一種口蹄疫基因工程混合表位疫苗及其製備方法
2023-05-28 18:30:31
專利名稱：一種口蹄疫基因工程混合表位疫苗及其製備方法
技術領域：
本發明屬於獸藥技術領域，涉及一種口蹄疫基因工程混合表位疫苗及其製備方法，一種免疫增強型O型口蹄疫基因工程混合表位疫苗及其製備方法。
背景技術：
口蹄疫(Foot-and-Mouth Disease,FMD)是一種嚴重危害偶蹄動物的病毒性疫病，被世界動物衛生組織(OIE)列為必須通報的烈性傳染病，中國將其列為一類動物傳染病。該病主要侵染豬、牛、羊等偶蹄動物，傳播途徑多、傳播速度快，曾多次在世界範圍發生大流行。 FMD的致病因子是口蹄疫病毒(FMDV)，歸屬於小RNA病毒科(Picornaviridae)的口蹄疫病毒屬(Aphthovirus)。FMDV有七個血清型，分別為O、A、C、Asia1、SAT1、SAT2、SAT3，每個血清型又可產生很多基因亞型，也因流行區域而分為很多的拓撲型；不同血清型之間無交叉保護反應，同一血清型的不同譜系病毒之間的交叉免疫保護性也有差異，因而經常需要根據流行毒與疫苗毒株的抗原關係分析，來確定用於預防流行毒株的適宜的疫苗毒株。FMDV核酸分子為單股正鏈的RNA分子，基因組全長約8500個鹼基，只含有一個大的開放閱讀框，表達產生的聚蛋白逐級裂解產生病毒的結構蛋白(VP1、VP2、VP3、VP4)和非結構蛋白(Lab，2A、2B、2C、3A、3B、3C、3D)，結構蛋白組裝產生病毒的衣殼結構，非結構蛋白則參與病毒與宿主的相互作用、抑制宿主細胞的轉錄翻譯機制、參與病毒的複製過程。病毒衣殼蛋白是誘導產生中和抗體的主要免疫原，在結構蛋白上存在多個構象性的與線性的中和表位。早期通過單克隆抗體與免疫逃逸突變株的序列分析研究表明，在O型FMDV至少存在5個功能獨立的中和性抗原表位，組成抗原位點的區段主要包括VPl的G-H環以及其C端胺基酸，VP2的31，70 73，75和77位胺基酸，VPlB-C環的43和44位點胺基酸；VP3的58位胺基酸，VPl 149位胺基酸等參與構成五個中和表位。這5個中和表位除了由VPlG-H環構成的位點I為線性表位外，其餘均為構象表位。利用合成肽免疫實驗動物和牛的試驗似乎證明位點I是最優勢的抗原表位，但是有的試驗結果顯示疫苗免疫後針對位點2的抗體應答水平高於位點I ;其中針對G-H環位點的免疫顯然是最重要的，因為不同血清型病毒，在G-H環附近的變異幅度最大，而且G-H環是病毒結合細胞受體的部位。VPlG-H環也是研製口蹄疫表位肽疫苗的主要基因對象，但是單獨合成G-H環研製表位肽疫苗並不能誘導免疫動物產生有效的保護性免疫應答，還需要有T細胞表位的參與才能誘導產生較好的保護性免疫應答。T細胞表位對於誘導產生更高水平的中和抗體、儘早的清除病毒具有重要的作用，有學者綜合分析了不同血清型病毒抗原位點區域的差異，結果顯示B-細胞與T-細胞抗原位點區域顯示出很明顯的血清型特徵，已經發現在FMDV的結構蛋白以及非結構蛋白3A與3D上均存在T-細胞表位，有些T-細胞表位在血清型間比較保守，有些在毒株之間差異較大；其中VP4，VPl，3A，3D蛋白中均含有保守的T細胞表位，這些表位可能更易被宿主細胞表達的MHC分子識別，因而在分子疫苗設計中受到更多的關注。現在使用的口蹄疫疫苗主要為全病毒抗原滅活疫苗，在疫苗的製造過程中需要動用活病毒，因而，需要達到生物安全三級標準的GMP生產車間來防止病毒的擴散。同時、高效疫苗的生產過程中，要對病毒抗原進行濃縮，因而疫苗的生產與製備成本較高。基因工程疫苗的研製與應用，將為解決這些問題提供方法。目前，已經有合成肽疫苗被批准用於豬口蹄疫的免疫預防，美國也核准了口蹄疫病毒基因重組腺病毒活載體疫苗新獸藥註冊申請，說明未來口蹄疫基因工程疫苗替代傳統滅活疫苗將是一種趨勢。基因工程疫苗的應用也有助口蹄疫感染動物與疫苗免疫動物的鑑別診斷。
發明內容
本發明的目的是克服現有技術的缺陷，提供一種口蹄疫基因工程混合表位疫苗及 其製備方法，利用該方法製備的BI與TI混合表位疫苗免疫豬，能夠產生同等或優於全病毒滅活疫苗的保護性免疫效果，而且對三個譜系的病毒都具有交叉保護作用，是一種新型的免疫增強型O型口蹄疫基因工程混合表位疫苗。其技術方案為一種口蹄疫基因工程混合表位疫苗，由四部分組成，由中國型(Cathay)、泛亞、緬甸98三個譜系O型口蹄疫病毒主要中和性抗原表位組成的串聯B細胞表位重組蛋白BI，其基因序列為SEQ ID NO :1，胺基酸序列為SEQ ID NO :2 ;由通用T細胞表位與多個口蹄疫病毒特異性T細胞表位串聯組成的T細胞表位重組蛋白TI，其基因序列為SEQ ID N0:3，胺基酸序列為SEQ ID NO :4 ;添加Toll樣受體3激動劑-聚肌苷酸-聚胞苷酸〔Polyinosinic :polycytidylic acid, Poly (1: C)〕和 / 或 Toll 樣受體 7/8 劑動劑-R848 為免疫增強劑；201油佐劑。進一步，對於免疫豬，所述疫苗的用量為仔豬lmL，成年豬2mL每頭份，耳後部深部肌肉注射。本發明口蹄疫基因工程混合表位疫苗的製備方法，重組B與T細胞表位免疫原均可通過末端融合的6-組氨酸標籤進行親合層析純化，純化的B1、TI免疫原與Poly(1:C)分別按終濃度400，300與300 μ g/mL配製於磷酸鹽緩衝液，然後按體積比1:1加入201油佐劑進行乳化製備成疫苗。本發明的有益效果豬體免疫試驗結果顯示，與口蹄疫O型傳統滅活疫苗相比單獨BI油佐劑疫苗在免疫後產生較高水平的中和抗體，BI免疫原添加Poly(I = C)後中和抗體的水平顯著高於未免疫組與滅活疫苗免疫組(P < 0.01);同時，BI免疫原加入TI與Poly(I = C)後，中和抗體的應答水平更加均勻，個體差異縮小，而且對不同譜系病毒的交叉中和作用也有明顯提高((P < 0. 05));再用1000個豬半數感染量(PID50)的0/Mya/98系豬體適應毒攻擊後，BI+Poly(1:C)與BI+TI+Poly(1:C)組豬均可完全抵抗強毒攻擊，攻毒後10天內無一頭豬表現出臨床症狀；而BI單獨免疫組與滅活苗免疫組分別有2頭與3頭豬表現臨床症狀；對照組五頭豬於攻毒後5天內全部發病。說明BI抗原是一種很好的B細胞免疫原，添加TI和Poly(1:C)能夠誘導免疫豬產生保護性的免疫應答，其對豬的免疫保護作用優於滅活疫苗，因而，是一種新型的免疫增強型口蹄疫混合表位疫苗。
圖1為BI抗原的表達與純化SDS-PAGE電泳分析圖.其中，M為分子質量標準，I為誘導表達產物，2為誘導前對照，3 5顯示在洗脫緩衝液D、E和F中的純化蛋白.；圖2為TI抗原的表達與純化SDS-PAGE電泳分析圖，其中M為分子質量標準，I為為誘導前對照，2與3為誘導表達產物，4與5為在洗脫緩衝液E中的純化蛋白。
具體實施例方式下面結合附圖具體實施例來詳細描述本發明的技術方案。材料與方法B細胞免疫原BI的設計與表達 根據國內外O型口蹄疫流行病學信息，設計併合成了 B細胞免疫原基因BI，所含有的O型口蹄疫病毒中和抗原表位序列如下表I所示，將表I中的胺基酸序列按下列順序進行排列組合PADRE-GG-(0/HN/CHA/09)VPl 132-160-GG-VP1 193-211-GG-(0/Tibet/99)VPl132-160-GG-(0/IRN/2010) VPl 193-211-GG-VPl 132-160-GG-(0/Mya98)VP1132-160-GG-VP1 193-211-GG-1nvasin_6 XHis，各表位之間以兩個甘氨酸相連，最後加6組氨酸標籤序列，有利於表達蛋白的純化。設計好的序列交由南京GenScript公司進行編碼序列的優化與合成，兩端分別加入啟始密碼子與終止密碼子，並加入Nco I與Hind III酶切位點，合成的核苷酸序列為SEQ ID NO.1，其蛋白序列為SEQ ID NO. 2 表1. B細胞免疫原基因BI中的表位序列組成
權利要求
1.一種口蹄疫基因工程混合表位疫苗，其特徵在於，由四部分組成，由中國型(Cathay)、泛亞、緬甸98三個譜系O型口蹄疫病毒主要中和性抗原表位組成的串聯B細胞表位重組蛋白BI，其基因序列為SEQ ID NO :1，胺基酸序列為SEQ ID NO 2 ;由通用T細胞表位與多個口蹄疫病毒特異性T細胞表位串聯組成的T細胞表位重組蛋白TI，其基因序列為SEQ IDNO :3，胺基酸序列為SEQ ID NO 4 ;添加Toll樣受體3激動劑-聚肌苷酸-聚胞苷酸和/或Toll樣受體7/8劑動劑-R848為免疫增強劑；201油佐劑。
2.根據權利要求1所述的口蹄疫基因工程混合表位疫苗，其特徵在於，對於免疫豬，所述疫苗的用量為仔豬lmL，成年豬2mL每頭份，耳後部深部肌肉注射。
3.根據權利要求1所述口蹄疫基因工程混合表位疫苗的製備方法，其特徵在於，重組B與T細胞表位免疫原均可通過末端融合的6-組氨酸標籤進行親合層析純化，純化的B1、TI免疫原與Poly (1: C)分別按終濃度400，300與300 μ g/mL配製於磷酸鹽緩衝液，然後按體積比1:1加入201油佐劑進行乳化製備成疫苗。
全文摘要
本發明公開了一種口蹄疫病毒混合表位疫苗及其製備方法，該疫苗由四部分組成，由中國型、泛亞、緬甸98三個譜系O型口蹄疫病毒主要中和性抗原表位組成的串聯B細胞表位重組蛋白BI，其基因序列為SEQ ID NO1，胺基酸序列為SEQ ID NO2；由通用T細胞表位與多個口蹄疫病毒特異性T細胞表位串聯組成的T細胞表位重組蛋白TI，其基因序列為SEQ ID NO3，胺基酸序列為SEQID NO4；添加Toll樣受體3激動劑-聚肌苷酸-聚胞苷酸和/或Toll樣受體7/8劑動劑-R848為免疫增強劑；201油佐劑。利用該方法製備的BI與TI混合表位疫苗免疫豬，能夠產生同等或優於全病毒滅活疫苗的保護性免疫效果，而且對三個譜系的病毒都具有交叉保護作用，是一種新型的免疫增強型O型口蹄疫基因工程混合表位疫苗。
文檔編號A61P31/14GK103007273SQ201210480120
公開日2013年4月3日 申請日期2012年11月16日 優先權日2012年11月16日
發明者盧曾軍, 劉在新, 曹軼梅, 孫普, 李冬, 包慧芳, 李平花, 付元芳, 陳白興文, 應理, 謝寶霞 申請人:中國農業科學院蘭州獸醫研究所