檢測OTOF基因c.3399C>A突變的試劑盒的製作方法

2023-05-29 07:17:56

專利名稱：檢測OTOF基因c.3399C>A突變的試劑盒的製作方法
技術領域：
本發明涉及基因檢測領域，具體涉及用於檢測OTOF基因突變的試劑盒；本發明還涉及新的OTOF突變基因及其在診斷和/或治療感音神經性聾及聽神經病/聽神經病譜系障礙的應用。
背景技術：
聽神經病/聽神經病譜系障礙(Auditory Neuropathy SpectrumDisorders, ANSD)是由第VDI頡神經的聽支受損而引起的一種特殊的感音神經性聾。表現為聲音可以通過外耳、中耳正常的進入到內耳，但聲音信號不能同步地從內耳傳輸到大腦的聽功能異常性疾病。臨床聽力檢查表現為誘發性耳聲發射正常、聽性腦幹反應嚴重異常的一組聽功能障礙症候群。聽神經病譜系障礙多自幼年或青春期起病，在高危嬰幼兒中發病 率約為O. 23%，在各種原因所致的ABR異常的聾病患兒中的發病率高達11%，無性別差異。目前研究表明，聽神經病譜系障礙的發病主要和遺傳、免疫、感染、中毒、代謝等相關因素相關。按照是否合併其他系統疾病可將遺傳性聽神經病譜系障礙分為兩類一類是合併有其它顱神經和/或周圍神經病損的症候群型疾病，如Charot Marie Tooth症候群CMT1型(脫髓鞘型)及CMT2型(軸突型)、費裡德賴希共濟失調症候群等；另一種是僅有聽力下降表現的非症候群型聽神經病譜系障礙。非症候群型聽神經病譜系障礙由於表型單一，基因型與表型之間有較好的對應關係，逐漸成為近年來的研究熱點。Starr等根據發病部位的不同將其分為TYPE I型(病變部位在聽神經)和TYPE II型(病變部位在內毛細胞及突觸)。按照遺傳模式的不同可將遺傳性聽神經病譜系障礙分為常染色體顯性遺傳(AUNAl)、常染色體隱性遺傳(NSRAN)和X連鎖隱性遺傳(AUNXl)以及線粒體DNA突變等。2003年，Varga等運用連鎖分析的方法，將四個家系定位在包含OTOF基因所在的2p23區域內，確定OTOF為第一個發現且較為常見的與非症候群型聽神經病譜系障礙相關的基因。OTOF基因DNA序列全長101496bp，包含48個外顯子，定位於2p23。OTOF基因的編碼區，含終止密碼子如SEQ ID NO. I所示。OTOF長亞型變異體的mRNA長度為7172bp，所編碼的蛋白質otoferlin (如SEQ ID NO. 2所示)包含1997個胺基酸，可能參與突觸囊泡的融合。Otoferlin具有6個I丐離子結合區域(C2domain),其中後4個含有完整的5個天冬氨酸殘基，可以與鈣離子結合，且存在I個羧基端跨膜區域(TM)，這些結構在脊椎動物都是高度保守的。2006年，Petit教授研究小組觀察到小鼠otof基因編碼的蛋白質otoferlin在耳蝸內毛細胞與傳入神經元所形成的帶型突觸處呈高表達。敲除otof基因的純合小鼠表現為極重度耳聾，其內毛細胞帶型突觸形態保持正常，鈣離子流通也正常，但是突觸囊泡的胞吐作用卻完全廢止，因此得出結論otof基因編碼的蛋白質otoferlin作為一種鈣離子感應器，在內毛細胞帶型突觸處觸發膜融合，從而在內毛細胞突觸囊泡的胞吐過程中發揮著重要作用。因此由該基因突變導致的感音神經性聾及聽神經病/聽神經病譜系障礙患者病變部位多在耳蝸內毛細胞或突觸，人工耳蝸手術治療效果較好。而國內外對於聽神經病譜系障礙患者OTOF基因的篩查發現，攜帶有該基因突變的聽神經病譜系障礙患者臨床多以TypeII型表現為主，適合於人工耳蝸植入手術治療並可取得良好的效果。而TYPE I型聽神經病譜系障礙患者病變部位在聽神經，位置深在，目前尚無有效的治療方法。因此，利用對聽神經病譜系障礙患者的OTOF基因的檢測進行輔助分型，對於臨床治療具有重要的指導意義。

發明內容
本發明的一個目的在於提供用於檢測OTOF基因c. 3399C>A突變的試劑盒，其技術方案為一種用於檢測與感音神經性聾及聽神經病/聽神經病譜系障礙相關的位於OTOF基因的c. 33990A突變的試劑盒，所述試劑盒包括；從待測樣品中提取DNA的試劑； 用於擴增樣本DNA的PCR反應試劑；對PCR擴增產物進行測序的試劑；其中，所述擴增樣本DNA的PCR反應試劑包括PCR引物，所述PCR弓丨物擴增的目標片段包含OTOF基因第3399位鹼基。具體地，上述PCR引物為選自0T0F-F-1 (SEQ ID NO. 3) :5』 -CAGATCATGGCAAACAACTCAT-3』，0T0F-R-1 (SEQ ID NO. 4) :5』 -GGGATGACAAGCCACTTCC-3』 ；0T0F-F-2 (SEQ ID NO. 5) :5』 -TTTCCCTGTCTCCCCAGAT-3』，0T0F-R-2 (SEQ ID NO. 6) :5』 -CCTCCTGGGTCCTCAGACT-3』 ；0T0F-F-3 (SEQ ID NO. 7) :5』 -CTCTCCTACCCATCCTGACCA-3』，0T0F-R-3 (SEQ ID NO. 8) :5』 -GGGACATGGGAGTGCGACTT-3』 ；0T0F-F-4 (SEQ ID NO. 9) :5，-CTGGGGGCGTGGTCCTTAG-3，，0T0F-R-4 (SEQ ID NO. 10) :5，-CAGGAGCCTGGGTCTGCTG-3，；中的一對。本發明的另一個目的在於提供上述試劑盒用於檢測位於OTOF基因的c. 33990A突變的方法，包括以下步驟I)採集待測個體的血液、體液或組織樣本，提取DNA ；2)以該DNA為模板，以PCR引物進行PCR反應，得到PCR反應產物；其中，所述PCR引物擴增的目標片段包含OTOF基因第3399位鹼基；3)將得到的PCR反應產物進行直接測序，並將測序結果與OTOF正常基因的序列進行比較，確定是否存在OTOF基因的c. 33990A突變位點。進一步地,上述方法還包括下述步驟4)按照正常閱讀框架進行翻譯以確定c. 33990A突變使胺基酸序列第1133位的酪氨酸發生無義突變(P. Y1133X)。本發明的又一個目的在於提供上述試劑盒在用於檢測感音神經性聾及聽神經病/聽神經病譜系障礙中的用途，將為在感音神經性聾及聽神經病/聽神經病譜系障礙患者中開展易感基因篩查提供方便確實的方法；同時可以指導臨床治療，並為將來利用這一突變作為靶點開展耳聾的基因治療提供堅實的基礎。
使用本發明的試劑盒的檢測方法為通過檢測來自於患者的待測樣本中是否存在OTOF基因c. 33990A突變，而判斷該患者感音神經性聾及聽神經病/聽神經病譜系障礙發生原因及類型。其中，OTOF基因的c. 33990A鹼基突變使胺基酸序列第1133位的酪氨酸發生無義突變(P. Y1133X)，使胺基酸的編碼提前終止，形成Otoferlin的截短肽鏈，喪失其功能，不成熟的表達產物誘導啟動體內調節機制，使變異的mRNA降解。OTOF基因突變相關的感音神經性聾及聽神經病/聽神經病譜系障礙以常染色體隱性遺傳的方式傳遞。發明人應用候選基因篩查的方法對17例非症候群型聽神經病譜系障礙患者和100例聽力正常且無家族史的對照進行篩查，在一例聽神經病譜系障礙患者發現OTOF基因的c. 33990A突變，OTOF基因突變與聽神經病譜系障礙表型共分離。目前國際上報導與感音神經性聾及聽神經病/聽神經病譜系障礙相關的突變有80餘種，尚無c. 33990A突變的報導。圖I給出OTOF編碼區胺基酸與核酸鹼基的對照圖，並示出突 變位點(方框標記處)，該突變使位於OTOF基因編碼區的第3399位的C鹼基突變為A鹼基，使得第1133位編碼的酪氨酸發生無義突變，在第1133位的胺基酸密碼子變為終止密碼子，突變發生後基因表達產物由正常的1997個胺基酸變成了 1132個胺基酸肽鏈。截斷的胺基酸肽鏈啟動體內調節機制，使變異的mRNA降解。檢測該突變可用本領域的任何檢測點突變的方法來進行，例如PCR (聚合酶鏈反應)一測序法、採用標記的OTOF基因DNA探針雜交法或用限制性片段長度多態性方法或序列特異性引物的方法等等。在本發明的一個實施方案中，採用PCR擴增-直接測序法來檢測樣本，具體包括下述步驟I)採集待測個體的樣本，例如血液、體液或組織，提取基因組DNA ；2)以該DNA為模板，以針對OTOF基因或OTOF編碼區第3399位鹼基附近設計的PCR引物進行PCR反應，得到PCR擴增產物；3)將得到的PCR產物進行直接測序分析，將所得到的序列與OTOF正常基因的序列進行比較，確定是否存在OTOF突變位點。4)根據以上結果判斷待測個體是否為OTOF基因突變c. 33990A導致的聽神經病
譜系障礙。進一步的，該方法可以選擇性的包括如下步驟5)按正常閱讀框進行翻譯以確定胺基酸是否存在自第1133位酪氨酸的無義突變，在第1133位的胺基酸密碼子變為終止密碼子(p. Y1133X)。在發明人進行的實驗中，通過聾病門診及資源收集網絡收集各種感音神經性耳聾患者，包括聽神經病譜系障礙患者，建立資源庫。在患者自願的前提下，籤署知情同意書後，留取5-10ml血樣，並建立門診病歷資料庫，詳細記錄患者病情、家系中的發病情況以及聯繫方式。然後，應用酚氯仿抽提的方法提取基因組DNA，定量後入庫，-20° C保存，每份DNA樣品均詳細對應於登記的患者臨床資料。然後，應用在線引物設計軟體Primerf設計引物，包含OTOF整個編碼區，應用PCR擴增。PCR產物直接測序測序引物與PCR擴增引物相同，正反向測序，應用ABI公司3700DNA測序儀。得到的序列與Genbank中的序列(登錄號NC_000002. 11)比較確定OTOF突變位點。按正常閱讀框進行翻譯以確定OTOF的突變位點。
上述步驟2所得到的PCR反應產物還可以用雜交探針來檢測，所用的雜交探針可以是與正常的OTOF核苷酸序列雜交，或與突變的核苷酸序列雜交，或與它們的互補序列雜交的探針。這些探針可以用放射性同位素、發色物質或螢光物質標記，尤其是可利用等位基因特異探針，也可用限制性酶切的方法篩查是否存在已被確定的突變。 因此，檢測PCR擴增產物的試劑選自測序檢測試劑、限制性內切酶酶切檢測試劑、限制性長度多態性檢測試劑、序列特異性引物檢測試劑和探針雜交檢測試劑。在上述方法中使用的PCR引物可以依據已知的核苷酸序列設計，通常為15 30個鹼基，GC含量為45 50%左右，在適當的溫度下與末端特異性結合，其可以利用專門的電腦程式設計。在本發明的一個具體實施例中，應用在線引物設計軟體primer 3. O設計了一對PCR引物，其序列為上遊引物0T0F-F-1:5』-CAGATCATGGCAAACAACTCAT-3』(nt84507_nt84528)下遊引物0T0F-R-1:5，-GGGATGACAAGCCACTTCC-3，(nt84767_nt84785)
OTOF正常基因的標準序列可以參考例如Genbank NC_000002. 11。用於檢測OTOF基因c. 33990A突變的試劑盒中可以包含以下試劑用於擴增樣本DNA中OTOF基因或OTOF基因編碼區第3399位鹼基附近的PCR引物；以及以下一種或幾種試劑的組合從待測樣品中提取DNA的試劑；PCR反應試劑；對PCR擴增產物進行直接測序的試劑。例如，本發明的一個實施方案中提供一個檢測OTOF基因c. 33990A突變的試劑盒，容器內裝有用以檢測OTOF基因c. 3399C>A突變的成分，與之同時提供的可以是經政府藥物管理機構審核的、有關藥品或生物製品的製造、使用及銷售信息。例如，採用PCR擴增後，直接檢測樣品中OTOF基因c. 3399C>A突變位點的試劑盒，可含有擴增引物、dNTPs、用於PCR反應的DNA聚合酶及其緩衝液、或測序反應所需試劑等的一種或多種。本領域技術人員已知，以上組分僅是示意性的，例如，所述的引物可以採用上述的一對0T0F-F-1和0T0F-R-1引物，所述用於PCR反應的DNA聚合酶是能夠用於PCR擴增的酶。所述試劑盒的使用方法主要包括如下步驟(I)提取待測血樣的DNA，利用上述的一對0T0F-F-1和0T0F-R-1引物，進行PCR反應，得到PCR反應產物；(2)PCR反應產物純化後直接測序，將所得的序列與Genbank中的標準序列比較確定突變位點的存在；所述步驟還可進一步包括(3)按正常閱讀框進行翻譯以確定是否存在第1133位酪氨酸的無義突變，使第1133位的胺基酸密碼子變為終止密碼子(p. Y1133X)。該試劑盒可簡便快捷地檢測OTOF突變位點，從而應用於感音神經性聾及聽神經病/聽神經病譜系障礙相關基因的檢測及其診斷或治療方法中。本發明也提供了 OTOF突變基因在診斷或治療人類感音神經性聾及聽神經病/聽神經病譜系障礙中的應用。通過檢測來自患者的待測樣本中是否存在OTOF基因c. 33990A突變而判斷該患者的感音神經性聾及聽神經病/聽神經病譜系障礙發生原因及類型，進而為臨床診斷和治療提供依據；此外，在進一步的臨床治療方面，在檢測為發生了 OTOF基因c. 33990A突變之後，可以將正常基因導入攜帶突變基因的細胞並在其中表達，它可與內源性突變基因發生重組，從而可以進行基因治療。本發明提出了通過檢測患者中是否存在OTOF基因新的突變而診斷感音神經性聾及聽神經病/聽神經病譜系障礙發生的原因和類型的檢測方法，這將有利於為不同類型感音神經性聾及聽神經病/聽神經病譜系障礙患者確定個體化治療方案，避免人工耳蝸植入無效而造成的不必要的經濟損失。下面結合附圖，通過對本發明較佳實施方式的說明，詳細描述但不限制本發明。


圖I為OTOF基因編碼區核苷酸與胺基酸的對照(NM_194248. 2，NP_919224. I):突變位於OTOF基因第3399位中一個C鹼基，用方框圈起來的是突變的鹼基和對應的胺基酸， 突變後的鹼基序列使胺基酸自1133位發生無義突變(下劃線部分的胺基酸)。 圖2為本發明方法中PCR反應過程示意圖，示出了反應溫度和時間，其中*表示每個循環降低0.5°C。圖3為本發明方法中，對PCR產物進行電泳定量的瓊脂糖凝膠電泳圖譜，圖中示出了定量Marker的片段位置。圖4為本發明方法中OTOF基因測序結果的局部圖，4A為雜合突變序列(患者序列)，4B為野生型序列，方框示突變位點位置。
具體實施例方式本發明所用試驗材料，如無特別說明，均為市售購買產品。實施例I待測血樣提取與OTOF基因編碼區的PCR擴增一、待測對象血樣DNA的製備I、研究對象對17例散發非症候群型聽神經病譜系障礙患者和100名無家族史的聽力正常對照按照下述方法進行OTOF基因的篩查。17例患者中，I例患者的OTOF基因檢測發現患者為c. 33990A雜合突變和另外一種突變的複合雜合子。對100名聽力正常者的篩查中未發現c. 33990A突變者。對所有參加者詳細調查其病史以及家族史，並對其進行體格檢查，耳科檢查包括耳鏡檢查、聽力學評估。在籤署知情同意書以後每人採集血樣5 10ml。2、基因組DNA提取採用酚氯仿抽提法。第一天I)抗凝血用PBS作I倍稀釋。2)在離心管中加入2倍體積的淋巴分離液(18° C 28° C)，上面鋪一層I倍體積已稀釋的血液，室溫，IOOOXg,離心20分鐘。3)吸棄上清液，小心吸出中間有核細胞層，轉入5ml Ep管中，5000 Xg,離心10分鐘，然後用PBS洗一次。5000Xg,離心10分鐘。
4)將細胞懸於 2ml TE 緩衝液(IOmM Tris. HCl, ImM EDTA，ρΗ8· O)中，加 10% 的 SDS(十二烷基硫酸)至終濃度O. 5% (100 μ I )，蛋白激酶k 100 200yg/ml (10mg/ml )，50° C水浴3 5小時。5)用酚氯仿提取。用等體積的飽和酚，加入混勻，5000Xg，離心10分鐘。6)吸上清液至新離心管中，棄下層沉澱，加入等體積酚氯仿混合物，混勻，5000 Xg,離心10分鐘。7)吸上清液至新離心管中，棄下層沉澱，加入等體積氯仿異戊醇混合物，混勻，5000 Xg,離心10分鐘。8)吸上清液至新離心管中，棄下層沉澱，加入1/10體積的乙酸鈉，混勻。9)加入2. 5倍體積的無水乙醇。
10)-20。C 沉澱 DNA 過夜。第二天11)高速離心，10000Xg，10 分鐘，4。C。12)棄上清液，加入75%乙醇2ml，高速離心10000 X g，5分鐘13)棄上清液，吹乾。14)用 TE 緩衝液溶解(200 μ I TE/5ml 全血，400TE/10ml 全血)。15)分裝。1%瓊脂糖電泳和分光光度計定量。二、OTOF基因編碼區的PCR擴增I、引物序列上遊引物0T0F-F-1:5』-CAGATCATGGCAAACAACTCAT-3』(nt84507_nt84528)下遊引物0T0F-R-1:5』-GGGATGACAAGCCACTTCC-3』(nt84767_nt84785)注0T0F基因序列檢索號NC_000002. 112、PCR反應體系的建立(表I)表10T0F基因的PCR反應體系
權利要求
1.一種用於檢測與感音神經性聾及聽神經病/聽神經病譜系障礙相關的位於OTOF基因的c. 33990A突變的試劑盒，所述試劑盒包括； 從待測樣品中提取DNA的試劑； 用於擴增樣本DNA的PCR反應試劑； 對PCR擴增產物進行測序的試劑； 其中，所述擴增樣本DNA的PCR反應試劑包括PCR引物，所述PCR弓丨物擴增的目標片段包含OTOF基因第3399位鹼基。
2.如權利要求I所述的試劑盒，其中所述PCR引物為選自下述引物中的一對 0T0F-F-1:5， -CAGATCATGGCAAACAACTCAT-3，, 0T0F-R-1:5』 -GGGATGACAAGCCACTTCC-3』 ；0T0F-F-2:5， -TTTCCCTGTCTCCCCAGAT-3，,0T0F-R-2:5』 -CCTCCTGGGTCCTCAGACT-3』 ；0T0F-F-3:5， -CTCTCCTACCCATCCTGACCA-3，,0T0F-R-3:5』 -GGGACATGGGAGTGCGACTT-3』 ；0T0F-F-4:5， -CTGGGGGCGTGGTCCTTAG-3，,0T0F-R-4:5， -CAGGAGCCTGGGTCTGCTG-3，。
3.如權利要求I或2所述試劑盒，所述試劑盒用於檢測位於OTOF基因的c.33990A突變的方法，包括以下步驟 1)採集待測個體的血液、體液或組織樣本，提取DNA； 2)以該DNA為模板，以PCR引物進行PCR反應，得到PCR反應產物； 其中，所述PCR引物擴增的目標片段包含OTOF基因第3399位鹼基； 3)將得到的PCR反應產物進行直接測序，並將測序結果與OTOF正常基因的序列進行比較，確定是否存在OTOF基因的c. 33990A突變位點。
4.如權利要求3所述試劑盒，所述方法還進一步包括下述步驟 4)按照正常閱讀框架進行翻譯以確定c.33990A突變使胺基酸序列第1133位的酪氨酸發生無義突變(P.Y1133X)。
5.如權利要求I所述的試劑盒在用於檢測感音神經性聾及聽神經病/聽神經病譜系障礙中的用途。
全文摘要
本發明提供了檢測OTOF基因c.3399C>A突變的試劑盒，通過檢測患者中是否存在該突變基因而診斷感音神經性聾及聽神經病/聽神經病譜系障礙發生的原因和類型。該突變基因和檢測方法將有利於臨床上開展感音神經性聾及聽神經病/聽神經病譜系障礙患者的OTOF突變篩查工作，為感音神經性聾及聽神經病/聽神經病譜系障礙患者的診斷和治療提供依據。
文檔編號C12Q1/68GK102851360SQ20121017234
公開日2013年1月2日 申請日期2012年5月29日 優先權日2012年5月29日
發明者王秋菊 申請人:王秋菊, 中國人民解放軍總醫院