結合葉綠素螢光技術和原生質體系統研究光合作用的方法及其應用的製作方法

2023-05-28 18:48:46 2

專利名稱：結合葉綠素螢光技術和原生質體系統研究光合作用的方法及其應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種科研用方法，特別涉及一種用於研究光合作用的方法。
背景技術：
植物的生長發育離不開光合作用，光合作用是生物界所有物質代謝和能量代謝的物質基礎，它包括一系列光物理、光化學和生物化學轉變的複雜過程。對光合作用的研究有助於人們更為深入地了解光合作用的過程，進而有目的地對植株，特別是農作物進行轉基因處理，以提高光合作用的效率。目前，研究參與光合作用的基因功能，主要通過穩定轉化獲得過表達、幹涉植株，或是通過突變體，周期長，工作量大。這種研究方法效率低，很難高效地篩選出與光合作用 有關的基因。原生質體是植物細胞除去細胞壁後，由細胞質膜包裹著的那部分具有生物活性的物質。隨著多種原生質體分離酶，如纖維素酶、半纖維素酶、果膠酶、離析酶、崩潰酶等的發現，在實驗室條件下大量製備高活性的原生質體已發展成為一種常規技術。已經分離得到許多植物材料的原生質體。Yoo等報導了一種利用纖維素酶R-IO以及離析酶R-IO分離原生質體的方法(Yoo, S. D. , Cho, Y. H. , and Sheen, J. (2007). Arabidopsis mesophyllprotoplasts: a versatile cell system for transient gene expression analysis.Nat Protoc 2，1565-1572.)。現階段，通過優化酶解擬南芥材料的酶液體系，摸索酶解時間，改良原生質體製備過程中的關鍵步驟，比如離心，過濾等可以方便而又快速地獲得大量具有很強光合活性的原生質體(Riazunnisa, K. , Padmavathi, L. , Scheibe, R. , andRaghavendra, A.S. (2007). Preparation of Arabidopsis mesophyll protoplasts withhigh rates of photosynthesis. Physiol Plantarum 129, 679-686)。原生質體瞬時表達技術是以原生質體為轉化受體，通過一定的方法將外源基因導入原生質體內，使外源基因得以快速表達，並且能在短期內維持表達水平的技術。原生質體瞬時表達技術與傳統的穩定轉化技術相比，主要的不同之處在於穩定轉化將外源基因轉化進入植物體內，並整合到植物基因組中，因此基因信息可遺傳；而在原生質體瞬時表達系統中，則是將外源基因構建到載體質粒上，轉化後在原生質體中瞬時表達，不整合到植物基因組中，也不產生可遺傳後代。現階段，儘管傳統的穩定轉化已經不存在技術問題，但是穩定轉化周期長，需要繁瑣的工作來鑑定轉基因植物，工作量大，外源基因表達不穩定且效率低，因而滿足不了目的基因的高通量功能分析的需求。此外，部分基因的突變體植株或者過表達植株會突變致死，這使得這類基因的研究工作受到限制。以原生質體為轉化受體的基因瞬時表達技術的產生，有利於緩解這種需求，已成為目前分子生物學研究中的重要技術手段(Sheen，2001)。有關原生質體瞬時表達技術的最早報導是1969年，Aoki和Takebe利用菸草葉肉細胞原生質體和菸草花葉病毒第一次成功地將外源核酸引入原生質體(Aoki and Takebe,1969)。此後，出現了多種DNA瞬時轉化方法，比如，聚乙二醇(PEG)轉化法、電激轉化法、基因槍轉化法等，使得DNA瞬時轉化效率得到很大的提高，在此基礎上，可以製備多種植物材料的原生質體，轉化目的基因，研究基因定位、基因功能和信號通路(Yoo et al.，2007;Zhang et al.，2011)。而隨著一些新的、經濟敏感的報告基因如β-葡萄糖醛酸酶(⑶S)、螢光素酶(LUC)以及綠色螢光蛋白(GFP)被引入原生質體瞬時表達系統，可以根據報告基因活性來反映外源基因的表達水平，原生質體瞬時表達系統也因此得到更為廣泛的使用(Sheen, 2001)。擬南芥葉肉細胞原生質體廣泛應用於基因瞬時表達研究(Yoo et al.，2007)，信號通路研究(Sheen, 2001),離子通道研究(Lemtiri-Chlieh and Berkowitz, 2004; Qiet al. , 2004)以及分子生物學等方面的研究(An et al. , 2003; Baek et al. , 2004;Lemtiri-Chlieh and Berkowitz, 2004; Kim et al. , 2006)。調製葉綠素螢光成像系統具有測量快速、簡單、可靠、針對活體且測量過程對樣品 生長基本無影響等特點，被廣泛應用於藻類及其他高等植物的生理、生態學研究。如，用於篩選葉綠素螢光參數發生變化的突變體，進行遺傳育種。Niyogi等根據NPQ參數的差異，做了萊茵衣藻光合突變體的篩選工作；他們也用同樣的方法，以擬南芥為材料作了篩選工作，共鑑定出13個NPQ發生變化的突變體，篩選到了藻類和擬南芥的葉黃素循環突變體(Niyogi et al. , 1997; Niyogi et al. , 1998)。此外，也可利用調製葉綠素突光成像系統篩選雖然影響植物代謝及生長但不直接參與光合作用的突變體(Barbagallo et al.，2003)。因為調製葉綠素螢光成像系統能通過成像的方式直觀地反映葉綠素螢光參數的差異及變化，不僅可以檢測葉片光合作用的橫向異質性，還可檢測早期肉眼不可見的脅迫損傷，甚至是闡明損傷機理和調節機制。有報導調製葉綠素螢光成像系統能應用於凍害影響的直觀定量(Ehlert and Hincha, 2008)，並能夠定量評估擬南芥乾旱處理後的存活時間(Woo et al.，2008)。又由於調製葉綠素螢光成像系統成像面積較大，可同時測量多個微藻樣品，因此在生態毒理學領域也具有較大的應用(Escher et al.，2006)。可直觀的檢測植物光合作用相關的生理指標，研究生理過程(Muller et al. , 2001; Gould et al.,2010)。儘管如此，至今沒有通過測定擬南芥葉肉細胞原生質體瞬時表達系統的葉綠素螢光來研究光合作用的相關方法報導。

發明內容
本發明的目的在於提供一種新的光合作用研究方法。本發明所採取的技術方案是
一種研究光合作用相關功能基因的方法，包括如下步驟
1)製備含有葉綠體的原生質體，並將待測基因和/或反義核酸序列轉入原生質體並確認待測基因可瞬時表達和/或反義核酸序列已使基因表達瞬時沉默；
2)將轉入有待測基因和/或反義核酸序列的原生質體和對照原生質體進行暗適應處理；
3)將暗適應處理的原生質體進行光照處理，獲取其螢光圖像和/或螢光參數，或基於螢光圖像和/或螢光參數繪製葉綠素螢光誘導動力學曲線和/或光誘導曲線；4) 對比不同處理組的螢光圖像、螢光參數、葉綠素螢光誘導動力學曲線、光誘導曲線中的至少一種，判斷待測基因和/或反義核酸序列對光合作用的影響，確定其是否為光合作用相關基因。轉入原生質體的待測基因和/或反義核酸序列至少為一種。優選的，暗適應處理的時間為8 12 min。優選的，測定葉綠素螢光誘導動力學曲 線和快速光響應曲線的程序為
1)打開不足以使原生質體進行光合作用的微弱測量光，測得最小螢光Ftl；
2)隨後施加一個飽和脈衝，關閉所有的電子門，暫時抑制植物的光合作用，得到最大螢光Fm;
3)打開光化光，使原生質體光合作用，施加飽和脈衝後，得到的葉綠素螢光為光化光下最大突光Fm』 ；
4)待飽和脈衝處理後，葉綠素螢光值達到穩態之後，關閉光化光，同時打開遠紅光，使電子門回到開放態，F回到最小螢光Ftl附近，此時得到的螢光為Ftl'優選的，原生質體為擬南芥葉肉細胞原生質體。本發明的有益效果是
本發明方法利用原生質體瞬時表達技術結合螢光分析技術，可以快速測定待測基因對光合作用的影響，有助於人們更為快速、方便地對光合作用相關基因進行研究。本發明方法可以同時對多個基因進行研究，可以進行高通量篩選。


圖I是擬南芥葉肉細胞原生質體FDA染色後的顯微 圖2是四周齡野生型和/7識5突變體的葉綠素螢光參數比較 圖3是DCMU對葉盤和原生質體的光合電子傳遞抑制效果 圖4是擬南芥葉肉細胞原生質體中瞬時表達的GFP的螢光顯微 圖5是瞬時過表達NPQ-GFP對原生質體的影響 圖6是瞬時過表達ATPC1-GFP對原生質體Fv/Fm和ΦΡ5ΙΙ的影響 圖7是瞬時過表達ATPCl-c-myc對原生質體Fv/Fm和ΦΡ5ΙΙ的影響 圖8是DTT處理對原生質體與葉片的ΦΡ3ΙΙ和NPQ的影響 圖 9 是瞬時過表達 TRX ml-GFP、TRX m2_GFP、TRX m3_GFP、TRX m4_GFP 對原生質體的ΦΡΞΙΙ和NPQ的影響 圖10是瞬時過表達TRX fl-GFP，TRX f2_GFP對原生質體的OPSII和NPQ的影響圖； 圖11是瞬時過表達TRX fl-GFP與OPSII之間的關係 圖12是瞬時過表達Fdl-GFP，Fd2-GFP，FTRc-GFP對原生質體葉綠素螢光參數的影響
圖 13 是 Fdl-GFP，Fd2-GFP, FTRc-GFP, TRX fl-GFP 和 TRX f2_GFP 的亞細胞定位圖。
具體實施例方式下面結合試驗，進一步說明本發明。一、原生質體葉綠素螢光測定體系的建立實驗材料及溶液
擬南芥原生質體製備溶液的配製方法 (I)母液
①MES(O. 2 M，pH 5. 7):稱取3. 9 g MES溶解於100 mL去離子水；
②甘露醇(O.8 M):稱取29. I g甘露醇溶解於200 mL去離子水；
③CaCl2(I M):稱取100 g CaCl2 溶解於100 mL去離子水；
④KCl(2 M):稱取14. 9 g KCl溶解於100 mL去離子水；
⑤MgCl2(2 M):稱取20. 33 g MgCl2溶解於100 mL去離子水；
⑥BSA(10 %):稱取I g BSA溶解於10 mL去離子水，分裝。以上母液均用O. 45 Mffl濾膜過濾除菌，常溫保存。酶液
配比為2 mL MES (O. 2 M pH 5.7),10 mL Mannitol (O. 8 Μ), 200 μ KCl (2 Μ), O. 3g Cellulase R-10,0. 08 g Macerozyme R-10,7.4 mL ddH20, 55 °C加熱 10 min,冷卻到室溫，再加入200 μ CaCl2 (I Μ), 200 μ BSA (10%)。混合均勻，用0.45 Mm濾膜過濾得到；W5溶液
配比為2 mL MES (O. 2 M pH 5. 7)，I. 8 g NaCl, 3. 675 g CaCl2 · 2Η20，0· 5 mL KCl (2Μ), 172. 5 mL ddH20。植物材料
本試驗使用的植物材料有野生型擬南芥thaliana, ecotype Columbia) 擬南芥的培養
(I)培養條件溫度為23 °C，光強110 Mmol ·πΓ2 · ^，16 h光照，8 h黑暗，相對溼度60% 70%。(2)培養方法取適量擬南芥種子置於4 °C冰箱內春化4 5 d後，取出種子，將其點種在滅過菌的營養土上。蓋上透明罩培養以緩苗，3 d後揭開罩子。待苗生長三至四周時，方可使用。擬南芥葉肉細胞原生質體的製備
1)選取3 4周齡、充分伸展的擬南芥葉片(葉位2、3、4對)
2)用刀片將葉片切成O.5^1 mm的細條，放入並浸沒在酶液中；
3)將酶液於10mm汞柱的真空下抽真空30 min,室溫黑暗靜置酶解3 h ；
4)晃動酶液釋放原生質體,加入等體積的W5溶液，輕輕晃動平皿，充分釋放原生質
體；
5)用55Mm的尼龍網過濾原生質體,收集至15 mL圓底塑料試管中,800 rpm離心]Λ2min，沉澱的原生質體用預冷的W5溶液清洗一次，之後冰上靜置30 min。擬南芥葉肉細胞原生質體製備效果的檢測
使用突光素二乙酸酯(fluorescein diacetate, FDA)染色法檢測原生質體活力，結果如圖I所示。顯微鏡下可觀察到制出的原生質體形狀為正常的圓球狀，用FDA染色5 min後，藍光照射，呈黃綠色有活性的原生質體數目接近100%。原生質體葉綠素螢光參數測定
採用德國Walz公司的IMAGING-PAM-M-Series葉綠素螢光儀測定原生質體的葉綠素螢光誘導動力學曲線和快速光響應曲線。測定葉綠素螢光誘導動力學曲線時，先將原生質體樣品加入96孔板，暗適應10min。打開配套軟體，選定感興趣的區域(Α0Ι)，所有螢光參數的值都通過軟體記錄下來。用弱光(O. 5 Mmol · m_2 · s_0照射測定初始螢光(Ftl)，調製頻率為I Hz，隨後進行飽和脈衝光(2 700 Mmol · m_2 · s-1)處理，一個脈衝後，得到最大螢光(Fm)，打開適合擬南芥原生質體的光化光(35 Mmol · m_2 · S-1)，之後再進行飽和脈衝光處理，一個脈衝後，得到光化光下的最大突光(Fm』 )。充分暗適應後，PSII的最大光化學效率(Fv/Fm)、光化學能量轉化的有效量子產量[Y(II), OPSII]、非光化學淬滅係數(NPQ)等各參數數值均是在選定模式下系統自動計算生成。成像圖直接導出觀察，各參數值導出後，通過相關軟體進一步分析。擬南芥葉肉細胞原生質體葉綠素螢光測量板的選取
將新鮮分離的高活力野生型擬南芥葉肉細胞原生質體分裝於普通的透明96孔板中， 測定其葉綠素螢光參數。結果表明透明板中各孔原生質體間的螢光信號會相互影響，通過嘗試不同的培養板，最後發現白色不透明96孔板能有效地避免這種影響，因此，後續實驗均使用白色不透明板。擬南芥葉肉細胞原生質體懸浮基質的選取
擬南芥葉肉細胞原生質體瞬時表達系統中常使用兩種懸浮基質W5溶液和WI溶液。為了選擇合適的懸浮基質，製備原生質體，分別用W5溶液和WI溶液懸浮，置於白色不透明96孔板中，測定葉綠素螢光參數Fv/Fm。實驗發現相比於W5溶液，用WI溶液懸浮的原生質體，其Fv/Fm(PSII最大量子產量)較高，分別為0. 72和O. 68，選定WI為懸浮基質。不同體積、濃度擬南芥葉肉細胞原生質體Fv/Fm的比較
製備擬南芥葉肉細胞原生質體，用WI溶液懸浮，設置三個體積梯度(50 μ , οο μ 、200μι)、三個濃度梯度(4Χ105、2Χ105、1Χ105)，將原生質體分別置於白色不透明96孔板中，測定葉綠素螢光參數Fv/Fm實驗發現濃度為4 X IO5個/mL，體積為200 μ 時原生質體的Fv/Fm最高。考慮到經濟因素，選定的體積、濃度體系為2X IO5個/mL，體積為100 μ 。二、擬南芥葉肉細胞原生質體與葉片葉綠素螢光參數的比較
文獻報導(PGR5是環式電子傳遞所涉及到的蛋白質)突變體的NPQ低於野生型(DalCorso et al.，2008)，除草劑二氧苯基二甲基脲(DCMU)能夠阻斷PSII電子從Qa向二級質子醌受體(Qb)傳遞，導致Qa迅速還原，光化學淬滅受到抑制，初始螢光(Fci)增加(Allahverdiyeva et al. , 2007)。因此,用DCMU分別處理野生型擬南芥的葉盤和原生質體，比較DCMU處理後二者葉綠素螢光參數發生改變的趨勢，可以確定原生質體系統與植株的葉綠素螢光參數是否相似或者變化趨勢一致，進而確定葉綠素螢光成像技術能否用於測定擬南芥葉肉細胞原生質體瞬時基因表達系統的葉綠素螢光參數。植物材料
採用的植物材料為擬南芥純合突變體/7識5，及其對應的野生型擬南芥。擬南芥的處理及原生質體的製備同上。擬南芥葉片葉綠素螢光參數測定採用德國Walz公司的Imaging-PAM-M-Series葉綠素突光儀測定擬南芥葉片的葉綠素螢光誘導動力學曲線。擬南芥葉片葉綠素螢光誘導動力學曲線測定的方法與原生質體葉綠素螢光誘導動力學曲線測定的方法類似，不同之處在於適合擬南芥葉片的光化光光強為110Mmol · πΓ2 · S-1 ；
四周齡野生型、突變體植株的NPQ誘導曲線的測定方法為610 Mmol · πΓ2 · s_1強度高光照射6 min,隨後暗適應4 min ；
四周齡野生型、突變體原生質體的NPQ誘導曲線的測定方法為110 Mmol ·πΓ2 *s_1強度高光照射6 min,隨後暗適應4 min。二氧苯基二甲基脲(DCMU)，處理擬南芥葉肉細胞原生質體
配製6個梯度為0、0. 5、1、5、10、50 μΜ的DCMU溶液，將其分別加入96孔板中，每孔10 μ 。隨後，在各孔中加入原生質體90 μ ,混合均勻，使原生質體溶液中DCMU的終濃度分別為:0、0· 05、0· I>0. 5、1、5 M-M0DCMU處理擬南芥葉盤
用2 mM MES溶液配製6個梯度為0、0. 5、1、5、10、50 μΜ的DCMU溶液。用直徑為6 mm的打孔器從四周齡的擬南芥葉片上打下葉盤，迅速放入配置好的DCMU溶液中，暗處理20min。處理完後，用去離子水洗去葉盤表面殘留的DCMU，在Imaging-PAM的測量板上鋪好葉盤，暗適應10 min,測定葉綠素突光。實驗結果
為了明確原生質體的葉綠素螢光參數發生改變的趨勢是否與葉片一致，選取/7識5及其對應的野生型作為比較。先測定野生型、突變體葉片的葉綠素螢光參數隨後，以它們為材料分別製備原生質，測定野生型、突變體原生質體的葉綠素螢光參數Fv/Fm與NPQ。實驗結果如圖2所示，圖中，A.四周齡野生型、/7識5突變體植株各自的Fv/Fm、1/4NPQ螢光成像圖，1/4 NPQ的圖像為110 Mmol · m_2 · s—1強度光強照射3 min ；B.四周齡野生型、/7識5突變體植株的NPQ誘導曲線，610 Mmol · m_2 · s—1強度高光照射6 min,隨後暗適應4 min, η = 8 ；C.四周齡野生型、/7識5突變體原生質體各自的Fv/Fm、1/4 NPQ螢光成像圖，1/4 NPQ的圖像為35 Mmol · m_2 · s—1強度光強照射3 min後所獲得；D.四周齡野生型、突變體原生質體的NPQ誘導曲線，110 Mmol · m_2 · s—1強度高光照射6 min,隨後暗適應 4 min, η = 6。從圖中可以看出，對葉片而言，PGR5突變後，相比野生型其非光化學淬滅常數NPQ會降低而Fv/Fm卻不會發生顯著改變(圖2A和B)。與葉片結果相似，突變體原生質體的NPQ值相比野生型原生質體顯著降低(圖2 C和D)。DCMU處理野生型擬南芥葉盤和原生質體後葉綠素螢光參數的比較
分別製備野生型擬南芥的葉盤和對應的原生質體，用濃度梯度為0、0. 5、1、5、10和50μΜ的DCMU處理生型擬南芥的葉盤，用濃度梯度為0、0. 05,0. 1,0. 5、1和5 μΜ的DCMU處理生型擬南芥製備的原生質體。實驗結果如圖3所示，圖中A. DCMU處理後，原生質體(白色柱)和葉盤(灰色柱)的葉綠素螢光參數Fv/Fm的螢光成像圖及其對應的值；B. DCMU處理後，原生質體(白色柱)和葉盤(灰色柱)的葉綠素螢光參數Ftl的螢光成像圖及其對應的值；C. DCMU處理後，原生質體(白色柱)和葉盤(灰色柱)的葉綠素螢光參數1/4 NPQ的螢光成像圖及其對應的NPQ值；D. DCMU處理後，原生質體(白色柱)和葉盤(灰色柱)的葉綠素螢光參數OPSII的螢光成像圖及其對應的值。其中，η =8。如圖所示，處理原生質體所用的DCMU濃度為0、0.05、0. I、O. 5、1和5 μΜ，而處理葉盤所用的DCMU濃度則為0、0. 5、1、5、10和50 μΜ。實驗結果表明隨著DCMU濃度的增加，葉盤與原生質體的初始螢光(Ftl)均逐漸增大(圖38)，而卩>111，咿0，？511的實時螢光OPSII均會逐漸降低(圖3A，C，D)。通過實驗可知，原生質體的葉綠素螢光參數能在一定程度上反映葉片的真實情況，可以通過測定原生質體的葉綠素螢光參數來分析葉片的光合作用。三、擬南芥原生質體中瞬時表達光合作用相關基因對其葉綠素螢光參數的影響 擬南芥葉肉細胞原生質體瞬時表達技術中，原生質體需要經歷PEG介導的質粒DNA轉
化過程及過夜培養過程。為了明確轉化後原生質體是否依然適合於葉綠素螢光測定。分 別在原生質體中瞬時轉化了 GFP和NPQl-GFP融合蛋白以及GFP與ATPC1-GFP，c-myc與ATPCl-c-myc 融合蛋白。其中，NPQ1( Non-photochemical quenching 1)，編碼紫黃質去環氧化酶，作為葉黃素循環中的關鍵酶，在強光下能夠將紫黃質轉變為玉米黃質，從而耗散掉過剩的光能，起光保護的作用(Niyogi et al.，1998)。缺失NPQl的擬南芥突變體，其NPQ會大大下降(Niyogi et al. , 1998),而在菸草中過表達NPQl會導致NPQ增加(Havaux etal.，2000)。ATPCl是質體ATP合酶的一個亞基，缺失ATPCl的擬南芥突變體，暗適應後，其最小螢光F。會增加，而且，其匕疋和OPSII會顯著降低(Bosco et al.，2004; Wu etal. , 2007)。植物材料
本實驗所用植物材料為野生型擬南芥thaliana, ecotype Columbia,Nossen)，將擬南芥種子在37 1培養箱中烘乾後，置於4 °C冰箱內冷凍保存。擬南芥轉化主要溶液的配製方法
(1)WI溶液(20 mL)
O. 4 mL MES (O. 2 M pH 5.7),12.5 mL Mannitol (O. 8 Μ),O. 2 mL KCl (2 Μ)6. 9 mL ddH20
(2)MMG 溶液(10 mL)
0. 2 mL MES (0. 2 M pH 5. 7),5 mL Mannitol (0. 8 Μ)，0· 15 mL MgCl2 (I Μ)，4· 65 mLddH20
(3)PEG/Ca2+溶液(10mL)
4g PEG 4000,2. 5 mL Mannitol (0.8 Μ), I mL CaCl2 (I M)，3 mL ddH20。擬南芥葉肉細胞原生質體瞬時轉化
MMG溶液重懸原生質體，定量至1-2 X IO5個/mL
在一個2 mL的圓底EP管加入10 μ DNA (5 kb大小的質粒DNA 10 2(^g)，加入100KL原生質體(2 X IO4個原生質體)，混勻；
再加入110 μ PEG/Ca2+溶液，混勻；
暗處放置15 min後用440 μ W5溶液稀釋，並輕輕混勻，800 rpm離心2 min，去上清； 加入WI溶液，分散原生質體，平鋪於6/12/24孔板中培養過夜。瞬時轉化的確認提取純化轉化後原生質體的蛋白，進行蛋白電泳及western blot,確認轉化至原生質體的基因是否有表達。在擬南芥原生質體中瞬時轉化GFP載體後，經過過夜培養，收集原生質體，在血球計數板上蓋上蓋玻片，將原生質體從側面吸入計數室，在螢光顯微鏡下觀察。根據發綠色螢光的原生質體與所有原生質體數目的比值來統計轉化率，觀察結果如圖4所示。從圖中可知原生質體的轉化率可達90%以上。NPQl-GFP瞬時過表達後葉綠素螢光參數分析
在擬南芥葉肉細胞原生質體中瞬時過表達GFP和NPQl-GFP融合蛋白，過夜培養，收集原生質體，800 rpm轉速離心，吸出多餘培養液,將剩餘培養液與原生質體混勻，按每孔100KL量分裝於96孔板。待所有樣品分裝完成，將96孔暗適應10 min後測定葉綠素螢光參數。實驗結果如圖5所示。圖中，A.原生質體瞬時過表達GFP、NPQl-GFP後各自的1/4 NPQ螢光成像圖，為六組重複取三組原生質體瞬時過表達GFP、NPQ1-GFP後各自所測得的NPQ 數值，數值為六組重複取平均值，< O. 01; -test ；C. Western blot檢測瞬時表達的GFP和NPQl-GFP蛋白，上圖是用抗GFP的多克隆兔抗的免疫印跡，下圖是CBB染色的PVDF膜，星型標記表示非特異性條帶，RbcL是核酮糖-1，5- 二磷酸羧化酶的大亞基。數據表明過表達NPQl-GFP融合蛋白的原生質體，其NPQ高於過表達GFP蛋白原生質體的NPQ。數值分別為O. 37和O. 21 (圖5A，5B)。收集已測定葉綠素螢光參數的原生質體，提取蛋白，進行蛋白電泳和westernblot檢測。Western blot結果顯示用抗GFP的抗體可以檢測出GFP和NPQl-GFP融合蛋白對應的條帶，說明它們能夠在擬南芥葉肉細胞原生質體中成功表達(圖5 C)。這些結果顯示原生質體經過瞬時轉化，仍然具有光合活性和生理功能，適合於葉綠素螢光參數測定。ATPCI-GFP瞬時過表達後葉綠素螢光參數分析
為了更加充分地證明瞬時過表達外源基因的原生質體能用於葉綠素螢光參數測定，選取另一個已報導過的，其穩定過表達植株的葉綠素螢光參數會發生變化的基因477^7進行實驗。先在擬南芥葉肉細胞原生質體中瞬時過表達GFP和ATPC1-GFP融合蛋白，過夜培養，收集原生質體，800 rpm轉速離心，吸出多餘培養液,將剩餘培養液與原生質體混勻，按每孔100 μ 量分裝於96孔板。待所有樣品分裝完成，將96孔暗適應10 min後測定葉綠素螢光參數。實驗結果如圖6所示。圖中，A.原生質體瞬時過表達GFP、ATPC1-GFP後各自Fv/Fm的螢光成像圖及對應的數值；B.原生質體瞬時過表達GFP、ATPC1-GFP後各自OPSII的螢光成像圖及對應的數值；C. Western blot檢測瞬時表達的GFP和ATPC1-GFP蛋白，上半部分是用抗GFP的多克隆兔抗的免疫印跡，下半部分是CBB染色的PVDF膜，RbcL是核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶的大亞基；D.原生質體瞬時過表達GFP (20 μδ) ,ATPCI-GFP (0、5、10,15,20 μδ)後各自OPSII的螢光成像圖及對應的數值；Α、B中螢光成像圖為六組重複中取三組，對應數值為六組重複取平均值；D中螢光成像圖為四組重複取一組，對應數值為四組重複取平均值；< 0. 05, ^ 0. 01; i-testo比較過表達ATPC1-GFP融合蛋白的原生質體與過表達GFP的原生質體。前者的匕/^與CDPSII均高於後者，數值分別為Fv/Fm (0.67與0.58)(圖6A)，ΦΡΞΙΙ (0. 35與0. 28)(圖 6Β)。
為了證明瞬時轉化ATPC1-GFP後，原生質體葉綠素螢光參數Fv/Fm與ΦΡ5ΙΙ增高是由ATPCl過表達造成的，將35S:ATPC1-GFP融合質粒DNA的量設置一個梯度後轉化原生質體。在100 μ 反應體系中，當35S:ATPC卜GFP的量低於10 μδ時，轉化效率很低，與對照即轉化20 μg質粒的原生質體相比，它們的OPSII幾乎一致(圖6D)。當轉化15或20 Pg質粒時，原生質體的Φ PSII顯著高於對照(圖6D)。並且ΦΡΞΙΙ的數值隨著ATPCI-GFP融合蛋白量的增加而增加(圖6D，Ε)。
收集已測定葉綠素螢光參數的原生質體，提取蛋白，進行蛋白電泳和westernblot檢測。Western blot結果顯示用抗GFP的多克隆兔抗可以檢測出GFP和ATPC1-GFP融合蛋白對應的條帶，說明它們能夠在擬南芥葉肉細胞原生質體中成功表達(圖6C)。以上結果表明瞬時過表達ATPCl融合蛋白的原生質體其葉綠素螢光參數FyF111,φρεπ發生改變的確是由ATPCi蛋白過表達所造成的。ATPCl-c-myc瞬時過表達後葉綠素螢光參數分析
考慮到有些蛋白與GFP融合表達後會散失功能，為了儘可能降低這種影響，有時會直接表達蛋白，或是將蛋白與較小的標籤融合表達，如HA，c-myc，6XHiS，FLAG等。為了進一步證明上一部分實驗中原生質體葉綠素螢光參數發生改變的原因確實是ATPCl基因過表達。將ATPCl連入改造過的pUC-c-myc中，構建載體ATPCl-c-myc，選擇生態型為Col-O和No-O的野生型擬南芥，製備原生質體，瞬時過表達ATPCl與10個胺基酸的多肽融合的ATPCl-c-my,同時瞬時轉化c_myc作為對照。實驗結果如圖7所示。圖中A. No-0，Col-O生態型擬南芥原生質體瞬時過表達c-myc、ATPCl-c-myc後各自Fv/Fm的螢光成像圖及對應的數值；B. No-0, Col-O生態型擬南芥原生質體瞬時過表達c-myc、ATPCl-c-myc後各自OPSII的螢光成像圖及對應的數值；A-B，螢光成像圖為六組重複取兩組，對應的數值為六組重複取平均值，**/ ^ O. 01;
test ο實驗結果顯示在這兩個生態型擬南芥的原生質體中瞬時過表達ATPCl-c-myc後，相比對照，原生質體的Fv/Fm與ΦPSII均比對照高(圖7A，7B)，與轉化瞬時過表達ATPCI-GFP的原生質體一致。四、光合作用相關功能基因的快速篩選
根據已有研究的報導DTT處理葉盤，會使其NPQ顯著下降(Bilger et al.，1989;Kalituho et al.，2007)。用濃度遞增的DTT溶液((TlO mM)處理擬南芥葉盤和原生質體，也獲得了一致的結果。由於DTT是一種還原型物質，且能打開蛋白質的二硫鍵，推論擬南芥的NPQ，OPSII可能受氧化還原作用的調控，進一步推論NPQ，OPSII可能會受葉綠體氧化還原系統的調控。擬南芥葉綠體氧化還原系統中硫氧還蛋白(TRXs)被分為7組(2f, llh, 4m, 2o,lx,2y和lz),其中5組4m, 2f, lx, 2y和Iz被認為是質體/葉綠體定位的硫氧還蛋白(Gelhaye et al. , 2005; Meyer et al. , 2005; Arsova et al. , 2010)。葉綠體中起主要調節作用的硫氧還蛋白是TRX m和f，它們通過受鐵氧還蛋白硫氧還蛋白還原酶(FTR)介導，受還原型鐵氧還蛋白(Fd)激活(Gelhaye et al. , 2005; Meyer et al. , 2005;Schurmann and Buchanan, 2008; Arsova et al. , 2010)。在原生質體中瞬時過表達了 4個TRX m和2個TRX f，測定葉綠素螢光參數。進而篩查了其上遊的FTR和Fd，研究這些基因是否參與光合作用光反應中心的氧化還原調控。實驗方法
DTT處理擬南芥葉肉細胞原生質體
配製6個梯度為0、2、10、20、40、100 mM的DTT溶液，將其分別加入96孔板中，每孔10μι。隨後，在各孔中加入原生質體90 μ ,混合均勻，使原生質體溶液中DTT的終濃度分別為:0,0. 2、1、2、4、10 mMoDTT處理擬南芥葉盤 用2 mM MES溶液配製6個梯度為0、0. 2、1、2、4、10 mM的DTT液。用直徑為6 mm的打孔器從四周齡的擬南芥葉片上打下葉盤，迅速放入配置好的DTT溶液中，暗處理20 min。處理完後，用去離子水洗去葉盤表面殘留的DTT，在Imaging-PAM的測量板上鋪好葉盤，暗適應10 min,測定葉綠素突光。雷射掃描共聚焦顯微鏡拍攝
目的基因在原生質體中瞬時表達後，收集原生質體，用雷射掃描共聚焦顯微鏡(LeicaTCS SP5 A0BS)進行觀察，並用Leica Microsystem LAS AF軟體顯示與輸出圖像。GFP和葉綠素自發螢光(chi)使用488 nm波長的雷射激發，使用500-530 nm收集GFP信號，用650-750 nm收集葉綠素自發螢光。所有的螢光觀察實驗至少獨立重複三次。DTT分別處理野生型擬南芥葉盤和原生質體後葉綠素螢光參數的比較 配製6個濃度梯度的DTT溶液，分別為:0、0.2、1、2、4、10 mM。將擬南芥葉盤浸泡在DTT溶液中20 min後，取出葉盤，用水洗去葉盤表面的DTT。暗適應後測定葉綠素螢光參數，實驗結果如圖8所示，圖中，A用不同濃度(0、0.2、1、2、4and 10 mM)的DTT溶液處理擬南芥葉盤所測得的葉綠素螢光參數ΦΡΞΙΙ的螢光成像圖和對應的數值；B 1/4 NPQ的螢光成像圖和對應的數值；C用不同濃度(0、0. 2、1、2、4 and 10mM)的DTT溶液處理擬南芥葉肉細胞原生質體所測得的葉綠素螢光參數ΦΡΞΙΙ的螢光成像圖和對應的數值；D 1/4 NPQ的螢光成像圖和對應的數值；螢光成像圖為六組重複取一組，對應的數值為六組重複取平均值。由實驗數據發現葉盤的NPQ會顯著降低，ΦΡ3ΙΙ會顯著升高(圖8A，B)。用同樣濃度梯度的DTT處理原生質體後測葉綠素螢光參數，發現原生質體的NPQ也會隨著DTT濃度的升高而降低，OPSII則隨著DTT濃度的升高而升高(圖8 C，D)。TRX ml、TRX m2、TRX m3、TRX m4_GFP瞬時過表達後葉綠素螢光參數分析 為了研究擬南芥葉綠體中起主要調節作用的硫氧還蛋白是否參與調控NPQ和OPSII，
先分別在擬南芥葉肉細胞原生質體中瞬時過表達了 4個m類的硫氧還蛋白(TRX ml-GFP,TRX m2-GFP, TRX m3_GFP和TRX m4_GFP)，測定過表達原生質體的葉綠素螢光，檢測它們是否會造成原生質體的葉綠素螢光參數OPSII和NPQ發生改變。實驗結果如圖9所示，圖中 A.瞬時過表達 GFP、TRX ml-GFP、TRX m2_GFP、TRX m3_GFP、TRX m4_GFP 後，原生質體葉綠素螢光參數OPSII的螢光成像圖及其對應的數值；B.瞬時過表達GFP、TRX ml-GFP,TRXm2-GFP、TRX m3_GFP、TRX m4_GFP後，原生質體葉綠素螢光參數NPQ的螢光成像圖及其對應的數值;A-B，螢光成像圖為六組重複取三組，對應的數值為六組重複取平均值。
經過6次以上生物學重複，實驗結果表明儘管可以通過螢光顯微鏡檢測到4個m類硫氧還蛋白與GFP融合蛋白表達後的螢光，也就是說這四個蛋白能在原生質體中表達。但是，他們在原生質體中分別瞬時過表達後均沒有顯著改變原生質體的葉綠素螢光參數(圖 9)。TRX H、TRX f2_GFP瞬時過表達後葉綠素螢光參數分析
瞬時過表達m類硫氧還蛋白後測量原生質體的葉 綠素螢光參數，發現它們過表達後葉綠素螢光參數沒有發生顯著改變。在此基礎上，為了了解另一類主要的硫氧還蛋白f類的硫氧還蛋白是否會通過氧化還原作用影響原生質體的葉綠素螢光參數OPSII和NPQ，在擬南芥葉肉細胞原生質體中瞬時過表達2個f類的硫氧還蛋白(TRX fl-GFP和TRX f2_GFP)，測定過表達後原生質體的葉綠素螢光。實驗結果如圖10所示，圖中，A.瞬時過表達GFP和TRX Π-GFP後，原生質體葉綠素螢光參數ΦΡΞΙΙ的螢光成像圖及其對應的數值；Β.瞬時過表達GFP和TRX fl-GFP後，原生質體葉綠素螢光參數NPQ的螢光成像圖及其對應的數值；C.瞬時過表達GFP和TRX f2-GFP後，原生質體葉綠素螢光參數ΦΡΞΙΙ的螢光成像圖及其對應的數值；D.瞬時過表達GFP和TRX f2-GFP後，原生質體葉綠素螢光參數NPQ的螢光成像圖及其對應的數值；E. Western blot檢測瞬時表達的TRX fl-GFP, TRX f2_GFP，GFP蛋白，上半部分是用抗GFP的多克隆兔抗的免疫印跡，下半部分是CBB染色的PVDF膜，RbcL是核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶的大亞基;A-D，螢光成像圖為六組重複取三組，對應的數值為六組重複取平均值，*/7 ( O. 05, **/7 O. 01; i-testo結果表明，瞬時過表達TRX Π-GFP和TRX f2_GFP後，原生質體葉綠素螢光參數ΦΡε Ι和NPQ與DTT處理後發生改變的趨勢一致。相比過表達GFP的對照，過表達TRXfl-GFP, TRX f2-GFP的原生質體其ΦΡ3ΙΙ有所升高(圖10A、C)，NPQ有所降低(圖10B、D)。為了證明原生質體葉綠素螢光參數OPSII升高是由TRX f過表達引起，首先將35S-.TRX fl-GFP融合質粒DNA的量設置4個梯度5、10、15和20 μ g，轉化原生質體。在100 μ 原生質體體系中，當35S: TRX fI-GFP的量低於10 Pg時，轉化效率很低，只能檢測到很少量的TRX fl-GFP蛋白，與對照即轉化20 μg質粒的原生質體相比，它們的OPSII幾乎一致。當轉化15或20 Pg質粒時，原生質體的Φ PSII顯著高於對照(圖11A)。對於擬南芥葉肉細胞原生質體瞬時表達系統，100 μ 原生質體的體系中，20 Pg質粒轉化2 X IO4個原生質體的轉化效果通常為最好。為了進一步證實TRX f在原生質體中瞬時過表達會造成原生質體OPSII增加，將融合質粒DNA的量設置另外4個梯度7. 5、15、22. 5和30 μ g，轉化原生質體。實驗結果顯示轉化22. 5 Ug質粒的原生質體，其ΦΡ3ΙΙ最高，轉化15和30 Ug質粒的原生質體，其ΦΡ3ΙΙ都有所降低(圖11B)。收集已測定葉綠素螢光參數的原生質體，提取蛋白，進行蛋白電泳和westernblot檢測。Western blot結果顯示用抗GFP的一抗以及相應二抗孵育後，可以檢測出GFP和TRX fl-GFP融合蛋白對應的條帶，說明它們能夠在擬南芥葉肉細胞原生質體中成功表達。結果顯示對於100 PL的原生質體體系，轉化質粒的最佳用量約為20 Pg，此時融合蛋白的表達量最高，質粒量的增加或減少都會降低轉化率。而原生質體葉綠素螢光參數◎PSII會隨著TRX fl-GFP融合蛋白表達量增加而增加(圖11C，D)。以上結果可以共同說明瞬時過表達TRX fl-GFP融合蛋白的原生質體其葉綠素螢光參數OPSII增加的確是由TRX fl蛋白過表達所造成的。Fdl-GFP, Fd2_GFP、FTRc-GFP瞬時過表達後葉綠素螢光參數分析
由於 TRX f 被 FTR 還原，FTR 被 Fd 還原(Schurmann and Buchanan, 2008),也就是說FTR和Fd處於TRX f的上遊。為了明確瞬時過表達TRX f上遊的蛋白是否會引起葉綠素螢光參數發生相同的改變，選取了兩個葉中表達的Fd :Fdl和Fd2，以及FTR的催化亞基FTRc，將它們在原生質體中瞬時過表達。實驗結果如圖12所示，圖中，A.瞬時過表達GFP，FTRc-GFP和TRX f2_GFP後，
原生質體葉綠素螢光參數OPSII的螢光成像圖及其對應的數值；B.瞬時過表達GFP，FTRc-GFP和TRX f2-GFP後，原生質體葉綠素螢光參數NPQ的螢光成像圖及其對應的數值；C.瞬時過表達GFP，Fdl-GFP, Fd2_GFP，TRX Π-GFP和TRX f2_GFP後，原生質體葉綠素螢光參數ΦΡΞΙΙ的螢光成像圖及其對應的數值；D.瞬時過表達GFP，Fdl-GFP, Fd2_GFP，TRXf I-GFP和TRX f2-GFP後，原生質體葉綠素螢光參數NPQ的螢光成像圖及其對應的數值；E.Western blot檢測瞬時表達的Fdl-GFP，Fd2_GFP，FTRc_GFP，GFP蛋白，上半部分是用抗GFP的多克隆兔抗的免疫印跡，下半部分是CBB染色的PVDF膜，RbcL是核酮糖-1，5- 二磷酸羧化酶的大亞基;A_D，螢光成像圖為六組重複取兩組，對應的數值為六組重複取平均值，
^ O. 05,林/7 ^ O. 01; i—test。結果顯示儘管過表達TRX fl-GFP，TRX f2_GFP的原生質體，其ΦΡΞΙΙ會顯著上升，NPQ會顯著下降(圖12Α，B，C，D)，卻沒有發現過表達Fdl和Fd2，以及FTRc的原生質體的葉綠素螢光參數，如NPQ或者ΦΡ3ΙΙ發生明顯地改變(圖12A，B，C，D)。ffestern-blot結果顯示，GFP，FTRc-GFP, Fdl-GFP和Fd2_GFP能夠在原生質體中正常表達(圖12E)。說明f類硫氧還蛋白通過氧化還原作用直接調控NPQ和ΦΡ5ΙΙ，由於f類硫氧還蛋白在植物體內的含量較穩定，瞬時過表達f類硫氧還蛋白的上遊基因不起作用，也存在另一種可能，即這些蛋白與GFP融合表達後散失了功能。儘管如此，利用新方法，將擬南芥葉肉細胞原生質體瞬時轉化技術與葉綠素螢光技術結合起來，所獲得的結果提示TRX fl和TRX f2可能是氧化還原調控NPQ和OPSII的兩個潛在硫氧還蛋白。Fdl、Fd2、FTRc、TRX fl、TRX f2 的亞細胞定位
為了確保葉綠素螢光參數發生改變的原因是外源基因的瞬時過表達，必須要有檢測目的基因已經發生了過表達的方法，比如，通過western blot，用抗GFP的抗體檢測目的基因與GFP融合蛋白的表達。還可以利用螢光顯微鏡觀察目的基因與GFP融合蛋白的螢光，瞬時轉化TRX fl-GFP, TRX f2_GFP，FTRc_GFP，Fdl-GFP，Fd2_GFP，用雷射共聚焦顯微鏡可以檢測到這5個基因成功表達，且定位在葉綠體中(圖13)。可見，本發明方法可以很好地應用於光合作用的研究。基於上述實驗，可以明確地預見,將反義RNA轉入原生質體中，使原生質體中的正常表達基因瞬時沉默，同樣可以應用於光合作用的研究。
權利要求
1.一種研究光合作用相關功能基因的方法，包括如下步驟 1)製備含有葉綠體的原生質體，並將待測基因和/或反義核酸序列轉入原生質體並確認待測基因可瞬時表達和/或反義核酸序列已使基因表達瞬時沉默； 2)將轉入有待測基因和/或反義核酸序列的原生質體和對照原生質體進行暗適應處理； 3)將暗適應處理的原生質體進行光照處理，獲取其螢光圖像和/或螢光參數，或基於螢光圖像和/或螢光參數繪製葉綠素螢光誘導動力學曲線和/或光誘導曲線； 4)對比不同處理組的螢光圖像、螢光參數、葉綠素螢光誘導動力學曲線、光誘導曲線中的至少一種，判斷待測基因和/或反義核酸序列對光合作用的影響，確定其是否為光合作用相關基因。
2.根據權利要求I所述的方法，其特徵在於轉入原生質體的待測基因和/或反義核酸序列至少為一種。
3.根據權利要求I或2所述的方法，其特徵在於暗適應處理的時間為8 12min。
4.根據權利要求I或2所述的方法，其特徵在於測定葉綠素螢光誘導動力學曲線和快速光響應曲線的程序為 1)打開不足以使原生質體進行光合作用的微弱測量光，測得最小螢光Ftl； 2)隨後施加一個飽和脈衝，關閉所有的電子門，暫時抑制植物的光合作用，得到最大螢光Fm; 3)打開光化光，使原生質體光合作用，施加飽和脈衝後，得到的葉綠素螢光為光化光下最大突光Fm』 ； 4)待飽和脈衝處理後，葉綠素螢光值達到穩態之後，關閉光化光，同時打開遠紅光，使電子門回到開放態，F回到最小螢光Ftl附近，此時得到的螢光為Ftl'
5.根據權利要求I或2所述的方法，其特徵在於原生質體為擬南芥葉肉細胞原生質體。
全文摘要
本發明公開了結合葉綠素螢光技術和原生質體系統研究光合作用的方法及其應用。通過在原生質體中瞬時表達或沉默一個或多個基因，之後利用調製葉綠素螢光成像儀測定擬南芥葉肉細胞原生質體葉綠素螢光變化，並對其圖像進行對比，可以快速、高通量地篩選出與光合作用相關的基因。
文檔編號C12Q1/68GK102758018SQ201210265108
公開日2012年10月31日 申請日期2012年7月27日 優先權日2012年7月27日
發明者馮冬茹, 劉兵, 段珊, 王宏斌, 王金髮, 蘇建斌 申請人:中山大學