誘導肉蓯蓉種子產生愈傷組織並分化出芽的方法
2023-05-29 08:19:36
專利名稱：誘導肉蓯蓉種子產生愈傷組織並分化出芽的方法
技術領域：
本發明屬於生物技術領域，特別涉及一種誘導肉蓯蓉種子產生愈傷組織並分化出芽的方法。
背景技術：
傳統的中藥材80％為野生資源，由於生態環境的惡化和人們對野生資源的盲目採集，從天然野生植物中提取次生代謝產物的方式受到了挑戰。通過植物組織和細胞培養來產生次生代謝產物是解決這一問題的一個較好的方法，目前已有紫草、人參根、青蒿、毛地黃等達到中試和工業化規模(Curtin M E，Biotechnology，1983，1，649-657)。通過愈傷組織分化出芽，再進行分生組織培養和快速無性繁殖，可以為植物的生長繁殖提供充足的種苗。目前快繁技術已用於一些苗木的大規模商業化生產，如蘭花、百合、香石竹、香蕉等(李寶健等，植物生物技術原理與方法，1990，343-350)肉蓯蓉(Cistanche deserticola Y.C.Ma)為列當科肉蓯蓉，屬多年生高等寄生植物，主要產於我國以及伊朗、蒙古、印度等國，生長於鹽鹼地、幹河溝沙地和戈壁灘一帶，寄生在梭梭、白梭梭和檉柳屬植物的根上。肉蓯蓉味甘鹹微辛酸、微溫，在《神農百草經》中列為上品，具有補中、入肝、益精、滋腎、壯陽等功效(中國藥科大學，中藥辭海-第一卷，1993，2098-2101)。長期以來，肉蓯蓉來源於民間採挖，由於沒有科學管理，濫採亂挖現象十分嚴重，肉蓯蓉寄主梭梭等毀壞嚴重，破壞了自然生態環境，加速了土地沙漠化，形勢十分嚴峻。而肉蓯蓉的人工栽培雖已試驗成功，但受寄主植物的數量、分布與根系發育等條件的影響，大量發展尚有一定困難。因此迫切需要開發肉蓯蓉的組織和細胞培養技術，使肉蓯蓉在工業條件下大量分裂繁殖，累積野生植物的藥物成分，以滿足國內外日益增長的需要，並杜絕無節制的濫採亂挖現象。
由於肉蓯蓉是寄生植物，其種子的萌發機理具有一定的特殊性。肉蓯蓉的種子具有一個近球形胚，這種近球形胚只在寄主梭梭根穿入種子內之後才能被刺激萌發。這種萌發的啟動與寄主中某些細胞表面存在的化學因素的「識別」有關，而寄主梭梭根含有某些類似激素類物質刺激「芽管狀器官」的形成(李天然等，內蒙古大學學報-自然科學報版，1989，20，395-400)。自然環境中，肉蓯蓉的萌發和生長必須要有寄主的存在，因此受到自然條件的限制，而且栽培期長(3-5年)，人工養育困難，因此人工栽培有一定的局限性(鄭興國等，新疆林業，2001，2，29-30)；目前有用激素處理肉蓯蓉種子，以提高肉蓯蓉種子愈傷組織發生率的報導，但一般來說，如果僅用激素處理，肉蓯蓉種子愈傷組織的發生頻率較低，僅為12％(吳新等，西北藥學雜誌，1998，13，103-104)。
在肉蓯蓉種子的愈傷組織誘導培養中藥克服肉蓯蓉對寄主的依賴而使之萌發，通過查新，目前尚未見有通過高溫處理寄主植物種子使之愈傷組織的報導。
發明內容
本發明的目的提供一種誘導肉蓯蓉種子產生愈傷組織並分化出芽的方法，通過誘導傷愈組織分化發芽，使肉蓯蓉擺脫寄主的限制，由寄主轉至自養，從而實現人工培養，達到規模生產的目的。
本發明的實施方案如下本發明提供的誘導肉蓯蓉種子產生愈傷組織並分化出芽的方法，其特徵在於，其步驟如下1.將肉蓯蓉種子於30-70℃下進行熱處理10-200分鐘，消毒後接種到0.1-10mg/L 2，4-D的MS培養基上進行誘導培養；或者接種到0.1-10mg/L KT的MS培養基上進行誘導培養；或者接種到0.1-10mg/L 2，4-D與KT的MS混合培養基上進行誘導培養，誘導培養天數為30天；2.將培養30天後產生的肉蓯蓉傷愈組織轉接到含0.1-5mg/L 6-BA的B5細胞分裂素的固體培養基上繼代培養；或者轉接到含0.1-5g/L GA3的B5細胞分裂素的固體培養基上繼代培養；或者轉接到含0.1-5mg/L 6-BA與GA3的B5細胞分裂素的固體混合培養基上繼代培養，繼代培養次數為2-20次；步驟1)中對肉蓯蓉種子進行熱處理的溫度以40-60℃為佳，熱處理時間以30-120分鐘為佳；步驟1)中對肉蓯蓉種子進行誘導培養所使用的激素濃度或混合激素的濃度以0.3-5mg/L為佳；步驟2)中對肉蓯蓉傷愈組織繼代培養所使用的細胞分裂素或所使用的混合細胞分裂素的固體培養基濃度以0.3-3mg/L為佳；步驟2)所述的繼代培養次數以5-8次為佳。
肉蓯蓉是寄主植物，因此誘導肉蓯蓉種子產生傷愈組織有一定困難，經過研究發現，高溫處理對肉蓯蓉種子有強烈的刺激作用，植物細胞被提高或稱熱休克時，植物會暫時合成一些新的蛋白質，稱為熱休克蛋白；熱休克蛋白可能會刺激植物內一些酶的產生，誘導相關生長激素的活性，從而誘導傷愈組織的形成。細胞分裂素和赤黴素(GA3)是植物生長過程中重要的調節因子，主要用於促進細胞分裂，誘導組織分化等。通過改變它們在B5培養基中的組份和濃度，並經過多次繼代培養，可以有效地促進傷愈組織的分化出芽。
肉蓯蓉種子經過熱處理後，需經表面消毒才能接種；在MS培養基中加入激素後一起滅菌，或者將激素通過除塵過濾器加入培養基中，每一種單一的激素適宜的濃度範圍有所差別；肉蓯蓉種子愈傷組織的誘導時間一般為30天；肉蓯蓉愈傷組織誘導分化出芽培養的繼代2-20次，並以繼代5-8次為較佳。
本發明提供的誘導肉蓯蓉種子產生愈傷組織並分化出芽的方法，利用熱處理對寄生植物肉蓯蓉種子的激活作用以及激素2，4-D和KT的協同作用，克服肉蓯蓉種子萌發對寄主的依賴性，從而達到提高肉蓯蓉種子愈傷組織發生率的目的；並利用赤黴素和細胞分裂素6-BA促進細胞分裂和誘導組織分化的作用，從而達到愈傷組織分化出芽的目的。
具體實施例方式
實施例1將肉蓯蓉種子於40℃下進行熱處理60分鐘，消毒後接種到5mg/L2，4-D與KT的MS混合培養基上培養，30天後傷愈組織發生率為25％；將培養30天後的肉蓯蓉愈傷組織轉接到含3mg/L 6-BA與GA3細胞分裂素的B5固體混合培養基上進行繼代培養5次後，分化出芽率為45％。
實施例2將肉蓯蓉種子於30℃下進行熱處理120分鐘，消毒後接種到4mg/L2，4-D與KT的MS混合培養基上培養，30天後傷愈組織發生率為15％；將培養30天後的肉蓯蓉愈傷組織轉接到含2mg/L 6-BA與GA3細胞分裂素的B5固體混合培養基上進行繼代培養6次後，分化出芽率為33％。
實施例3將肉蓯蓉種子於50℃下進行熱處理80分鐘，消毒後接種到3mg/L2，4-D與KT的MS混合培養基上培養，30天後傷愈組織發生率為15％；將培養30天後的肉蓯蓉愈傷組織轉接到含1mg/L 6-BA與GA3細胞分裂素的B5固體混合培養基上進行繼代培養8次後，分化出芽率為33％。
實施例4將肉蓯蓉種子於70℃下進行熱處理70分鐘，消毒後接種到0.5mg/L 2，4-D的MS培養基上培養，30天後傷愈組織發生率為20％；將培養30天後的肉蓯蓉愈傷組織轉接到含0.5mg/L 6-BA B5培養基上進行繼代培養10次後，分化出芽率分別為30％。
實施例5將肉蓯蓉種子於70℃下進行熱處理10分鐘，消毒後接種到9mg/L2，4-D的MS培養基上培養，30天後傷愈組織發生率為15％；將培養30天後的肉蓯蓉愈傷組織轉接到含2.5mg/L 6-BA B5培養基上進行繼代培養18次後，分化出芽率分別為29％。
實施例6將肉蓯蓉種子於70℃下進行熱處理40分鐘，消毒後接種到0.8mg/L2，4-D的MS培養基上培養，30天後傷愈組織發生率為21％；將培養30天後的肉蓯蓉愈傷組織轉接到含0.3mg/L 6-BA B5培養基上進行繼代培養15次後，分化出芽率分別為30％。
實施例7將肉蓯蓉種子於65℃下進行熱處理40分鐘，消毒後接種到0.8mg/L2，4-D的MS培養基上培養，30天後傷愈組織發生率為15％；將培養30天後的肉蓯蓉愈傷組織轉接到含0.8mg/L 6-BA B5培養基上進行繼代培養10次後，分化出芽率分別為28％。
實施例8將肉蓯蓉種子於55℃下進行熱處理50分鐘，消毒後接種到0.9mg/L2，4-D的MS培養基上培養，30天後傷愈組織發生率為20％；將培養30天後的肉蓯蓉愈傷組織轉接到含0.9mg/L 6-BA B5培養基上進行繼代培養4次後，分化出芽率分別為25％。
實施例9將肉蓯蓉種子於50℃下進行熱處理110分鐘，消毒後接種到5mg/L2，4-D的MS培養基上培養，30天後傷愈組織發生率為25％；將培養30天後的肉蓯蓉愈傷組織轉接到含3mg/L 6-BA B5培養基上進行繼代培養8次後，分化出芽率分別為33％。
實施例10將肉蓯蓉種子於60℃下進行熱處理60-120分鐘，消毒後接種到0.1-5mg/L 2，4-D的MS培養基上培養，30天後傷愈組織發生率為15％；將培養30天後的肉蓯蓉愈傷組織轉接到含0.3-3mg/L 6-BA B5培養基上進行繼代培養2-20次後，分化出芽率分別為33％。
權利要求
1.一種誘導肉蓯蓉種子產生愈傷組織並分化出芽的方法，其特徵在於，步驟如下1)將肉蓯蓉種子於30-70℃下進行熱處理10-200分鐘，消毒後接種到0.1-5mg/L 2，4-D的MS培養基上進行誘導培養；或者接種到0.1-5mg/L KT的MS培養基上進行誘導培養；或者接種到0.1-5mg/L 2，4-D和0.1-5mg/L KT的MS混合培養基上進行誘導培養，誘導培養天數為30天；2)將培養30天後產生的肉蓯蓉傷愈組織轉接到含0.3-3mg/L 6-BA的B5細胞分裂素的固體培養基上繼代培養；或者轉接到含0.3-3mg/L GA3的B5細胞分裂素的固體培養基上繼代培養；或者轉接到含0.3-3mg/L 6-BA和0.3-3mg/L GA3的B5細胞分裂素的固體混合培養基上繼代培養，繼代培養次數為2-20次。
2.按權利要求1所述的誘導肉蓯蓉種子產生愈傷組織並分化出芽的方法，其特徵在於所述熱處理溫度為40-50℃，熱處理時間為30-60分鐘。
3.按權利要求1中所述的誘導肉蓯蓉種子產生愈傷組織並分化出芽的方法，其特徵在於步驟1)中對肉蓯蓉種子進行誘導培養所使用的激素濃度或混合激素的濃度為0.1-10mg/L。
4.按權利要求1中所述的誘導肉蓯蓉種子產生愈傷組織並分化出芽的方法，其特徵在於步驟1)中對肉蓯蓉種子進行誘導培養所使用的激素濃度或混合激素的濃度mg/L。
5.按權利要求1中所述的誘導肉蓯蓉種子產生愈傷組織並分化出芽的方法，其特徵在於步驟2)中對肉蓯蓉傷愈組織繼代培養所使用的細胞分裂素或混合細胞分裂素的固體培養基濃度為0.1-10mg/L。
6.按權利要求1中所述的誘導肉蓯蓉種子產生愈傷組織並分化出芽的方法，其特徵在於步驟2)中對肉蓯蓉傷愈組織繼代培養所使用的細胞分裂素或混合細胞分裂素的固體培養基濃度為0.3-5mg/L。
7.按權利要求1中所述的誘導肉蓯蓉種子產生愈傷組織並分化出芽的方法，其特徵在於步驟2)所述的繼代培養次數為5-8次。
全文摘要
本發明涉及的誘導肉蓯蓉種子產生愈傷組織並分化出芽的方法，步驟為1)將肉蓯蓉種子先進行熱處理，消毒後接種到2，4－D的MS培養基、KT的MS培養基或者接種到二者的混合培養基上進行誘導培養，誘導培養；2)將誘培養後產生的肉蓯蓉傷愈組織轉接到6－BA的B
文檔編號A01H4/00GK1457632SQ0211765
公開日2003年11月26日 申請日期2002年5月14日 優先權日2002年5月14日
發明者歐陽傑, 王曉東, 王玉春, 趙兵 申請人:中國科學院過程工程研究所