細菌藥物敏感性試驗檢測抗菌素的最小抑菌濃度檢測板的製作方法
2023-05-28 19:54:06
專利名稱：細菌藥物敏感性試驗檢測抗菌素的最小抑菌濃度檢測板的製作方法
專利說明
一、技術領域本實用新型涉及一種細菌藥物敏感性試驗檢測抗菌素的最小抑菌濃度的檢測板。尤其是應用了抗菌素濃度梯度的方式，在固體或半固體培養基表面直接檢測出抗菌素的最小抑菌濃度(Minimal inhibitory concentration，MIC)及用於對細菌進行藥物敏感性試驗。
二、技術背景細菌感染為臨床上最為常見的疾病，通常在確定為何種病原菌感然之後，要進行抗菌素的藥敏試驗及抗菌素的最小抑菌濃度(MIC)的檢測，以確定該致病菌對那種抗生素敏感及該抗菌素的最小抑菌濃度(MIC)，指導醫生選擇敏感的抗菌素及相應的劑量。
現有傳統的方法是一般是將細菌塗布於固體或半固體培養基表面，然後將直徑約0.5釐米的，含一定量抗菌素的濾膜片貼在固體或半固體培養基的表面。將培養皿放入37℃左右孵箱培養過夜，遠離濾膜片的培養基上有均勻的，不透明的苔樣細菌生長。而在濾膜片的附近，對該抗菌素敏感的細菌可圍繞濾膜片形成透亮區，透亮區越大，表明細菌對該抗菌素越敏感；透亮區越小或不形成透亮區，表明細菌對該抗菌素不敏感或有耐藥性。
但用抗菌素濾膜片檢測細菌藥物敏感的方法並不完善，它不能提供抗菌素的最小抑菌濃度(MIC)，MIC是臨床上指導醫生使用抗菌素的很重要的一個指標。如使用抗菌素的濃度低於最小抑菌濃度，抗菌素將不產生抑制細菌生長的治療作用，反而會誘導耐藥菌的產生。雖然，現在臨床上抗菌素的用量一般根據藥廠所提供的參考劑量使用，但病人對抗菌素的反應不一，隨著耐藥菌株感染的擴大，藥廠提供的參考劑量已不能再滿足臨床需要了，抗菌素的使用越來越偏向於個性化。
目前，國外也生產一種可自動檢測細菌對抗菌素敏感性及最小抑菌濃度的設備，但價格十分昂貴，在4-5萬元人民幣以上。在使用該儀器前，首先將細菌接種於透明的96孔塑料板內，各個孔內含有不同濃度的抗菌素，經37℃左右培養過夜後，可見各孔有渾濁不一的細菌生長，含較高抗菌素濃度的孔渾濁度低，而抗菌素濃度低的孔渾濁度高。經儀器掃描照相，通過相應的軟體處理後，可得出抗菌素對細菌的最小抑菌濃度。
但該儀器十分昂貴，一般國內大型醫院還尚未使用。因此，國內現在一般醫院還沒有簡便的方法檢測抗菌素對細菌的最小抑菌濃度(MIC)，這對醫生用藥及病人的治療都是一大不足。本法採用抗菌素濃度梯度條的方式，在固體或半固體培養基的表面直接檢測抗菌素的最小抑菌濃度及細菌的藥物敏感性，可達到指導醫生用藥，幫助病人提高治療效果，又可替代用昂貴儀器檢測抗菌素最小抑菌濃度(MIC)的三大目的。
三
發明內容
本實用新型目的是1尋找一種成本低，可同時檢測細菌對抗菌素的敏感性及抗菌素最小抑菌濃度(MIC)兩個指標的方法及檢測板；2該方法和檢測裝置可直接在細菌培養的固體或半固體培養基表面進行；3臨床醫生可根據該方法定量檢測出最小抑菌濃度，確定抗菌素用量，保證抗菌素治療的有效性；4本實用新型在目前國內條件下，可在低成本上代替昂貴的進口儀器。
本實用新型的目的是這樣實現的應用抗菌素濃度梯度的方式，對生長在固體表面的細菌進行藥物敏感性試驗，檢測抗菌素的最小抑菌濃度(Minimal InhibitoryConcentration，MIC)及細菌對不同抗菌素的藥物敏感性。具體是將含有不同抗菌素濃度的濾膜片固定在一矩形基片上，製備成可檢測細菌藥物敏感性及抗菌素最小抑菌濃度的裝置。基片上的相鄰濾膜抗菌素濃度呈成倍增長，一般由8至13級濃度單位，如從一個單位至4000個單位共13級，一個單位至2000個單位共12級，一個單位至1000個單位共11級，一個單位至500個單位共10級，依此類推。基片一般是矩形的。
本實用新型有以下幾個新特點1在固體或半固體培養基表面，直接應用抗菌素濃度梯度的方式檢測抗菌素的最小抑菌濃度(MIC)；2通過該試驗可獲得以下結果，1觀察細菌對何種抗菌素敏感；2可檢測出抗菌素的最小抑菌濃度(MIC)；3臨床醫生可根據抗菌素的最小抑菌濃度，確定抗菌素的用量，保證抗菌素治療的有效性；4國內目前尚無在固體或半固體培養基表面，對細菌進行藥物敏感性及抗菌素最小抑菌濃度(MIC)兩位一體的檢測方法；5本實用新型實際上提供了一種方法，使用簡便，其檢測抗菌素最小抑菌濃度(MIC)的功能可替代目前國外生產的昂貴的儀器，供各級醫院，獸醫站及食品行業使用。本實用新型可靠，簡便易行，成本低。
四
圖1為本實用新型結構示意圖圖2為現有技術的結構示意圖圖1和圖2為示意圖，顯示了本實用新型發明的基本原理和構成。大圓為含有LB固體培養基的培養皿，1為虛線所圍繞的區域為抗菌素抑制細菌生長所形成的透亮區，圖2中虛線所圍繞的三角形透亮區在實際觀測時呈梨形；2為為抗菌素濃度梯度濾膜條，濾膜條上數字為抗菌素濃度單位；3為苔樣不透亮的細菌生長區；4為現有技術中應用的含一定量抗菌素濃度的濾膜孔。
五具體實施方式
圖2為現在常用的細菌藥敏檢測方法，它只能檢測固定劑量下細菌對某一抗菌素的敏感性；而圖1為本實用新型結構，可見在生長有細菌的平板上形成兩個三角形的透亮區，隨著氨卞青黴素的濃度的增加，透亮區逐步增大，其和濃度梯度濾紙條相交處的濃度即為氨卞青黴素的最小抑菌濃度(MIC)。
所述抗菌素為氨卞青黴素，本實驗中將60毫米長，10毫米寬含有不同濃度的氨卞青黴素濾膜條(從每毫升2000微克至0.5微克不等)置於塗布有大腸桿菌DH5α的固體培養基的表面，經37℃左右過夜培養，可見從每毫升10微克至2000微克處形成一距離從小至大的梨形透亮區，低於每毫升10微克的氨卞青黴素未見有透亮區形成。這一結果說明，當氨卞青黴素在大於每毫升10微克時可產生抑制細菌生長的作用，這是氨卞青黴素對大腸桿菌DH5α的最小抑菌濃度(MIC)。
濾膜條是一個矩形，在製作時可以每個濃度單位的刷子刷塗，每個濃度的寬度4-8mm1製備含濃度梯度的氨卞青黴素片將濾膜片切成2.5毫米長，10毫米寬的小矩形片，分別將含有氨卞青黴素濃度為每毫升2000，1000，500，256，128，64，32，16，8，4，2，1和0.5微克的溶液滴一至兩滴到濾片的表面，涼幹之後，將這些濾膜片粘附於一60毫米長，10毫米寬的硬塑料片上，密封保存於4℃左右備用。另一種製法是(機械化)製作時可以用不同氨卞青黴素濃度單位的刷子刷塗或滾輪滾塗(並列的滾輪)，每個滾輪的寬度即每級濃度的寬度為1.5-5mm，這樣可以製成相鄰抗菌素濃度成倍增長的無限長的濾膜條，切割後使用。2培養大腸桿菌DH5α從-20度冰箱中取出實驗用大腸桿菌株DH5α，溶化後用接種環取一環接種於5毫升無菌，室溫的LB培養液中(蛋白提取物10克，酵母菌提取物5克，氯化鈉10克，加水1升，高壓125度15分鐘消毒)，在37度搖床中每分200次振蕩培養過夜。取50微升細菌塗布於LB培養基表面(蛋白提取物10克，酵母提取物5克，氯化鈉10克，瓊脂15克，加水1升，高壓125度15分鐘消毒，待涼至50度後，取20至30毫升倒入培養皿內)，待完全乾燥後，將含濃度梯度的氨卞青黴素條置於其表面。3觀察含濃度梯度氨卞青黴素的濾膜片片對大腸桿菌生長的抑制作用含濃度梯度的氨卞青黴素濾膜條從高到低按每毫升2000，1000，500，256，128，64，32，16，8，4，2，1和0.5微克排列，和塗布有大腸桿菌DH5α的固體培養基表面相接觸。37度過夜培養後，第二天可發見，從每毫升10微克的濾膜片處至2000微克處形成一距離從小至大的梨形透亮區，低於每毫升10微克的氨卞青黴素未見有透亮區形成，這表明每毫升10微克的氨卞青黴素是該抗菌素的最小抑菌濃度。
本試驗證明，用含有不同濃度的氨卞青黴素濾膜條放在塗布有大腸桿菌DH5α的固體培養基的表面，可觀察到大腸桿菌DH5α對該抗菌素敏感及該抗菌素的最小抑菌濃度。在本實驗中，每毫升10微克的氨卞青黴素濃度即為氨卞青黴素對大腸桿菌DH5α的最小抑菌濃度。根據實驗結果，該方法簡便易行，可推廣至臨床檢驗科室及任何涉及細菌檢驗的單位使用，應用於觀察不同抗菌素對細菌的最小抑菌濃度，及選擇細菌敏感的抗菌素。
權利要求1.檢測抗菌素的最小抑菌濃度檢測板，其特徵是將定量的抗菌素濃度梯度濾膜條固定在基片上，即成為細菌藥物敏感性試驗檢測板。
2.由權利要求1所述的檢測抗菌素的最小抑菌濃度檢測板，其特徵是濾膜條上相鄰抗菌素濃度成倍增長，設有8至13級濃度單位。
3.由權利要求1所述的檢測抗菌素的最小抑菌濃度檢測板，其特徵是濾膜條是矩形。
4.由權利要求2所述的檢測抗菌素的最小抑菌濃度檢測板，其特徵濾膜條上相鄰抗菌素濃度成倍增長，尤其是從一個單位至4000個單位。
5.由權利要求1所述的檢測抗菌素的最小抑菌濃度檢測板，其特徵是濾膜片每級抗菌素濃度寬度1.5-5mm。
6.由權利要求5所述的檢測抗菌素的最小抑菌濃度檢測板，其特徵是將濾膜片切成2.5毫米長，10毫米寬的小矩形片，分別將含有氨卞青黴素濃度為每毫升2000，1000，500，256，128，64，32，16，8，4，2，1和0.5微克的溶液滴一至兩滴到濾片的表面，將這些濾膜片粘附於一60毫米長，10毫米寬的硬塑料片上。
專利摘要檢測抗菌素的最小抑菌濃度檢測板，將定量的抗菌素濃度梯度濾膜條固定在基片上，即成為細菌藥物敏感性試驗檢測板。濾膜條上相鄰抗菌素濃度成倍增長，設有8至13級濃度單位。本實用新型在固體或半固體培養基表面，對細菌進行藥物敏感性及抗菌素最小抑菌濃度(MIC)兩位一體的檢測手段；使用簡便，其檢測抗菌素最小抑菌濃度(MIC)的功能可替代目前國外生產的昂貴的儀器，供各級醫院，獸醫站及食品行業使用。本實用新型可靠，簡便易行，成本低。
文檔編號C12Q1/18GK2564584SQ0226348
公開日2003年8月6日 申請日期2002年8月2日 優先權日2002年8月2日
發明者邢軍, 周春莉 申請人:邢軍, 周春莉