一種強化前體供應增強α-酮戊二酸合成的解脂亞洛酵母的製作方法

2023-05-28 18:30:51 2

一種強化前體供應增強α-酮戊二酸合成的解脂亞洛酵母的製作方法【專利摘要】本發明公開了一種強化前體供應增強α-酮戊二酸合成的解脂亞洛酵母，屬於代謝工程【
技術領域：
】。本發明通過過量表達PDA1提高細胞內丙酮酸脫氫酶E1組分催化活力，不僅使中間代謝產物丙酮酸積累量下降，強化了細胞內乙醯-CoA供應；而且為細胞累積α-酮戊二酸提高了細胞內乙醯-CoA供應，致使細胞外積累的α-酮戊二酸明顯提高。因此，過量表達PDA1不僅降低了中間代謝產物丙酮酸含量，並且強化了α-酮戊二酸積累，為細胞積累TCA循環中的有機酸提供了新思路。【專利說明】—種強化前體供應增強α-酮戊二酸合成的解脂亞洛酵母【
技術領域：
】[0001]本發明涉及一種強化前體供應增強α-酮戊二酸合成的解脂亞洛酵母，屬於代謝工程領域。【
背景技術：
】[0002]α-酮戊二酸作為三羧酸循環(TCA)途徑中重要中間產物之一，在微生物細胞的代謝中起著重要的作用，不僅是三羧酸循環中的關鍵節點，在生物體內參與胺基酸、蛋白質、維生素的合成以及能量代謝；而且是微生物調控碳氮代謝平衡的重要節點，在研究與微生物氮代謝相關的調控機制方面具有重要作用。在工業上，α-酮戊二酸是重要的精細化工和醫藥工業的中間體，廣泛用於合成多種胺基酸、維生素和其它小分子物質，在醫藥、有機合成、營養強化劑等領域都有著重要的應用前景。[0003]由於α-酮戊二酸在微生物胞內代謝中的特殊地位，篩選得到的α-酮戊二酸生產菌株，在高產α-酮戊二酸的同時，在發酵終期仍然會積累大量丙酮酸等代謝副產物。中間代謝產物丙酮酸是細胞進行TCA循環的前體物質，丙酮酸進入TCA循環的代謝通量不僅與菌體細胞維持生長有關更決定終產物α-酮戊二酸積累量。並且，由於丙酮酸和α-酮戊二酸具有相似的物理化學性質，大量存在丙酮酸增加了下遊分離純化過程的困難和成本。因此強化丙酮酸進入TCA循環不僅強化了細胞積累α-酮戊二酸所需的前體物質，也為下遊分離純化過程降低了難度和成本。【
發明內容】[0004]本發明要解決的技術問題是提供一種強化前體供應增強α-酮戊二酸合成的解脂亞洛酵母基因工程菌，通過過量表達丙酮酸脫氫酶El組分α亞基的編碼基因pdal強化丙酮酸脫氫酶活力，促進丙酮酸脫氫形成乙醯-CoA，強化進入三羧酸循環的碳代謝流，為脂亞洛酵母(Yarrowialipolytica)WSH-Z06合成α-酮戍二酸增加前體供應。[0005]所述基因pdal的核苷酸序列為NCBI中GeneID:2908574所示的核苷酸序列。[0006]所述基因工程菌是以解脂亞洛酵母WSH-Z06CCTCCN0:M20714為宿主，以含有潮黴素轉磷酸移酶為篩選標記的整合型表達載體PO(hph)為表達載體。[0007]所述解脂亞洛酵母YarrowialipolyticaWSH-Z06從中國典型培養物保藏中心CCTCC獲得，菌種保藏編號為CCTCCNO:M20714。過量表達基因pdal後，重組菌株細胞內乙醯-CoA含量提高，胞外丙酮酸含量下降，並且積累的α-酮戊二酸含量上升。[0008]一種構建所述解脂亞洛酵母基因工程菌的方法，包括以下步驟:(I)擴增潮黴素磷酸轉移酶hph基因，hph基因的核苷酸序列如SEQIDN0.1所示，利用限制性內切酶StuI與HindIII同時處理擴增得到的hph基因和pO質粒，並連接兩酶切產物得到含有潮黴素轉磷酸移酶為篩選標記的整合型表達載體PO(hph);(2)構建重組整合型表達質粒:根據NCBI公開的序列，全化學合成丙酮酸脫氫酶El組分α亞基的編碼基因，並通過限制內切酶NotI和EcoRI同時切割獲得的開放閱讀框部分和整合型表達載體pO(hph)，連接獲得重組表達質粒pO(hph)-PDAl;(3)將所得重組質粒轉化Y.lipolyticaWSH-Z06:利用電穿孔轉化方法將被限制性內切酶AvrII線性化的重組整合型表達質粒轉化野生型Y.lipolyticaWSH-Z06，驗證篩選陽性轉化子。[0009]質粒pO的構建方法參見文獻:SwennenD,PaulMF,VernisL,BeckerichJM,FournierA,GaillardinC.Secretionofactiveant1-Rassingle-chainFvantibodybytheyeastsYarrowialipolyticaandKluyveromyceslactis.Microbiology-Sgm,2002.148:41-50。[0010]一種以所述基因工程菌發酵生產α-酮戊二酸的方法，是將所得重組基因工程菌接種至種子培養基中，28°C、200rpm，培養16-18小時；按10%的接種量從種子培養基中接種到3-L發酵罐中，培養溫度為28°C、通氣量為1.5vvm，攪拌轉數為400rpm，培養144-168小時。[0011]所述種子培養基成分為:葡萄糖20g/L,蛋白腖10g/L,MgSO4.7Η200.5g/L，KH2PO4IgzUpH為5.5。所述發酵培養基成分為:甘油100g/L，(NH4)2S043g/L,KH2P043g/L，MgSO4.7Η201.2g/L，NaCl0.5g/L，K2HPO40.lg/L，鹽酸硫胺素2Xl(T7g/L，調pH為5.0後再加入20g/LCaC03。[0012]與未過量表達基因pdal的對照菌相比:過量表達GeneID:2908574基因的重組菌株的細胞內丙酮酸脫氫酶El組分的催化活力提高10.7%;細胞內的乙醯-CoA含量提高了13.4%,從2.3nmol.mg_1DCff增加至2.6nmol.mg_1DCff;此時細胞外積累的丙酮酸含量下降T46.3%至18.7g.L-1，α-酮戊二酸含量從37.6g.L-1上升至42.5g.L-1。[0013]一種強化酵母合成α-酮戊二酸的方法，是通過過量表達丙酮酸脫氫酶El組分α亞基的編碼基因Pdal強化丙酮酸脫氫酶活力，促進丙酮酸脫氫形成乙醯-CoA，強化進入三羧酸循環的碳代謝流，為酵母合成α-酮戊二酸增加前體供應。[0014]所述酵母優選解脂亞洛酵母(Yarrowialipolytica)WSH-Z06。[0015]本發明的有益之處:本發明通過過量表達丙酮酸脫氫酶El組分α亞基的編碼基因，不僅使中間代謝產物丙酮酸積累量下降，強化了細胞內乙醯-CoA供應；而且為細胞累積α-酮戊二酸提高了細胞內乙醯-CoA供應，致使細胞外積累的α-酮戊二酸明顯提高。【專利附圖】【附圖說明】[0016]圖1過量表達PDAl促進細胞生長，Y.lipolyticaffSH-Z06,Y.1ipolyticaTl(?)。[0017]圖2過量表達PDAl增加乙醯-CoA供給。[0018]圖3過量表達PDAl提高丙酮酸脫氫酶El組分催化活力。[0019]圖4重組菌株細胞外酮酸含量。[0020]圖5過量表達PDAl對發酵生產α-酮戊二酸的影響；Α:野生菌發酵生產α-酮戊二酸；Β:重組菌株Y.1ipolyticaTl發酵生產α-酮戊二酸；菌體乾重(Λ)，α-酮戊二酸(〇)，丙酮酸(口)。【具體實施方式】[0021]材料與方法[0022]YPD培養基(g.L—1):蛋白腖10，酵母浸膏5，葡萄糖10，固體培養基另加20g.L-1瓊脂。轉化子篩選時加入潮黴素B至終濃度為400mg.L'[0023]種子培養基(g.I/1):葡萄糖20，蛋白腖10，MgSO4.7Η200.5，KH2PO4LO。用稀鹽酸調pH至5.5，115°C維持15min滅菌。固體斜面另添加20g.L-1瓊脂粉。[0024]發酵培養基(g.I/1):甘油100，(NH4)2S043，KH2P043，MgSO4.7Η201.2，NaCl0.5，K2HPO40.1，鹽酸硫胺素2Χ10_7,ρΗ=4.5。115°C，滅菌15min。接種前加入121°C滅菌30min的CaCO3至含量為20g.L-1。[0025]解脂亞洛酵母Y.lipolyticaWSH-Z06從中國典型培養物保藏中心CCTCC獲得，菌種編號為CCTCCNO:M20714o[0026]細胞乙醯-CoA測定:離心收集細胞，迅速放到液氮中冷凍120s，使細胞代謝活動終止；於4°C、5000rpm條件下離心10min;然後將離心所得細胞懸浮在lmL6%的高氯酸中，將細胞溶解；加入0.3mL3mol/L的碳酸鉀將酸中和，隨後4°C、5000rpm條件下離心20min,除去細胞碎片；取上清液經0.22μm的微濾膜過濾後，用於HPLC分析。HPLC條件:StableBondC18反相柱，柱溫:28°C,進樣體積:10μL,流速:1.0mL/min,紫外檢測波長:254nm;流動相:A為0.2mol/L的磷酸鈉(ρΗ5.0)，B為800mL0.25mol/L的磷酸鈉(ρΗ5.0)和200mL乙腈的混合物，以80%的A、20%的B混合為最終流動相。[0027]丙酮酸脫氫酶El組分催化活力和丙酮酸脫氫酶複合酶總催化活力測定:離心收集處於指數生長期的細胞，用0.9%生理鹽水洗滌，用IOmL0.1MKH2PO4-K2HPO4ImMEDTA0.01mMDTTpH7.5緩衝液懸浮細胞,在4°C條件下,加入石英砂研磨5min,13000Xg離心10min,上清液用於丙酮酸脫氫酶El組分催化活力和丙酮酸脫氫酶複合酶總催化活力測定。[0028]丙酮酸脫氫酶El組分催化活力測定:將0.5ml細胞破碎上清液，加入至含有50mMKH2P04-K2HP04、IOmMMgCl2、2.0mM丙酮酸、0.2mM焦磷酸硫胺素、0.lmM2,6-DCPIP，pH7.0的反應混合液中至總體積為3mL，在30°C，600nm條件下檢測2，6-DCPIP含量變化，IU的El組分催化活力定義為:單位時間內還原IμmoI的2，6-DCPIP所需要的酶量。[0029]丙酮酸脫氫酶複合酶總催化活力測定:將0.5ml細胞破碎上清液，加入至含有50mMKH2P04-K2HP04、10mMMgCl2、2.0mM丙酮酸、0.2mM焦磷酸硫胺素、2.5mMNAD\0.13mMCoApH8.0的反應混合液中至總體積為3mL，在30°C，340nm條件下檢測NADH含量變化，IU的El組分催化活力定義為:單位時間內生成IμmoI的NADH所需要的酶量。[0030]細胞外α-酮戊二酸和丙酮酸測定:將發酵培養液13000Xg離心，取適量上清液，用超純水稀釋50倍，過過0.22μm濾膜，用於HPLC分析。HPLC條件:AminexHPX-87Hionexchangecolumn;流動相:5mmol.L-1硫酸溶液(550μL濃硫酸定容到2L),用0.22μm孔徑的微濾膜抽濾並脫氣；柱溫:35°C;進樣量:10μL;流速:0.6mLmin'紫外檢測器檢測:波長210nm。[0031]Y.lipolytica轉化方法:將在YI3D培養基上長出的新鮮Y.lipolyticaWSH-Z06單菌落轉接至液體YI3D培養基中，28°C，200rpm，過夜培養。按10%接種量轉接至新鮮的液體YI3D培養基中28°C，200rpm培養至OD6qq=L2左右，離心收集細胞，於30°1:用8mL100mmol.L-1LiAc,10mmol.L^1DTT,0.6mol.TT1Scrrbito110mmol.L^1Tris-HCL,pH=7.5緩衝液處理8XIO8細胞。離心收集細胞，用5mL預冷的Imol.L-1的sorbitol洗漆細胞三次，並用Imol.L—1的sorbitol懸浮細胞至101°細胞.mL'加入Iyg預先線性化的整合型載體至細胞懸浮液中，置於冰上溫孕5分鐘，將該混合物轉移至預冷的0.2cm電轉杯中，電擊，電擊條件為2.5KV，25μF，200Ω，立即加入ImL預冷的Imol.L^sorbitol,室溫靜置I小時，將0.2mL電擊產物塗布於含有400mg.L-1的潮黴素B的選擇平板中，28°C培養48-72小時。[0032]表1整合型表達過量驗證引物[0033]【權利要求】1.一種強化前體供應增強α-酮戍二酸合成的解脂亞洛酵母(YarrowiaIipolytica)基因工程菌，其特徵在於，是在解脂亞洛酵母中過量表達編碼丙酮酸脫氫酶El組分α亞基的基因pdal。2.根據權利要求1所述的基因工程菌，其特徵在於，所述基因pdal的核苷酸序列為NCBI中GeneID:2908574所示的核苷酸序列。3.根據權利要求1所述的基因工程菌，其特徵在於，是以解脂亞洛酵母CCTCCN0:M20714為宿主，以含有潮黴素轉磷酸移酶為篩選標記的整合型表達載體pO(hph)為表達載體。4.一種構建權利要求1所述基因工程菌的方法，其特徵在於，步驟為:(I)構建表達目的基因所用的整合型表達載體:擴增潮黴素磷酸轉移酶hph基因，hph基因的核苷酸序列如SEQIDN0.1所示，利用限制性內切酶StuI與HindIII同時處理擴增得到的hph基因和PO質粒，並連接兩酶切產物得到含有潮黴素轉磷酸移酶為篩選標記的整合型表達載體PO(hph);(2)構建重組整合型表達質粒:根據NCBI公開的序列，全化學合成編碼丙酮酸脫氫酶El組分α亞基的基因的開放閱讀框序列，並通過限制內切酶NotI和EcoRI同時切割獲得的開放閱讀框部分和整合型表達載體PO(hph)，連接獲得重組表達質粒；(3)將所得重組質粒轉化Y.1ipolyticaWSH-Z06:利用電穿孔轉化方法將被限制性內切酶AvrII線性化的重組整合型表達質粒轉化野生型Y.1ipolyticaWSH-Z06,驗證篩選陽性轉化子。5.一種應用權利要求1所述基因工程菌發酵生產α-酮戊二酸的方法，是將所得重組基因工程菌接種至種子培養基中，28°C、200rpm培養16-18小時；按10%的接種量從種子培養基中接種到3-L發酵罐中，培養溫度為28°C、通氣量為1.5vvm，攪拌轉數為400rpm，培養144-168小時。6.根據權利要求5所述的方法，其特徵在於，所述種子培養基成分為:葡萄糖20g/L，蛋白腖10g/L，MgSO4.7Η200.5g/L，KH2PO41g/L,ilpH為5.5。7.根據權利要求5所述的方法，其特徵在於，所述發酵培養基成分為:甘油100g/L，(NH4)2S043g/L，KH2P043g/L，MgSO4.7Η201.2g/L，NaCl0.5g/L，K2HPO40.1g/L,鹽酸硫胺素2Xl(T7g/L，調pH為5.0後再加入20g/LCaC03。8.一種強化酵母合成α-酮戊二酸的方法，其特徵在於，是通過過量表達丙酮酸脫氫酶El組分α亞基的編碼基因pdal強化丙酮酸脫氫酶活力，促進丙酮酸脫氫形成乙醯-CoA，強化進入三羧酸循環的碳代謝流，為酵母合成α-酮戊二酸增加前體供應。9.根據權利要求8所述的方法，其特徵在於，所述酵母為解脂亞洛酵母(YairowiaIipolyticaX【文檔編號】C12N15/81GK103923847SQ201410093771【公開日】2014年7月16日申請日期:2014年3月14日優先權日:2014年3月14日【發明者】陳堅,周景文,郭洪偉,堵國成申請人:江南大學