Ed-b纖連蛋白作為抗腫瘤藥物的分類標記的製作方法

2023-05-29 12:52:11

專利名稱：：Ed-b纖連蛋白作為抗腫瘤藥物的分類標記的製作方法ED-B纖連蛋白作為抗腫瘤藥物的分類標記說明書本發明涉及利用針對纖連蛋白的外部結構域B(ED-B)的分子，例如針對ED-B結構域的標記的抗體或抗體片段作為診斷劑來根據其對抗腫瘤藥物的敏感性對腫瘤進行分類，具體是作為EGF/EGFR拮抗劑的分類標記。表皮生長因子抑制劑(EGFR)用於腫瘤治療中，具體是用於治療患有非小細胞肺癌(NSCLC)的患者。含有EGFR的人NSCLC細胞系對EGFR抑制的敏感性有賴於其所經歷的從上皮到間質轉變(EMT)的程度。表達上皮細胞連接蛋白E-鈣粘蛋白的NSCLC細胞系顯示與經歷EMT的細胞系相比對EGFR抑制敏感性更高(Thomsonetal.,CancerRes.65(2005),9455-9462)。此外，發現NSCLC患者中EGFR拮抗劑的臨床活性可通過測定人腫瘤細胞中的EMT來預測(Yauchetal.，Clin.CancerRes.11(2005)，8686-8698)。EMT特徵在於丟失上皮標記，例如E-鈣粘蛋白，以及獲得間質標記，例如波形蛋白。EMT導致去分化，丟失粘附約束以及增強的運動性和浸潤。這些特徵是惡性增加的標誌。因此，EMT提供了癌細胞獲得這種更加具有侵入性表型的機制(Leeetal.,J.Cell.Biol.172(2006),973-981；ChristiansenandRajasekaran,CancerRes.66(2006),8319-8326)。然而通過常規分析方法檢測EMT是困難的，因為該過程很可能短暫地見於腫瘤中的離散區域(Gotzmanetal.，MutationRes.566(2004)9—20)。因此，本發明的目的是提供可靠並且敏感的方法，其允許確定人腫瘤細胞或組織或其他感興趣的細胞或組織中的上皮表型和間質表型。第一方面中，本發明涉及對腫瘤細胞或腫瘤組織分類的方法，包括以下步驟(a)將ED-B纖連蛋白-特異性分子與腫瘤細胞或腫瘤組織接觸，並評估ED-B纖連蛋白-特異性分子與所述腫瘤細胞或腫瘤組織的結合；和(b)基於步驟(a)的評估對所述腫瘤細胞或腫瘤組織進行分類。另一方面中，本發明涉及檢測，具體是顯像細胞或組織具體是腫瘤細胞或腫瘤組織中的上皮間質轉變(EMT)的方法，包括以下步驟(a)將ED-B纖連蛋白-特異性分子與細胞或組織接觸，並評估ED-B纖連蛋白-特異性分子與所述細胞或組織的結合；和(b)基於步驟(a)的評估鑑定所述細胞或組織為上皮型細胞或組織或間質型細胞或組織。另一方面，本發明涉及分類腫瘤細胞或腫瘤組織的方法，如果觀察到ED-B纖連蛋白_特異性分子的實質性結合分類為上皮型腫瘤細胞或組織，如果沒有觀察到ED-B纖連蛋白-特異性分子的實質性結合分類為間質型腫瘤細胞或組織，所述方法包括以下步驟(a)將ED-B纖連蛋白-特異性分子與腫瘤細胞或腫瘤組織接觸，並評估ED-B纖連蛋白_特異性分子與所述腫瘤細胞或腫瘤組織的結合，和(b)基於步驟(a)的評估對所述腫瘤細胞或腫瘤組織進行分類。一個具體優選實施方案中，所述ED-B纖連蛋白_特異性分子的實質性結合表示對包括給予EGF/EGFR拮抗劑的抗腫瘤治療敏感。本發明另一方面涉及ED-B纖連蛋白-特異性分子在製備用於將腫瘤細胞或腫瘤組織分類為治療敏感型或難治型的藥劑中的用途。另一實施方案中，本發明涉及將ED-B纖連蛋白-特異性分子用於將腫瘤細胞或腫瘤組織分類為對EGF/EGFR拮抗劑的治療為敏感型或難治型的方法中。本發明另一方面涉及ED-B纖連蛋白-特異性分子在製備用於將腫瘤細胞或腫瘤組織分類為對EGF/EGFR拮抗劑的治療為敏感型或難治型的藥劑中的用途。一個優選實施方案中，ED-B纖連蛋白-特異性分子與腫瘤細胞或腫瘤組織的實質性結合指示患者對EGF/EGFR拮抗劑的治療敏感。本發明另一方面涉及ED-B纖連蛋白結合分子在製備用於檢測上皮間質轉變的藥劑中的用途。本發明另一方面涉及將ED-B纖連蛋白結合分子用於檢測上皮間質轉變的方法中。優選實施方案中，ED-B纖連蛋白-特異性分子與腫瘤細胞或腫瘤組織的實質性結合指示沒有或尚未經歷上皮間質轉變的組織。本發明另一方面涉及用於分類腫瘤細胞或腫瘤組織的組合物或試劑盒，其包含與可檢測標記基團偶聯的ED-B纖連蛋白-特異性結合分子。本發明另一方面涉及用於檢測上皮間質轉變的組合物或試劑盒，其包含與可檢測標記基團偶聯的ED-B纖連蛋白-特異性結合分子。本發明另一方面涉及用於治療腫瘤的組合物或試劑盒，其包含與可檢測標記基團偶聯的ED-B纖連蛋白-特異性結合分子和EGF/EGFR拮抗劑。一個優選實施方案中，本發明涉及包含與可檢測標記基團偶聯的ED-B纖連蛋白_特異性結合分子和EGF/EGFR拮抗劑的組合物或試劑盒在治療腫瘤的方法中的用途。一個具體優選的實施方案中，與可檢測標記基團偶聯的ED-B纖連蛋白-特異性結合分子是與可檢測標記基團偶聯的AP39，具體是99mTc-標記的AP39。本發明另一方方面涉及用於治療腫瘤患者的組合物或試劑盒，包括分類腫瘤細胞或腫瘤組織然後治療被鑑定為對EGF/EGFR拮抗劑的治療敏感的患者，其中所述試劑盒包含與可檢測標記基團偶聯的ED-B纖連蛋白-特異性結合分子和EGF/EGFR拮抗劑。本發明另一方面涉及用於治療腫瘤患者的組合物或試劑盒，包括檢測上皮間質轉變然後對沒有經歷上皮間質轉變的患者進行治療，其中所述試劑盒包含與可檢測標記基團偶聯的ED-B纖連蛋白-特異性結合分子和EGF/EGFR拮抗劑。另一實施方案中，本發明涉及治療腫瘤患者的方法，包括以下步驟(a)給予腫瘤患者診斷有效量的與可檢測標記基團偶聯的ED-B纖連蛋白_特異性結合分子，(b)通過測定ED-B纖連蛋白-特異性結合分子是否實質上結合組織來確定所述患者對EGF/EGFR拮抗劑治療是否敏感，和(c)如果所述患者顯示與ED-B纖連蛋白-特異性結合分子的實質性結合則給予所述腫瘤患者治療有效量的EGF/EGFR拮抗劑。根據本發明，令人吃驚地發現確定ED-B纖連蛋白可用於選擇或分類腫瘤細胞或腫瘤組織和/或用於檢測EMT。腫瘤細胞或腫瘤組織與ED-B特異性分子的結合指示對抗腫瘤藥物諸如EGF/EGFR拮抗劑的敏感性和/或上皮表型。腫瘤細胞或組織與ED-B特異性分子的結合缺乏或結合減少指示對抗腫瘤藥物諸如EGF/EGFR拮抗劑的抗性和/或間質表型。因此，本發明尤其適合選擇或分類腫瘤患者以及他們對於抗腫瘤治療諸如利用EGF/EGFR拮抗劑的治療的敏感性。纖連蛋白ED-B結構域(91個胺基酸的序列，通過選擇拼接插入纖連蛋白分子(Castellanietal.(1994),Int.J.Cancer59，612-18))特異性分子已經在WO97/45544，WO01/62800,WO03/055917，WO03/07649和W02005/0223318中描述，所述文獻在此援引加入。優選的結合分子是直接並特異性結合ED-B結構域的分子，諸如抗ED-B結構域的抗體或所述抗體的片段，例如可通過蛋白水解獲得的抗體片段，例如Fab-，Fab'-，F(ab2)片段等，或重組抗體片段，例如單鏈Fv-片段。ED-B結合分子優選作為與適合診斷應用的標記基團的偶聯物使用。本發明優選的實施方案涉及抗體L19或該抗體的片段(L19衍生物)的應用，其作為與標記基團的偶聯物存在。L19是抗纖連蛋白外結構域B(ED-B)單克隆抗體的scFv片段(scFv單鏈可變抗體片段)，並具有以下胺基酸序列(SEQIDNO.1)(VH)EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSFSMSffVRQAPGKGLEffVSSISGSSGTTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKPFPYFDYffGQGTLVTVSS(接頭)GDGSSGGSGGASTG(VL)EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSFLAffYQQKPGQAPRLLIYYASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQTGRIPPTFGQGTKVEIK尤其優選的L19衍生物包括(aa)至少一個針對纖連蛋白外結構域B(ED-B)的抗原結合位點，其中含有表1所示互補決定區HCDR3和/或IXDR3，或其變體，其顯示在HCDR3區中達5個胺基酸的缺失、插入和/或取代以及在LCDR3區中的達6個胺基酸的缺失、插入和/或取代，從而所述抗原結合位點顯示與SEQIDNO.1所示天然L19相同的功能，或(ab)至少一個針對纖連蛋白外結構域B(ED-B)的抗原結合位點，其中含有表1所示互補決定區HCDRl，HCDR2，HCDR3，LCDRl，LCDR2和LCDR3，或其變體，其顯示在HCDRl區中達3個胺基酸的缺失、插入和/或取代，在HCDR2區中達8個胺基酸的的缺失、插入和/或取代，在HCDR3區中達5個胺基酸的的缺失、插入和/或取代，在IXDRl區中達6個胺基酸的的缺失、插入和/或取代，在LCDR2區中達4個胺基酸的的缺失、插入和/或取代，以及在IXDR3區中達6個胺基酸的的缺失、插入和/或取代，從而所述抗原結合位點顯示與SEQIDNO.1所示天然L19相同的功能，或(ac)至少一個針對纖連蛋白外結構域B(ED-B)的抗原結合位點，其中含有SEQIDNO.1所示的天然L19的序列或其變體，其顯示達30個胺基酸的的缺失、插入和/或取代，從而所述抗原結合位點顯示與SEQIDNO.1所示天然L19相同的功能，以及任選(ba)胺基酸序列Xaa1-Xaa2-Xaa3-Cys(SEQIDNO.2)，其中Xaa1,Xaa2，和Xaa3各自獨立地代表任何天然存在的胺基酸，(bb)胺基酸序列Xaa1-Xaa2-Xaa3-Cys-Xaa4(SEQIDNO.3)，其中Xaal，Xaa2,Xaa3禾口Xaa4各自獨立地代表任何天然存在的胺基酸，(be)胺基酸序列(His)η(SEQIDNO.4)，其中η是4-6的整數，或(bd)包含SEQIDN0.5，SEQIDNO.6或SEQIDNO.7所示序列的胺基酸序列，其中(aa)，(ab)，或(ac)的C末端任選通過肽鍵與(ba)，(bb)，(be)或(bd)的N末端鍵合。本發明中，標記的L19衍生物包含纖連蛋白外結構域B(ED-B)的N末端抗原結合位點，其選自抗原結合位點(aa)，(ab)或(ac)以及任選包含C末端胺基酸序列，其選自胺基酸序列(ba)，(bb),(be)或(bd)，其中所述抗原結合位點顯示與SEQIDNO.1所示天然L19相同的功能。根據本發明，標記的L19衍生物(aa)或(ab)的纖連蛋白外結構域B(ED-B)的抗原結合位點包含互補決定區HCDR3和/或LCDR3或HCDRl，HCDR2,HCDR3,LCDRl，LCDR2和LCDR3，其示於表1。本發明中，互補決定區HCDR1，HCDR2,HCDR3,LCDRl,LCDR2和LCDR3定義為表1tableseeoriginaldocumentpage7tableseeoriginaldocumentpage8ωHCDRx互補決定區χ抗體重鏈；IXDRx互補決定區χ抗體輕鏈。(2)⑶R長度互補決定區長度。除了表1所示的互補決定區，標記的L19衍生物(aa)或(ab)的纖連蛋白外結構域B(ED-B)的抗原結合位點也可包含這些區域的變體。根據本發明，HCDRl區的變體包含在HCDRl區中達3個胺基酸的缺失、插入和/或取代，即相對於表1所示序列(SEQIDNO.8)1,2或3個胺基酸的缺失、插入和/或取代。HCDR2的變體包含在HCDR2中達8胺基酸的缺失、插入和/或取代，即相對於表1所示序列(SEQIDN0.9)l，2，3，4，5，6，7或8個胺基酸的缺失、插入和/或取代。HCDR3區的變體包含在HCDR3區中達5個胺基酸的缺失、插入和/或取代，即相對於表1所示序列(SEQIDNO.10)1，2，3，4或5個胺基酸的缺失、插入和/或取代。IXDRl區的變體包含在IXDRl區中達6個胺基酸的缺失、插入和/或取代，即相對於表1所示序列(SEQIDNO.11)1，2，3，4，5或6個胺基酸的缺失、插入和/或取代。IXDR2區的變體包含在IXDR2區中達4個胺基酸的缺失、插入和/或取代，即相對於表1所示序列(SEQIDN0.12)1，2，3或4個胺基酸的缺失、插入和/或取代。IXDR3區的變體包含在IXDR3區中達6個胺基酸的缺失、插入和/或取代，即相對於表1所示序列(SEQIDN0.13)1，2，3，4，5或6個胺基酸的缺失、插入和/或取代。根據本發明，標記的L19衍生物(ac)的纖連蛋白外結構域B(ED-B)的抗原結合位點包含SEQIDNO.1所示天然L19序列或其變體，其相對於SEQIDNO.1所示序列顯示達30個胺基酸的缺失、插入和/或取代，BP1,2,3,4,5,6,7,8,9,10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29或30個胺基酸的缺失、插入和/或取代·標記的L19衍生物的胺基酸序列(ba)，(bb)或(be)包含序列Xaa1-Xaa2-Xaa3-Cys(SEQIDN0.2),Xaa1-Xaa2-Xaa3-Cys-Xaa4(SEQIDNO.3)或(HIS)η(SEQIDNO.4)。本發明一個優選實施方案中，胺基酸序列(ba)Xaa1-Xaa2-Xaa3-Cys(SEQIDN0.2)是序列Gly-Gly-Gly-Cys(SEQIDNO.14)或Gly-Cys-Gly-Cys(SEQIDNO.15)，尤其優選序列Gly-Gly-Gly-Cys(SEQIDNO.14)。本發明另一優選實施方案中，胺基酸序列(IA)Xaa1-Xaa2-Xaa3-Cys-Xaa4(SEQIDN0.3)是Gly-Gly-Gly-Cys-Ala(SEQIDNO.16)或Gly-Cys-Gly-Cys-Ala(SEQIDNO.17)。尤其優選的是序列Gly-Gly-Gly-Cys-Ala(SEQIDNO.16)。本發明另一優選實施方案中，胺基酸序列(be)(HiS)η(SEQIDNO.4)是序列(His)6，其中η等於6(SEQIDNO.18)。本發明另一優選實施方案中，aa)，(ab)或(ac)的N末端任選通過肽鍵連接接頭胺基酸序列的C末端。所述接頭胺基酸序列優選長度達30個胺基酸，優選達25個胺基酸，並且尤其優選達22個胺基酸。尤其優選的是接頭胺基酸序列，其為SEQIDNO.19所示序列。根據本發明，尤其優選的標記的L19衍生物包含以下序列所示的序列SEQIDΝ0·1(天然L19),SEQIDNO.20(AP38),SEQIDNO.21(AP39),SEQIDNO.22(L19-GlyCysGlyCys),SEQIDNO.23(L19-GlyCysGlyCysAla),SEQIDNO.24(ZK225293)，SEQIDNO.25(ZK217691/217695)，SEQIDNO.26(ZK210917)和SEQIDNO.27(ZK248219/248220)。尤其優選的是AP39。99mTc-標記的AP39優選通過胃腸外或靜脈內給藥用於患者，更優選通過靜脈內注射。人的劑量通常在大約0.Ol-lOmg，優選大約0.I-Img每名患者。ED-B結構域的結合分子優選以與標記基團偶聯的形式存在。作為標記基團，可利用所有適合診斷應用尤其是體內診斷應用的標記物質，例如用於放射性檢測的標記物質，例如放射成像方法，或用於非放射檢測的標記物質，例如非放射成像方法，諸如適合視覺成像或磁共振成像的標記物質。在尤其優選的實施方案中，標記基團是適合SPECT(單光子發射型計算機斷層儀)的標記基團，具體是放射同位素99mTc。其他具體優選的實施方案中，所述標記基團是適合PET(正電子斷層掃描儀)的標記基團，具體是放射同位素18F。所述方法的應用和本發明在PET或SPECT中的用途是優選的。體內診斷應用是尤其優選的，這是由於本發明的用途和方法還允許無需活檢進行診斷，這是由於活檢通常難以獲得並需要手術介入。此外，ED-B纖連蛋白是基質細胞外基質蛋白並且對於體內成像方法是可得的。其位於腫瘤新生血管的近腔處和細胞外。將標記物質引入多肽、肽以及具體是scFv片段的方法是本領域已知的。所述結合分子優選用放射同位素標記，例如放射同位素碘(I)，銦(In)，釔(Y)，鎝(Tc)，錸(Re)，鎵(Ga)，溴(Br)或氟(F)。尤其優選的是放射同位素1251，1231，1241，1311，mIn，186Re,188Re,86Y,94mTC，99mTC，67Ga，68Ga，76Br，18F。優選的放射同位素是99mTc，18F和123L18F-標記的AP39分子的合成描述於實施例4和5。根據本發明，這些18F-標記的分子尤其適合用於PET中。AP39是L19抗體的衍生物，如W003/055917中所述。因此，另一優選實施方案中，18F-標記的AP39，具體是選自[18F]FBAM_AP39和[18F]SFB-AP39，尤其可用於本發明的方法和用途中，具體是用於PET。本發明優選實施方案中，使用抗體片段例如還原形式的L19衍生物。本發明中，「還原形式」指所述片段以單體形式存在而非例如通過分子間二硫橋介導的二聚體或多聚體的形式。抗體片段的還原形式優選通過加入適合的還原劑獲得。適宜的還原劑是本領域已知的並包含TCEP(三(2-羧基乙基)膦)和1，4_二巰基-2，3-丁二醇。此外，除了結合分子，本發明提供了藥物組合物和試劑盒，任選包含生理學相容性佐劑，載體和/或稀釋劑。適宜的佐劑，載體和/或稀釋劑是藥物化學領域技術人員熟知的。本發明優選實施方案中，如果觀察到ED-B纖連蛋白-特異性分子的實質性結合分類為上皮型腫瘤細胞或組織，如果沒有觀察到ED-B纖連蛋白-特異性分子的實質性結合分類為間質型腫瘤細胞或組織。本發明術語「實質性結合」包含與靶抗原的免疫反應，其可與對照細胞或對照組織的非特異性結合或與間質型細胞的結合區分。應注意本發明中術語「實質性結合」還包括細胞攝取。實質性結合可直接或定性測定，通過目測或通過定量或半定量組織學染色分析程序利用SPECT照相機和PET分析來進行。本發明中待分析的細胞或組織優選是能經歷EMT的細胞，或包含能經歷EMT的細胞的組織。更優選，所述細胞或組織是腫瘤細胞或腫瘤組織，例如肺癌細胞或組織，諸如NSCLC細胞或組織或來自前列腺、乳腺、胰腺、結腸、頭和頸、卵巢、腎、胃或宮頸癌的細胞或組織以及其他腫瘤細胞或組織，例如如Christiansen和Rajasekaran(見上文)所述。優選，所述細胞或組織來自人腫瘤患者。應注意本發明方法可在體外或體內進行。體外診斷方法包括細胞或組織樣品的體外檢測，例如腫瘤細胞或腫瘤組織樣品，其優選源自人患者。體內方法包括給予對象ED-B纖連蛋白特異性分子，所述對象例如人患者或實驗動物，以及在對象中進行檢測，優選成像方法。本發明的體內方法優選通過注射包含ED-B結合分子的藥物組合物到待檢查的患者的靜脈和/或動脈中並檢測結合細胞或組織例如(如果存在的話)腫瘤細胞或腫瘤組織的標記的ED-B結合分子來進行。如果使用放射同位素標記的結合分子，所述檢測可通過閃爍照相，SPECT或PET來進行。本發明的方法尤其適合對患者優選腫瘤患者根據其對治療的敏感性，優選對抗腫瘤治療的敏感性來進行分類。所述方法也可在患者的抗腫瘤治療開始之前進行以確定對具體的治療方案的敏感性。可選或此外，所述方法也可在患者抗腫瘤治療過程中進行。所述抗腫瘤治療優選包括給予EGF/EGFR拮抗劑，任選與給予其他抗腫瘤藥劑和/或放射療法組合。所述EGF/EGFR拮抗劑可選自小分子EGFR抑制劑，例如EGFR激酶抑制劑諸如厄洛替尼或吉非替尼。可選，EGF/EGFR拮抗劑可選自抗EGFR抗體，諸如西妥昔單抗。推薦的作為單獨的治療或與伊立替康組合的西妥昔單抗劑量是以400mg/m2作為初始負荷劑量，經靜脈內給予。推薦的周維持劑量是250mg/m2，也經靜脈內給予。所述劑量方案通常可根據本發明施用給患者，但也可降低或提高。尤其優選的實施方案中，本發明的方法在利用EGFR拮抗劑例如厄洛替尼的抗腫瘤治療開始之前進行。由此治療抵抗型患者可與治療敏感型患者區分開，由此較高程度地減少無效腫瘤治療。此外，本發明可通過以下實施例更為詳細地解釋。實施例1製備L19衍生物如WO03/055917所述製備L19衍生物AP39，所述文獻在此援引加入。實施例2利用放射同位素標記L19衍生物標記的L19衍生物AP39-Tc99m的製備如WO03/055917所述進行，所屬文獻在此援引加入。實施例3研究標記的L19衍生物與NSCLC細胞系的結合結合實驗在兩個人NSCLC腫瘤小鼠模型中進行NCI_H292，其是厄洛替尼敏感型上皮型模型，和Calu-6，其是厄洛替尼抵抗型間質型模型。TCEP-還原的AP39利用3_(N_馬來醯亞胺丙醯)生物胞素(Sigma)生物素化。生物素化的AP39與NCI-H292和Calu_6腫瘤組織的冷凍切片(5_10μm)的結合通過利用ExtrAvidin(Sigma)和LiquidDABSubstratePack(BioGenex)根據生產商的方案確定。與Calu-6(圖1B)腫瘤組織相比，更加廣泛的生物素化AP39的結合在NCI-H292(圖1A)中觀察到。Tc_99m放射標記的AP39經靜脈內以大約IllkBq的劑量注入攜帶NCI-H292和Calu-6腫瘤的裸鼠中(體重大約30g)。腫瘤中的放射活性濃度利用gamma-計數器在給藥所述物質1小時之後回體測定。Tc-99m-AP39的濃度在NCI-H292腫瘤組織中明顯較高(圖2)。Tc-99m放射標記的AP39經靜脈內以大約150MBq的劑量注入攜帶NCI-H292和Calu-6腫瘤的裸鼠(體重大約30g)。SPECT成像在給予所述物質之後4小時進行。該研究的結果顯示NCI-H292(圖3A)腫瘤比Calu-6(圖3B)腫瘤能被SPECT成像更好地顯示。實施例4合成N-[6-(4-[18F]氟苯亞甲基)氨基氧己基]馬來醯亞胺AP39([18F]FBAM-AP39)[18FlFBAMU據文獻(Berndtetal.NuclMedBiol.2007，34(1)，5-15)在一鍋法合成中在GEtracerlab上合成，並通過等度半製備HPLC(tR=15min；65/35Water/MeCN+0,1%TFA；ACE5C18-HL250*10mm；5μm；AdvancedChromatographyTechnologies；Cat.No.:ACE321-2510)純化。在常規實驗中，[18F]FBAM以500-1.OOOMBq的量在75min後以30-40%的經衰變校正後的放射化學產率分離。HPLC之後，總體積通過C-18SPE減少，[18F]FBAM配製在2mLMeCN中並在氮流中在55°C乾燥直到變幹。[18F]FBAM溶於DMS0/0.05MTris/NaCl緩衝液(pH=7.4)(1/9(ν/ν))，加入ΑΡ39(100μg,90μLPBS中，pH7.4)並在37°C保溫30min。偶聯率通過分析型HPLC(tR=13.2min；TSKgelsuperSW2000；300*4.6mm；4μ；TosoBios印；TSK緩衝液(0.IMNa2HP04/0·1MNa2SO4A).05%NaN3；ρΗ6.7，等度0.3ml/min)檢驗。F-18標記的AP39通過凝膠過濾利用SephadexNAP5藥筒純化並通過HPLC和電泳分析。免疫反應性評估通過親和層析根據Birchleretal.(J.Immunol.Methods1999，231，239-248)所述利用含有ED-B纖連蛋白-偶聯的S印harose進行。非校正偶聯產率就[18F]FBAM而言為10-15%。18F-標記的AP39，尤其是[18F]FBAM-AP39，對於本發明的方法和用途而言尤其有用，具體是用於PET。實施例5合成N-琥珀醯亞胺基4-[18F]氟苯甲酸AP39([18F]SFB-AP39)[18F]SFB根據文獻(Kabalkaetal.,JournalofLabeledCompoundsandRadiopharmaceuticals，2008，51，68-71)在一鍋法合成中在GEtracerlab上合成，並通過等度半製備HPLC(tR=15min；65/35Water/MeCN+0,1%TFA；ACE5C18-HL250*10mm；5μm；AdvancedChromatographyTechnologies；Cat.No.:ACE321-2510)純化。常規實驗中[18F]SFB以400-800MBq的量在65min後以30_35%的經衰變校正後的放射化學產率分離。HPLC之後，總體積通過C-18SPE減少，[18F]FBAM配製在2mLMeCN中並在氮流中在55°C乾燥直到變幹。[18F]SFB再溶於DMS0/0.IM硼酸鹽緩衝液(pH=8.6)(1/9(ν/ν))中，加入ΑΡ39(100μg，在90μLPBS中，pH7.4)。在37°C保溫30min。偶聯率通過分析型HPLC(tR=13.2min；TSKgelsuperSW2000；300*4.6mm；4μ；TosoBiosep；TSK緩衝液(0.IMNa2HP04/0·IMNa2SO4A).05%NaN3；ρΗ6.7，等度0.3ml/min)檢驗。F-18標記的AP39通過凝膠過濾利用SephadexNAP5藥筒純化並通過HPLC和電泳分析。免疫反應性評估通過親和層析根據Birchleretal.(J.Immunol.MethodsI999，23I,239_248)所述利用含有ED-B纖連蛋白-偶聯的S印harose進行。非校正偶聯產率就[18F]FBAM而言為10-12%。18F-標記的AP39，尤其是[18F]FBAM_AP39，對於本發明的方法和用途而言尤其有用，具體是用於PET。權利要求分類腫瘤細胞或腫瘤組織的方法，如果觀察到ED-B纖連蛋白-特異性分子的實質性結合分類為上皮型腫瘤細胞或組織，如果沒有觀察到ED-B纖連蛋白-特異性分子的實質性結合分類為間質型腫瘤細胞或組織，所述方法包括以下步驟(a)將ED-B纖連蛋白-特異性分子與腫瘤細胞或腫瘤組織接觸，並評估ED-B纖連蛋白-特異性分子與所述腫瘤細胞或腫瘤組織的結合，和(b)基於步驟(a)的評估對所述腫瘤細胞或腫瘤組織進行分類。2.權利要求1的方法，其中所述ED-B纖連蛋白-特異性分子的實質性結合表示對包含給予EGF/EGFR拮抗劑的抗腫瘤治療的敏感性。3.權利要求1或2的方法，所述腫瘤細胞或組織來自肺癌，特別是NSCLC，或前列腺癌、乳腺癌、胰腺癌、結腸癌、頭和頸癌、胃癌、卵巢癌、腎癌或宮頸癌。4.權利要求1-3之一的方法，其中所述腫瘤或腫瘤組織來自或存在於人腫瘤患者中。5.權利要求4的方法，其在所述患者的抗腫瘤治療開始之前進行。6.權利要求4的方法，其在所述患者的抗腫瘤治療過程中進行。7.權利要求5或6的方法，其中所述抗腫瘤治療包括給予EGF/EGFR拮抗劑，任選與其他抗腫瘤藥劑和/或放射療法組合。8.權利要求7的方法，其中所述EGF/EGFR拮抗劑選自小分子EGFR抑制劑，具體是厄洛替尼或吉非替尼(gefitinib)。9.權利要求7的方法，其中所述EGF/EGFR拮抗劑選自抗EGFR抗體，具體是西妥昔單抗(cetuximab)010.權利要求1-9之一的方法，其中所述ED-B纖連蛋白-特異性分子是肽或抗體。11.權利要求10的方法，其中所述ED-B纖連蛋白-特異性分子是具有來自抗體L19的⑶R序列的抗體。12.權利要求11的方法，其中所述ED-B纖連蛋白-特異性分子是抗體AP39。13.權利要求1-12之一的方法，其中所述ED-B纖連蛋白-特異性分子與可檢測標記基團特別是成像基團偶聯。14.權利要求13的方法，其中所述標記基團是放射標記基團。15.權利要求13或14的方法，其中所述標記基團是SPECT標記基團，特別是99mTc。16.權利要求14的方法，其中所述標記基團是PET標記基團，特別是18F。17.權利要求1-16之一的方法，其在體外進行。18.權利要求1-16之一的方法，其在體內進行。19.檢測細胞或組織特別是腫瘤細胞或腫瘤組織中的上皮間質轉變(EMT)的方法，包括以下步驟(a)將ED-B纖連蛋白-特異性分子與細胞或組織接觸，並評估ED-B纖連蛋白-特異性分子與所述細胞或組織的結合；和(b)基於步驟(a)的評估鑑定所述細胞或組織為上皮型細胞或組織或間質型細胞或組織。20.權利要求1或19的方法，其中步驟(a)中的評估基於成像方法。21.ED-B纖連蛋白-特異性分子在將腫瘤細胞或腫瘤組織分類為EGF/EGFR拮抗劑的治療敏感型或難治型的方法中的用途。22.權利要求21的用途，其中所述腫瘤細胞或腫瘤組織來自肺癌，特別是NSCLC，或前列腺癌、乳腺癌、胰腺癌、結腸癌、頭和頸癌、胃癌、卵巢癌、腎癌或宮頸癌。23.權利要求21或22的用途，其中所述抗腫瘤治療包括給予EGF/EGFR拮抗劑，任選與其他抗腫瘤藥劑和/或放射療法組合。24.ED-B纖連蛋白結合分子在檢測上皮間質轉變的方法中的用途。25.治療腫瘤的組合物或試劑盒，其包含與可檢測標記基團偶聯的AP39和EGF/EGFR拮抗劑。26.權利要求25的組合物或試劑盒，其中所述可檢測標記基團是放射標記基團，特別是SPECT標記基團或PET標記基團。27.權利要求25或26的組合物在治療腫瘤的方法中的用途。28.N-[6-(4-[18F]氟苯亞甲基)氨基氧己基]馬來醯亞胺AP39([18F]FBAM-AP39)。29.N-琥珀醯亞胺基4-[18F]氟苯甲酸酯AP39([18F]SFB-AP39)。全文摘要本發明涉及對腫瘤細胞分類的方法，包括以下步驟(a)提供包含待分析腫瘤細胞的樣品，(b)將ED-B纖連蛋白-特異性分子與所述樣品接觸，並評估其與所述樣品中腫瘤細胞的結合，和(c)基於步驟(b)的評估對所述腫瘤細胞進行分類。文檔編號A61K49/00GK101801420SQ200880107368公開日2010年8月11日申請日期2008年9月4日優先權日2007年9月17日發明者D·貝恩多夫,L·丁克爾博格,T·海因裡希申請人:拜耳先靈醫藥股份有限公司