材料。硬烘乾顯影的晶片並在PECVD反應器中用CF4(四氟化碳)去除暴光的無定形二氧化矽。用濃HF化學蝕刻晶片產生反應室11、220和流徑12。剝去殘留的光阻材料並除去無定形二氧化矽。採用這些方法可製備直徑約50-100μm的顯微通道。較小直徑的通道可用已知方法，例如包塗顯微通道內側面使用權直徑變窄，或用納米光刻術、聚焦電子束、聚焦離子束或聚焦雷射技術製備。
用金剛鑽小鑽頭(Crystalite，Westerville，OH)在蝕刻晶片中鑽出進入孔。在程序控制的真空熔爐(Centurion VPM，J.M.Ney，Yucaipa，CA)中加熱二個互補的蝕刻和鑽孔板，使其相互粘合製備最後的晶片。製作編入反應室11、220和流徑12晶片的其它示範方法見美國專利5,867,166和6,214,246。在本發明某些實施例中，反應室11、220和流徑12之間插有分子量截留值2,500道爾頓的尼龍濾膜以阻止外切核酸酶15離開反應室11、220。
核酸製備和外切核酸酶處理按Sambrook等(1989)純化染色體DNA。用Bam H1消化後，將基因組DNA片段插入pBluescript II粘粒載體(Stratagene，Inc.，La Jolla，CA)的多克隆位點中並在大腸桿菌中培養。接種含氨苄青黴素瓊脂糖平板後，選擇單元個菌落培養以測序。與輔助噬菌體共感染拯救基因組DNA插入物的單鏈DNA拷貝。在蛋白酶K十二烷基磺酸鈉(SDS)溶液中消化後，酚抽提DNA，然後加入乙酸鈉(pH6.5約0.3M)和0.8體識的2-丙醇沉澱DNA。以Tris-EDTA緩衝液重懸含DNA的沉澱物，保存於-20℃直至使用。瓊脂糖凝膠電泳顯示一條純化的DNA條帶。
M13正向引物與位於基因組DNA插入物旁的已知pBluescript序列互補，購自Midland Certified Reagent Company(Midland，TX)。共價修飾這些旨放使含有結合於該寡核苷酸5』端的生物素。此生物素基團通過一(CH2)6臂共價聯接於引物的5』磷酸生物素標記的引物能與從pBluescript載體製備的ssDNA模板分子雜交。此引物模板-複合物然後可結合鏈黴親和素包被的珠(Dorre等，Bioimaging 5139-152，1997)。適當稀釋DNA時，一個引物-模板複合物可結合一個珠14。將含單個引物-模板複合物的珠14插入測序裝置10、100、210的反應室11、220中。
將該引物-模板與修飾的T7DNA聚合酶(United States Biochemical Corp.，Cleveland，OH)一起培育。此反應混合物含有未標記的脫氧腺苷-5』-三磷酸(dATP)和脫氧鳥苷-5-三磷酸(dGTP)、地高辛標記的脫氧尿苷-5』-三磷酸(地高辛-dUTP)和羅丹明標記的脫氧胞苷-5』-三磷酸(羅丹明-dCTP)。合成地高辛和羅丹明標記的核酸13後，使模板鏈與標記的核酸13分離，洗去反應室11、220中的模板鏈、DNA聚合酶和未摻入的核苷酸。
在反應室11、220中加入外切核酸酶III 15以啟動外切核酸酶15的活性。將反應混合物保持在pH8.0和37℃。當核苷酸16、130從核酸13的3』端正17位釋放出來時，微射流流將它們轉運到下遊流徑12，通過檢測單元18、180、300。
標記核苷酸的檢測檢測單元18、180、300包括雷射器19、320和拉曼檢測儀21、310。鈦蘭寶石雷射器19、320(Tsunami by Spectra-Physics)可產生近紅外波長(750-950nm)的激發光束20、330，或鎵鋁砷化物二極體雷射器19、320(Process Instruments的PI-ECL系列)可產生785nm或830nm的激發光束20、330。可採用脈衝雷射束20、330或或連續光束20、330。用二色性鏡子(Kaiser Optical的全息凹形濾片或ChromaakOmega Optical的幹擾濾片)將激發光束20、330反射入帶收集光束的共線幾何結構中。反射光束通過顯微鏡物鏡(Nikon LU系列)聚焦在靶核苷酸16、130位於的微孔、流徑(顯微通道)12或流通小室170、290上。同一顯微鏡物鏡能收集靶核苷酸16、130產生的拉曼散射光，並使其通過二色性鏡子到拉曼檢測儀21、310。拉曼檢測儀21、310包括聚焦透鏡、光譜儀和陣列檢測儀。聚焦透鏡將拉曼蒼白射光會聚通過光譜儀的入口狹縫。光譜儀(RoperScientific)包括能按波長分散光的光柵。被分散的光在陣列檢測儀(RoperScientific的背投射深缺失(deep-depletion)CCD照象機)上成象。陣列檢測儀連接於一控制儀環路。該環路又連接於計算機，用於數據轉輸和控制檢測儀21、310的功能。
拉曼檢測儀能檢測和鑑定通過檢測儀21、310的dATP、dGTP羅丹明-dCTP和地高辛-dUTP的單個核苷酸16、130。編輯和分析標記核苷酸檢測時間過程中的數據，以獲得核酸13的序列。
實施例2採用共價結合於納米微粒進行核酸測序圖2顯示了本發明的另一實施方式。外切核酸酶活化後從核酸13釋放出核苷酸16、130。本發明的某些實施例中，不標記核苷酸16、130。這些實施例不包括將標記的核苷酸用引物和聚合酶摻入互補鏈。而是可直接測定從器官、組織和/或細胞樣品直接純化的，或用已知克隆方法獲得的核酸13的序列。本發明的某些實施例中，可將一個分子的單鏈RNA或DNA13結合於表面14，再用外切核酸酶15處理。釋放的核苷酸16、130通過流徑12。流徑12可與微射流通道110、160、260、280緊鄰或相同。
將反應11、220的核苷酸16、130與金和/或銀納米微粒140混合。按Lee和Meisel(J.Phys.Chem.863391-95，1982)所述製備銀納米微粒140。金納米微粒購自Polysciences，Inc.(Warrington，PA)。從Polysciences，Inc.得到的金納米微粒140大小為5，10，15，20，40和60nm。在此非限制性實施例中，採用60nm的金納米微粒。
表面修飾的納米微粒140在接觸核苷酸16、130之前用矽烷包被，如3-環氧丙氧基三甲氧基矽烷(GOP)，一種活性接頭化合物包被。GOP含有末端高反應性環氧基團。可修飾納米微粒140使含羥基以共價結合於GOP。將矽化納米微粒140與核苷酸16、130混合，形成與核苷酸16、130的共價連接。此核苷酸-納米微粒複合物150通過流通小室170、290，接受拉曼檢測單元18、180、300的SERS、SERRS和/或CARS的鑑定。因為核苷酸16、130密切靠近納米微粒140，拉曼信號大大增強，能檢測出通過流通小室170、290的單個核苷酸16、130。
實施例3核酸測序裝置圖3顯示本發明另一示範性實施例。DNA測序裝置10、100、210包括反應室11、220，其與流入通道230和流出通道240以流體相溝通。可通過採用一個或多個閥門250控制液體流動。微射流通道130、260也與反應室11、220流體溝通。外切核酸酶15活性從一個或多個核酸13釋放的核苷酸16、130存在於反應室11、220，通過微射流通道110、260。核苷酸16、130與納米微粒140混合後流經與微射流通道110、260流體溝通的納米微粒通道120、270。在結合通道160、280中發生核苷酸16、130與納米微粒140的共價結合。此種共價結合的核苷酸-納米微粒複合物150流經流通小室170、290，在那兒核苷酸16、130接受拉曼檢測單元18、180、300的鑑定。檢測單元18、180、300中有雷射器19、320和拉曼檢測儀21、310。雷射器發射激發光束20、330，激發流通小室170、290中的核苷酸16、130。受激發的核苷酸16、130發射拉曼信號，被拉曼檢測儀21、310測定到。
本發明的某些實施例，可在再循環室340中回收納米微粒140。納米微粒可用化學方法，例如酸溶液處理，然後洗去結合的核苷酸16、130、接頭化合物和任何其它附著或吸附的分子。納米微粒140可經再循環通道360再循環至納米微粒存貯器370中。本發明的某些實施例，納米微粒140在再循環通道360和/或納米微粒存貯存器370中，可包被一接頭化合物，如GOP。廢物經廢物通道350從再循環室中流出。
本文公開和聲明的所有方法和裝置可根據此文公開內容無須過多實驗而製備和實施。本領域技術人員知道可對本文所述的方法和裝置進行變化，而不脫離所聲明對象材料的概念、思路和範圍。更具體說，顯然某些化學和物理上相關的物質可替代本文所述的物質而能獲得相同或相似的結果。本領域技術人員知道的所有這些相似的替代物和修飾均認為屬於本發明聲明對象材料的思路、範圍和概念之內。
權利要求
1.一種方法，所述方法包括a)從至少一個核酸的一端依次取下核苷酸；b)使各核苷酸結合於至少一個納米微粒；c)鑑定所述核苷酸；和d)確定所述核酸的序列。
2.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述核酸結合於一表面。
3.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述納米微粒用一種或多種接頭化合物修飾。
4.如權利要求3所述的方法，其特徵在於，所述核苷酸共價結合於所述接頭化合物。
5.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述核苷酸採用表面增強拉曼光譜(SERS)、表面增強共振拉曼光譜(SERRS)和/或相干反斯託克斯拉曼光譜(CARS)鑑定。
6.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述納米微粒含有金和/或銀。
7.如權利要求6所述的方法，其特徵在於，各核苷酸結合於一個納米微粒或納米微粒聚合物。
8.如權利要求1所述的方法，還包括分離所述核苷酸與所述核酸分子。
9.如權利要求5所述的方法，還包括用雷射激發所述核苷酸。
10.如權利要求9所述的方法，其特徵在於，採用電荷偶合器件(CCD)攝相儀來鑑定所述核苷酸。
11.如權利要求1所述的方法，還包括記錄各核苷酸的同一性和各核苷酸被鑑定的時間。
12.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，用外切核酸酶從所述核酸取下所述核苷酸。
13.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述納米微粒直徑在2nm-2μm之間。
14.如權利要求13所述的方法，其特徵在於，所述納米微粒直徑約100nm。
15.一種方法，所述方法包括a)獲得結合拉曼標記的核苷酸；b)合成含標記核苷酸的核酸；c)從該核酸的一端取下核苷酸；d)用拉曼光譜鑑定核苷酸；和e)確定該核酸的序列。
16.如權利要求15所述的方法，還包括使從該核酸取下的核苷酸通過一金屬塗布的通道。
17.如權利要求15所述的方法，其特徵在於，各種核苷酸用可鑑別的拉曼標記物標記。
18.如權利要求15所述的方法，其特徵在於，只有嘧啶核苷酸用拉曼標記物標記。
19.如權利要求15所述的方法，還包括i)獲得至少一種模板核酸分子；ii)使該模板核酸分子與一引物雜交；和iii)加入DNA聚合酶來合成所述核酸。
20.如權利要求15所述的方法，其特徵在於，通過外切核酸酶活性從所述核酸去除所述核苷酸。
21.如權利要求20所述的方法，其特徵在於，一次只使一個核酸接觸外切核酸酶活性。
22.如權利要求15所述的方法，其特徵在於，所述標記的核苷酸採用表面增強拉曼光譜(SERS)、表面增強共振拉曼光譜(SERRS)和/或CARS鑑定。
23.如權利要求22所述的方法，還包括使所述核苷酸結合於納米微粒。
24.一種裝置，其特徵在於，該裝置包括a)一個反應室；b)與所述反應室流體溝通的第一通道；c)與所述第一通道流體溝通的第二通道；d)與所述第一和第二通道流體溝通的流通小室；和e)操作性連接於所述流通小室的檢測單元。
25.如權利要求24所述的裝置，其特徵在於，所述檢測單元包括拉曼檢測儀。
26.如權利要求25所述的裝置，其特徵在於，所述檢測單元包括雷射器和CCD攝像儀。
27.如權利要求24所述的裝置，所述第一通道含有核苷酸，所述第二通道含有納米微粒。
28.如權利要求27所述的裝置，其特徵在於，所述核苷酸共價結合於所述納米微粒。
29.如權利要求28所述的裝置，其特徵在於，所述核苷酸在所述通道中變為共價結合於所述納米微粒。
30.如權利要求28所述的裝置，其特徵在於，所述核苷酸共價結合於所述納米微粒提供了增強的拉曼信號。
全文摘要
這裡所述方法和設備涉及用拉曼光譜法進行核酸測序。在本發明的某些實施方案中，核苷酸在摻入核酸(13)之前共價結合拉曼標記上。外切核酸酶(15)處理標記的核酸(13)導致標記的核苷酸(16，130)的釋放，釋放的核苷酸通過拉曼光譜檢測。在本發明的其它實施方案中，通過外切核酸酶(15)處理由核酸(13)釋放的核苷酸(16，130)共價交聯到銀或金納米微粒(140)，並通過表面增強拉曼光譜(SERS)、表面增強共振拉曼光譜(SERRS)和/或相干反斯託克斯拉曼光譜(CARS)檢測。本發明的其它實施方案涉及用於核酸測序的裝置(10、100、210)。
文檔編號G01N21/29GK1791681SQ03810692
公開日2006年6月21日 申請日期2003年3月11日 優先權日2002年3月14日
發明者X·蘇, A·伯林, T·－W·柯, S·錢, N·孫達拉拉間, 山川峰雄 申請人:英特爾公司