幹細胞、非去極化肌松藥和透明質酸複合抗衰老作用的製作方法

2023-05-29 09:53:41

專利名稱：：幹細胞、非去極化肌松藥和透明質酸複合抗衰老作用的製作方法
技術領域：
：本發明涉及用於消除或預防面部皺紋的組合物，特別涉及胚胎幹細胞提取物、非去極化肌松藥和透明質酸，以及含有胚胎幹細胞提取物和透明質酸以及其它通常應用的具有護膚功能的物質的組合物。
背景技術：
：從醫學組織學的觀點說，皺紋是皮膚中真皮組織裡的彈力纖維、結締組織和肌膚纖維隨著年齡的增長而退化萎縮，以及表皮和真皮內的水分、脂肪和皮下脂肪的減少而產生的。1.面部肌肉運動頻發，如經常抬頭、大笑、皺眉、皺鼻等也容易促進皺紋的形成。2.隨著人們年齡的增長，肌力降低，面部肌肉收縮無力，皮膚的張力也隨之降低，因而產生皺紋。3.表皮組織水分的流失。在青春期，表皮組織內的細胞不斷地生長，新陳代謝旺盛，在真皮組織中有一種「透明質酸」的物質，通過這種物質，可使體內的營養物質、微量元素及豐富的水分通透皮膚表面。隨著年齡增長，表皮組織內的皮膚幹細胞分裂、增殖減緩，其他的表皮細胞生長緩慢，使體內的「透明質酸」也逐漸減少，這時皮膚也變得粗糙、形成皺紋。4.不良的環境因素。如紫外線、乾燥的氣候等。5.精神因素，比如情緒不穩定，波動較大，精神過度緊張等。6.其他因素，如脾胃功能不和，內分泌失調，體重過速減輕，化妝等。據研究，早期皺紋的形成基本都是與面部肌肉運動頻發有關。面部肌肉的運動是由神經-肌肉興奮傳遞引起的。而神經-肌肉興奮傳遞是通過軸突末端釋放乙醯膽鹼、作用於肌膜上的乙醯膽鹼受體改變其離子通道，引起膜的電位變化使肌膜去極化，進而觸發了興奮-收縮耦聯，引起肌肉纖維收縮。目前市面上所用的肉毒素注射就主要是針對上述的面部肌肉運動頻發造成的皺紋。它的作用機理是，它能抑制周圍運動神經末梢突觸前膜乙醯膽鹼釋放，阻斷神經和肌肉之間的信息傳導，從而引起肌肉的鬆弛性麻痺。也可以說，肉毒素是由於麻痺了肌肉使得肌肉失去收縮能力而消除了皺紋。但是，肉毒素從來就被規定為劇毒藥品，超過一定劑量即可致人於死地。當然，它用作除皺時劑量很小，理論上講是安全的，但其毒性和副作用畢竟是客觀存在的(高致命毒素除皺危險大年輕半年換來三角眼世界科技報導日期2004-11-181009)。據資料記載，將肉毒素注射在魚尾紋或鼻紋處，由於離眼睛很近，眼瞼肌肉往往被麻痺，不少人的眼睛也會隨之變小(但可恢復)。此外，由於肉毒素的毒副作用，注射後出現發燒、乏力、食慾欠佳的例子也不少。嚴重者還會出現復視、吞咽及呼吸困難等。國外還有注射肉毒素後發生心跳驟停的報導。因此，如何在有效地抑制面部肌肉收縮的同時確保其安全性是目前亟待解決的問題。應用非去極化肌松藥可能是解決這一問題的有效方法。非去極化肌松藥(nondepolarizedmusclerelaxitant)，也能使肌肉失去收縮能力，但是其機理卻與肉毒素不同。它能與肌肉上面的受體結合，從而阻滯了乙醯膽鹼與受體結合，防止了去極化發生，肌肉纖維也就無法收縮。非去極化肌松藥目前主要用作臨床麻醉的輔助用藥，具有安全，副作用小的特點。根據它的特性以及面部皺紋的形成原因，本發明人創造性地將它用於消除和預防面部皺紋，在此之前，還未見相關的報導。誘明質酸(Hyaluronicacid，HA)，又名透明酸或玻璃酸，是一種大分子粘多糖，廣泛存在於生物體的結締組織中。在不同組織中HA的生理作用有所不同，如在皮膚中主要表現為保水作用。水解明膠，是膠原蛋白經酶(酸或鹼)水解的產物，水解明膠能使水份固定在皮膚和組織上，不僅可以抗老化、防皺紋、美容養顏，還能增加皮膚細胞再生，恢復肌膚彈性。胚胎幹細胞,來源於囊胚受精卵經過3-5天的發育，經由桑葚胚而發育成囊胚，囊胚內有一個由幾十個細胞所形成的細胞團塊，在醫學生物學領域內稱之為內細胞島。島內的細胞稱為胚胎幹細胞。隨著胚胎的發育，一部分幹細胞不斷地增生，分化為身體組織的各種具有特異功能的細胞，而部分胚胎幹細胞則保持幹細胞的特點，維持其不斷自我更新的能力，在組織細胞受損時進行修復。皮膚是人體的保護屏障，由於它位於人體的表面，所以受到外部環境的影響也大，其細胞的新陳代謝也比其他的組織細胞高，因而易於老化，其典型的特點是皮膚鬆弛、彈性減弱、皺紋的出現。如上所述，胚胎幹細胞是一種最年輕的原始細胞，表皮細胞的損傷可刺激皮膚幹細胞分裂、增生，它們也可合成和分泌多種細胞生長因子，刺激本身和其他細胞的增生、修復。美國科學家JamesThomson在1998年成功地分離了人體的胚胎幹細胞，並在體外建立了人體胚胎幹細胞系(Science，1998；282:1145)。這是人胚胎幹細胞研究的一個重要的裡程碑，隨作科學研究的深入，胚胎幹細胞的研究成果不斷湧現，現在我們已可在培養皿中把胚胎幹細胞誘導成不同的具有特殊功能的細胞，如皮膚的各種細胞、肌細胞、神經細胞等。胚胎幹細胞也可用來進行細胞替代治療，修復遭到損傷細胞和組織。由於胚胎幹細胞是一種人體中最年輕、最具活力的細胞，它們的胞漿和培養液中含有豐富的多種促細胞生長因子，我們在本發明中用胚胎幹細胞的培養夜和/或胚胎幹細胞的提取物，結合非去極化肌松藥和透明質酸等物質，製成複方抗表皮衰老劑，具有明顯的面部和眼角的抗皺紋作用。本發明人通過創造性的勞動，選擇出能夠與胚胎幹細胞和非去極化肌松藥聯合應用的其它具有皮膚養護作用的物質，並利用適當的組合使其能夠充分發揮協同的消除或預防面部皺紋的作用。
發明內容為了更有效地預防或消除面部皺紋，克服現有的A型肉毒毒素美容產品中的毒性缺陷，本發明通過發明者的創造性研究，提供了一種不僅能夠抑制、消除表情肌過度收縮所致的皺紋。而且，，而且能夠強力保持面部皮膚水分的組合物本發明的第一個方面，提供一種預防或消除面部皺紋的組合物，其包含胚胎幹細胞的提取物和非去極化肌松藥。在本發明的一個實施方案中，所述組合物可以含任意的胚胎幹細胞提取物和/或非去極化肌肉鬆弛劑；不過如同時含有這兩種成分，其抗皺作用則明顯加強。在本發明中，利用胚胎幹細胞和/或非去極化肌松藥聯合應用的其它具有皮膚養護作用的物質，並利用適當的組合使其能夠充分發揮協同的消除或預防面部皺紋的作用。與現有的A型肉毒毒素相比較，能避免其造成的面部表情肌癱瘓的毒副作用。本發明所述術語「預防或消除皺紋」指所用的組合物可以預防面部皺紋，尤其是表情肌過度收縮所導致的皺紋；減輕、緩解、控制、改善或完全消除面部皺紋，尤其是表情肌過度收縮所導致的眼部皺紋。本發明所述術語「對照組」指由市場可購得的三種眼霜以及蘭州生物製品研究所的A型肉毒毒素。1.胚胎幹細胞提取物如上所述，由於胚胎幹細胞是一種人體中最年輕、最具活力的細胞，能夠不斷地分裂、增生，從而分化成身體組織的各種成熟的具有特異功能的組織細胞。胚胎幹細胞在培養時能夠合成、分泌多種促細胞生長因子，因此，在它們的胞漿和培養液中含有大量的表皮和真皮組織營養因子，在保持皮膚細胞的年輕化，維持其彈性，抗皺方面都有重要的功用。我們在本發明中用胚胎幹細胞的培養夜和/或胚胎幹細胞的提取物，和其他的成分製成複合的抗皮膚衰老劑。2.非去極化肌松藥多種非去極化肌松藥，例如，維庫溴銨，羅庫溴銨，咪庫氯銨，哌庫溴銨，可用於本發明的構建體中。本發明優選的哌庫溴銨，即阿端，是不引起心血管副作用的長效神經肌阻滯藥。起效時間約為57min，作用時間為120-180min。該化合物的分子式為C35H62Br2N404，其結構式見附圖1。3.包括有效劑量的胚胎幹細胞提取物、非去極化肌松藥以及有效劑量的透明質酸的組合物，透明質酸(HyaluronicAcid)是糖氨聚糖中結構最簡單的，是一種獨特的線性大分子糖氨聚糖，由葡萄糖醛酸和N-乙醯氨基葡萄糖的雙糖單位反覆交替連接而成，分子式為(C14H21N011)n，依據組織來源不同，分子量變化於105107之間。透明質酸與其它天然糖氨聚糖不同，其分子內不含硫酸基團，也不與蛋白質共價結合，能以自由鏈形式在體內游離存在。透明質酸廣泛分布於動物和人體結締組織細胞外基質中，在胚胎、眼玻璃體、臍帶、皮膚、軟骨和滑液中含量較高，血清中含量最低。透明質酸具有許多天然糖氨聚糖共有的性質呈白色，為無定形固體，無臭無味，有強吸溼性，溶於水，不溶於有機溶劑。但較其它糖氨聚糖而言，透明質酸有其獨特的性質，兼具高分子量和大分子體積的特性。由於直鏈軸上基團之間的氫鍵作用，透明質酸分子在空間上呈剛性的雙螺旋柱型，其長可達20μm。在水溶液中透明質酸分子鏈上相鄰-NH和-COO_殘餘基之間的「水橋」作用，進一步加強其剛性；同時，CH基團的連續定向排列，又在分子鏈上形成高度憎水區，為分子鏈之間相互纏繞和鏈鏈之間相互作用提供接點，透明質酸分子鏈的親水和憎水特性，使濃度很低(lyg/ml)的透明質酸也能形成連續的三維蜂窩狀網絡結構，水分子則在網絡內通過極性鍵和氫鍵與透明質酸分子相互結合，使得透明質酸象「分子海綿」一樣，可以吸收和保持其自身重量上千倍的水分。事實上，透明質酸比其它任何天然或合成聚合物都具有更強的吸水力，以至2%的純透明質酸溶液能將剩餘98%的水緊緊吸住，使得能象膠狀物一樣被提起，但它實際上是溶液，能被稀釋。透明質酸溶液具有獨特的粘彈性，剪切力對其粘度值影響很大，溶液受高剪切力作用時，粘度可為1/1000以下，溶液的粘彈性隨透明質酸分子量和濃度的增加而增加，也被認為是分子網絡形成的結果。所以一個透明質酸分子在水中將佔據100010000倍於自身體積的空間。當透明質酸處於封閉的間隙如細胞間基質時，將產生膨壓，加上分子表面的-coo_因吸引了陽離子，更增加基質的滲透壓。這是這些膨壓使軟骨、腱等結締組織具有抗壓和彈性。人體表皮和真皮中含有高濃度的透明質酸，佔人體中透明質酸總量的一半以上，皮膚中的含水量和透明質酸含量直接相關，隨著年齡增長，皮膚老化，被認為是皮膚中透明質酸含量下降和聚合度改變的結果。體外細胞培養表明，皮膚的纖維細胞質膜處能生物合成透明質酸，代謝過程很快，半衰期為12d。4.胚胎幹細胞提取物、非去極化肌松藥和誘明質酸以及其它可用於面部養護物質的組合物所述的其它可用於面部養護物質如水解明膠，維生素E等。美國安利公司推出的膠原蛋白其主要成份也是水解膠原蛋白，其功效為通過服用膠原蛋白，以內養外，增加肌膚彈性，減少皺紋。實驗證明，連續服用2個月後，皮膚彈性增加45%，水份增加30%，透明光澤增加50%，皺紋減少30%，水解明膠能使水份固定在皮膚和組織上，水解明膠攝入後能形成更多的膠原蛋白，膠原蛋白不足時，皮膚的水份會減少失去彈性和水份，肌膚就無法保持年輕。水解明膠易於被身體吸收，幫助身體中膠原蛋白、彈力蛋白及網狀蛋白的合成，從而滋養皮膚、毛髮、指甲和全身的結締組織，不僅可以抗老化、防皺紋、美容養顏，還能增加皮膚細胞再生，恢復肌膚彈性，同時可以補充組織流失的膠原蛋白，幫助排除皮膚多餘脂肪，抑制皮膚過分出油。水解明膠的攝入還能有效消除皮膚斑點，去除黑斑、老人斑。5.本發明組合物效用發明人通過研究發現，胚胎幹細胞提取物，非去極化肌松藥，透明質酸和水解明膠均可以通過皮膚吸收，為此，發明人設計了胚胎幹細胞提取物，非去極化肌松藥，透明質酸和水解明膠的組合物，並且將所述的組合物施用於20至35歲人群的面部皮膚，共施行12例，取得了令人鼓舞的效果。所述的組合物的除皺效果顯著優於所選的三種市售眼霜中任何一種的效果(實施例)。6.毒性研究本發明提供了檢測組成的組合物對於機體的毒性的評價。我們施用10倍於正常劑量(指組合物中的劑量)的所述的組合物於受試驗者皮膚，然後觀察其皮膚情況，檢測其血清中反映肝功能的指標谷丙轉氨酶、穀草轉氨酶以及總膽紅素，以及用心電圖檢測其心電活動。7.從胚胎幹細胞裡抗皮膚衰老有效成分1)1%明膠(gelatin/PBS)coatingT75cm細胞培養瓶30分鐘；2)吸乾後等3-5分鐘；3)在37度水浴箱快速溶解一管人胚胎幹細胞，加IOml無血清培養液洗一次；4)離心，1000轉/分，5分鐘，去除上清液，用Iml培養液重懸細胞；5)加Hml無血清幹細胞培養液到培養瓶，然後把幹細胞轉移到培養瓶培養3天；6)吸出培養液；7)用PBS清洗胚胎幹細胞2次；8)加2-3ml2.5mMEDTA,是細胞懸浮，收集到15ml離心管；9)加IOmlPBS清洗幹細胞，離心，吸乾；10)加2-3ml細胞溶解液(50mMTrisph8.2，150mMNacl,2mMEDTA,ImMNa3Vo4,2.5mMNaF,ImMPMSF,0.5%NP-40andproteinaseinhibitortabletfromRoche)，，溶解細胞，然後收集到離心管內；11)在4度搖晃1小時，離心14000轉/分，30分；12)取其上清液，4度PBS透析8小時，2x；13)冰凍乾燥，保存在-80度冰箱；14)然後和非去極化肌肉鬆弛幾，透明質酸，水解明膠按一定的比例製作皮膚防皺霜；8.組合物的製備1)以去離子純淨水作為溶劑，其中首先加入透明質酸，濃度為0.5_4g/L，優選2g/L02)加入水解明膠，30-200g/L,優選80g/L；將混合液置於60度溫水浴鍋，輕搖45分鐘，溶液完全澄清透明後取出。3)冷卻到37度，然後加入適量的胚胎幹細胞提取物，冷卻至室溫。溶液冷卻後形成凝膠。4)上述凝膠中加入非去極化肌松藥，例如，維庫溴銨，羅庫溴銨，咪庫氯銨，哌庫溴銨，優選哌庫溴銨，濃度為0.lg-1.Og/L，優選0.4g/L。充分攪拌混勻。幻最後加入殺菌劑，充分攪拌混勻。置於避光低溫保存。8.使用方法首先，用清水洗淨面部，用食指挑少許本組合物輕柔均勻地塗抹在眼角及眼下，之後輕柔地由內向外按摩8-10次即可。使用期間儘量避免大笑等表情肌的劇烈運動。圖1哌庫溴銨的分子式。圖2使用一周後拍照比較對照組和治療組，發現治療組中II例有效，其中有2例眼部皺紋消失。圖3使用一月後拍照比較對照組和治療組，發現治療組中12例均有效，有5例眼部皺紋消失。實施例一、隨機選取12名眼部有明顯皺紋，年齡在20-35歲青年，其中男女各六人。左眼使用作為對照的市面所售的三種不同眼霜產品；右眼使用本發明所述的組合物。對照分為三組，第一組以國內產品A(李醫生)作為對照，第二組以國外產品B(BodyShop)作為對照，第三組以國外產品C(Simple)作為對照。使用方法均為洗淨眼部和雙手，用示指將米粒大小各種眼霜均勻輕柔地塗抹在眼角及眼下皮膚外表面。每日晚上睡前和起床後各使用一次。一周後拍照比較對照組和治療組，發現第二、第三對照組中各有1例有效。而治療組中11例有效，其中有2例眼部皺紋消失(見圖2)。一月後拍照比較對照組和治療組，發現第二對照組中有2例有效、第三對照組中有3例有效。而治療組中12例均有效，其中有5例眼部皺紋消失。(見圖3)。權利要求1.用於消除或預防面部皺紋的組合物，所述組合物包括有效劑量的第一組分，人和動物的胚胎幹細胞及其他幹細胞提取物；第二組分，非去極化肌松藥；第三組分，透明質酸；第四組分水解明膠。2.如權利要求1所述的組合物，其中所述胚胎幹細胞(也包刮其他各種幹細胞)提取物和幹細胞生長因子。3.如權利要求1所述的組合物，其中所述非去極化肌松藥。4.如權利要求1所述的組合物，其中所述透明質酸。5.如權利要求1所述的組合物，其中所述水解明膠。6.權利要求1-5中任一權利要求所述組合物在製備用於消除或預防面部皺紋尤其是眼部皺紋中的用途。7.權利要求1-2中所述的幹細胞提取物在製備用於消除或預防面部皺紋的護膚品中的用途。8.如權利要求1，其中還可包含ViteminC、ViteminE等可用於面部養護的營養素。9.如權利要求1所述的組合物在預防和消除面部皺紋，特別是眼部皺紋方面的作用。全文摘要幹細胞、非去極化肌松藥和透明質酸複合抗衰老作用，該發明屬於生物
技術領域：
內抗皮膚衰老的範疇，在世界上首次提出胚胎細胞的抗衰老理論，並在這一理論指導下，發明了胚胎幹細胞抗皮膚衰老的複合劑。本發明所要解決的技術問題主要是肉毒鹼在抗皮膚衰老中的毒性作用，提供了無肉毒鹼的抗皮膚皺紋的無毒性、而且具有促進皮膚再生的抗皮膚衰老的複合劑。人體胚胎幹細胞提取的複合成分可以促進皮膚細胞的再生，而非去極化肌松藥可以代替肉毒鹼的作用，透明質酸，維生素C和/或維生素E等成分在維護皮膚的健康都有一定的作用。本發明的主要用途是抗皮膚的衰老，減緩、消除面部尤其是眼部的皺紋。文檔編號A61K8/73GK102125514SQ20101002290公開日2011年7月20日申請日期2010年1月18日優先權日2010年1月18日發明者沈士亮,沈贊申請人:上海眾申生物科技有限公司