白喉毒素的製備的製作方法

2023-05-28 16:54:01 4

專利名稱：白喉毒素的製備的製作方法
技術領域：
本發明涉及用於製備白喉毒素的細菌生長培養基以及白喉毒素的製備方法。
背景技術：
白喉是由白喉棒桿菌(Corynebacterium diphtheriae)感染引起的一種危及生命的疾病，白喉棒桿菌是革蘭氏陽性、需氧、棒狀的細菌。疾病是由白喉棒桿菌的產毒素菌株對鼻咽組織局部侵襲引起的。生物在覆蓋疼痛、出血和壞死病灶的粗糙的纖維蛋白膜內生長，所述膜可能位於扁桃體或鼻咽區域內。在以往的典型流行期間，疾病的傳播是通過飛沫傳染。除非用抗生素進行強有力的治療，否則恢復的白喉病人在其喉部和鼻咽可能攜帶產毒細菌數周或數月。
白喉的多數臨床症狀是由攜帶tox基因的棒桿菌原噬菌體產生的強白喉毒素引起的。在原噬菌體感染白喉棒桿菌後，發生溶原化，菌株變成毒性菌株。由白喉毒素的非毒性形式(類毒素)的活性免疫誘導產生的毒素中和抗體(抗毒素)能預防白喉。目前的免疫策略是利用白喉疫苗，白喉疫苗是通過用甲醛處理將白喉毒素轉換成非毒性、但具有抗原性的類毒素形式製備的。在世界範圍內，白喉類毒素用於與其他疫苗組分的各種組合來進行大規模免疫。世界衛生組織(WorldHealth Organization)(WHO)最近估計，世界範圍內每年大約有100,000病例和最多8,000例死亡是由於嬰兒免疫的減少、成人對白喉免疫的降低以及疫苗的供應不足。
白喉棒桿菌的Parke Williams 8(PW8)株變體常被用來產生外毒素，由此通過化學修飾來製備類毒素。通常，含有胺基酸、痕量維生素、無機鹽以及碳水化合物源如麥芽糖的培養基製劑促進細菌的良好生長。不同的培養基，如酪蛋白的酸消化產物以及牛肌肉的酶消化產物(胰蛋白酶或木瓜蛋白酶)是毒素製備的合適培養基。在常規的方法中，細菌培養在含有動物來源的蛋白性物質的培養基中。白喉生產的常用培養基是NZ-Amine Type A培養基，其含有酪蛋白消化產物。在合適的條件下，使用絮凝限量方法，用NZ-Amine Type A培養基製備的毒素量是180Lf/mL。(參考文獻1-3，在本申請中，各參考文獻均在括號中引用來更充分描述本發明所屬的現有技術狀態。各參考文獻的全部著錄信息列於本說明書之後權利要求之前。各參考文獻的公開內容均以引用的形式併入本公開內容)。
動物來源的蛋白性材料的使用導致在用培養基製備的白喉毒素中引入不希望的汙染物。
El Kholy等1967(Ref.4)將從黃羽扇豆(Lupinus luteus)的發芽種子製備的營養培養基(大豆提取物)用於白喉棒桿菌生長的培養基。儘管細菌在其中生長良好，但是白喉類毒素的產生卻是最小限度的。El Kholy和Karamya(1979)(Ref.5)得出結論，大豆提取物中的皂苷會抑制毒素的產生。Taha和Kholy(1985)(Ref.6)對大豆先高壓滅菌，再用沸水連續提取，以得到產生毒素的水性提取物，所得毒素的Lf值與對照(肉湯)相當，推測原因可能是蒸汽高壓滅菌破壞了三種胰蛋白酶抑制劑以及連續的煮沸降低了提取物中的皂苷含量。大豆食品在pH4.6的酸提取導致產生具有與對照(肉湯)的Lf值比得上的Lf值的提取物，因為在此pH皂苷和胰蛋白酶抑制劑的提取量均有限。
Wolfe等的2000年8月31日公布，並轉讓給NYCOMEDIMAGING AS的國際專利申請WO00/50449中描述了製備白喉毒素的培養基和方法。WO00/50449中所述的所有培養基均含有酪蛋白胺基酸，其通過乳蛋白酪蛋白的酸水解得到。因此，WO00/50449中所述的所有培養基均含有動物來源的蛋白性材料。
Oliveri等的1998年12月3日公布，並轉讓給Chiron S.P.A.的國際專利申請WO98/541296中描述了製備白喉毒素的含有Soytone的培養基。
已描述了無毒，且常被稱作CRM(交叉反應材料)的白喉毒素的類似物(參見例如Ref7)。實例有CRM-197、CRM-9、CRM-45、CRM-102、CRM-103和CRM-107。
仍然需要基本上不含或完全不含動物成分的細菌生長培養基用於白喉棒桿菌的培養以及白喉毒素及其類似物的製備。
發明概述本發明涉及製備白喉毒素及其類似物的生長培養基及其方法。
在本發明的第一方面，提供了製備白喉毒素或其類似物的培養基，其中培養基基本不含有動物來源的產物並含有水、碳水化合物源以及氮源，還含有起始濃度的大量游離胺基酸，其中每種游離胺基酸的起始濃度不會限制白喉毒素或其類似物的產生水平。培養基可含有所有天然存在的胺基酸，碳水化合物源可包含麥芽糖，且培養基可不含有葡萄糖。氮源可含有酵母提取物。培養基可完全不含有動物源性產物。
在本發明的第二方面，提供了白喉棒桿菌的培養基，其含有碳水化合物源、氮源以及含有至少四種游離胺基酸的添加劑系統，其每一種的量足以促進白喉棒桿菌產生一定水平的白喉毒素或其類似物，其中所述培養基基本不含有動物來源的產物。培養基可含有所有天然存在的胺基酸，碳水化合物源可以是麥芽糖。氮源可以是酵母提取物。合適的胺基酸濃度範圍是每升培養基約0.5g-約1g。培養基可完全不含有動物源性產物。
在本發明的第三方面，提供了製備白喉毒素或其類似物的方法，其包括在本文所提供的任何培養基中培養白喉棒桿菌的步驟。白喉棒桿菌菌株生長直至穩定期，且可獲得至少100Lf/mL白喉毒素或其類似物的生產。回收白喉毒素或其類似物，將其純化並去毒以得到白喉類毒素，後者可製備成疫苗用於免疫宿主，以免於其患由白喉棒桿菌感染引起的疾病。
在另一方面，本發明延伸到免疫宿主以免於其患由白喉棒桿菌感染引起的疾病的方法，其包括給宿主施用此處描述的疫苗。從而，此處提供的疫苗可用於免疫宿主以免於其患由白喉棒桿菌感染引起的疾病，此處提供的白喉類毒素可用於製備免疫宿主以免於其患由白喉棒桿菌感染引起的疾病的製劑。
在另一方面，本發明提供了一種組合物，其含有此處提供的白喉棒桿菌菌株及培養基。
在另一方面，本發明提供了一種製備白喉毒素或其類似物的方法，其包括在培養基中生長白喉棒桿菌培養物並給培養物提供至少一種被選胺基酸以防止被選胺基酸的濃度限制毒素(或其類似物)的產生，其中所述培養基基本不含有動物來源的產物。培養基可進一步含有酵母提取物，其濃度為例如約3g/L。
在另一方面，本發明提供了一種對在培養基中培養白喉棒桿菌的培養方法的改進，所述培養基含有用於製備一定生產水平的白喉毒素或其類似物的胺基酸，並且在培養過程中其中至少一種被選胺基酸被耗盡並限制白喉毒素或其類似物的生產水平，所述改進包括在所述培養過程中外源添加額外量的至少一種被選胺基酸，並且其中至少一種被選胺基酸不限制白喉毒素或其類似物的生產水平。至少一種被選胺基酸選自Glu、Asn、Ser、His、Gly、Thr、Met、Trp和異亮氨酸。
附圖簡述本發明通過參考附圖的如下說明將得到進一步闡釋，其中

圖1是顯示通過酵母提取物胺基酸互作效應導致的毒素產量中的變量互作效應；圖2是用含有動物成分及不含動物成分的培養基製備的白喉毒素及類毒素的SDS-PAGE分析；圖3是用含有動物成分及不含動物成分的培養基製備的白喉毒素及類毒素的蛋白印跡分析；圖4是用含有動物成分及不含動物成分的培養基製備的白喉毒素及類毒素的等電凝膠分析；圖5是用含有動物成分及不含動物成分的培養基製備的白喉毒素的圓二色性分析；圖6是用含有動物成分及不含動物成分的培養基製備的白喉類毒素的圓二色性分析；以及圖7是用含有動物成分及不含動物成分的培養基在200L規模製備的白喉類毒素的圓二色性分析。
發明詳述不含勸物成分的胺基酸培養基的配製NZ Amine是胺基酸和肽的來源，其由酶消化酪蛋白製備。它是氨基氮(游離胺基酸)和有機氮(肽)兩者的良好來源。製備白喉類毒素的白喉棒桿菌培養基中的胺基酸和肽的另一個來源是動物來源的Toxiprotone-D。這些培養基的組成在表和如下顯示含有NZ Amine的培養基的組成表1.含有NZ Amine的培養基的組成
表2.生長因子溶液的組成
表3.含有Toxiprotone的培養基的組成
不含動物成分的胺基酸培養基的配製在胺基酸培養基製備中，方法是在含有Toxiprotone-D和NZ-Amine動物成分的培養基中選擇更高濃度(nM)的每種胺基酸以製備能支持白喉棒桿菌生長和毒素產生的培養基。
白喉棒桿菌生長在含有NZ-Amine的培養基中。在發酵過程中在不同的時間間隔(24、30和41小時)鑑定幾種消耗的胺基酸(表4)。
表4通過HPLC確定的在含有Toxiprotone-D動物成分(Toxiprotone-D)和NZ-Amine動物成分的培養基中胺基酸的組成以及使用NZ Amine培養基發酵過程中胺基酸的消耗。
胺基酸濃度以mM表示。
通過使胺基酸消耗和毒素產生之間相互關聯，發酵實驗用以下含有胺基酸Asn、Glu、Ser、His、Gly、Thr、Met、Trp、Iso和Leu的培養基進行。
表5.含有胺基酸Asn、Glu、Ser、His、Gly、Thr、Met、Trp、Iso和Leu的生長培養基的組成
然而，僅用這些少量胺基酸不會引起細胞生長或毒素產生。
設計一種含有所有天然存在的胺基酸的培養基(CDM)。所有這些胺基酸都是非動物來源的。該培養基的組成如下表6所示。
表6不含動物成分的培養基CDM的組成
使用含有NZ amine或Toxiprotone的培養基以20L規模進行的白喉棒桿菌菌株的發酵批次的對比分析使用含有NZ amine的培養基的發酵在第一次預培養中，將親液種子從親液種子繁殖到Loefflers斜面，培養物在所述斜面在36±2℃生長22±2小時。在第二次預培養中，22±2小時的培養後，將細胞從斜面轉移到100mL的NZ amine培養基的原代燒瓶中並在36±2℃於180rpm下培養22小時。燒瓶還包含1mL的1∶10稀釋的磷酸鹽溶液(32％(w/v))和0.5mL的1∶2稀釋的氯化鈣溶液(53％(w/v))。在第三次預培養中，將約5mL的原代培養物從100mL的原代搖瓶中取出並接種到250mL的NZ Amine培養基，然後在36±2℃於180rpm下培養22小時。培養物中還包含2.5mL的1∶10稀釋的磷酸鹽溶液(32％(w/v))和1.25mL的1∶2稀釋的氯化鈣溶液(53％(w/v))。在發酵中，將15mL的第三次預培養物接種至發酵罐中15 L NZ Amine培養基中。培養物還包括100.7mL的0.32％(w/v)磷酸鹽溶液以及125mL的1∶2稀釋的氯化鈣溶液(53％(w/v))和23.44mL的七水合硫酸亞鐵溶液(0.1％(w/v))。發酵在36±2℃的控制溫度下、在有1個Rushton渦輪高速攪拌機的Braun Fermentor中、用600rpm的攪動、通過液面上空間進行1.57vvm的通氣下進行。經過25小時的發酵後，攪動加快至800rpm並將發酵罐加壓至0.4巴。發酵再繼續進行另外16小時。
使用含有Toxiprotone的培養基的發酵3.1.1在第一次預培養中，將親液種子從親液種子繁殖到含有5％羊血的細菌中胰蛋白瓊脂平板，並在36±2℃生長24±2小時。在第二次預培養中，將細胞從血液瓊脂平板轉移到90mL培養基的原代燒瓶中並在室溫靜止培養48小時，然後在36±2℃於180rpm下培養24小時。將約1.6mL的原代培養物從90mL的原代搖瓶中取出並接種到800mL的培養基中，在36±2℃於180rpm下培養22小時。然後將800mL的培養物接種發酵罐中的10L培養基。發酵在具有2個Rushton渦輪高速攪拌機、1個噴霧器和4個擋板的New BrunswickScientific Fermentor中進行。培養在220rpm攪動、在36±2℃以0.2vvm的通氣下進行。從發酵8小時往上直至32小時的發酵結束，用葡萄糖胺基酸溶液將pH控制在7.5-7.6。所產生的Lf/mL是80-90Lf/mL。
使用CDM培養基的發酵第一次預培養將溼的的冷凍種子(甘油原種)繁殖至CDM+5g/LYE瓊脂培養基並在36℃培養24小時。
第二次預培養將平板上的培養物重懸於5mL的CDM+3g/LYE培養基並將其中的2.5mL用於接種90mL的CDM+3g/LYE培養基的原代燒瓶。將燒瓶在200rpm的持續振蕩下，在36℃溫育24小時。原代燒瓶中還含有0.9mL的1∶10稀釋的磷酸鹽溶液(32％(w/v))和0.45mL的1∶2稀釋的氯化鈣溶液(53％(w/v))。
發酵將約800mL第三次預培養物用於接種發酵罐中的10LCDM+3g/L YE培養基。向發酵中加入100mL的1∶10稀釋的磷酸鹽溶液(32％(w/v))和50mL的1∶2稀釋的氯化鈣溶液(53％(w/v))以及3.4mL的七水合硫酸亞鐵溶液(0.1％(w/v)。發酵在NewBrunswick Scientific或B.Braun發酵罐中，在受控的溫度36℃下進行。過程參數是250rpm的攪動、0.45vvm的通氣。在發酵過程中，用5N氫氧化鈉和2.5M磷酸將pH控制在6.5-7.6。
通過絮凝方法(Lf試驗)和ELISA定量的毒素量(表7)
表7CDM中白喉棒桿菌的發酵
用CDM培養基與麥芽糖、鐵和磷酸鹽濃度的不同組合以240L的規模進行發酵。結果總結於如下的表8中表8用不含動物成分的CDM的發酵
儘管達到OD600為15-20的生長，但是所產生的毒素水平為90-100Lf/mL，該值低於使用含有動物來源的蛋白性材料如NZ amine或Phytone的培養基所得到的值。
胺基酸消耗的時間進程研究表明胺基酸如(Asp、Glu、Asn、Ser、Gln、Gly和Thr)在發酵的12小時內消耗，如20L批次所示(表9)，且在毒素表達階段則不可利用。
表9CDM培養基中胺基酸消耗的時間進程研究
這些結果表明培養基應該富含有機或無機氮。
有機和無機氮補充物的篩選發酵過程中胺基酸消耗的時間進程研究表明關鍵的胺基酸在生長的前12-18小時消耗，且在發酵的後期當毒素產生時則不可利用。培養基應當補充氮來支持生長以及將培養基中的胺基酸用作毒素合成的前體。如下所述，將酵母提取物和硫酸銨加至CDM用於白喉棒桿菌生長以及白喉毒素製備的不同培養基a)CDM+5g/L酵母提取物；b)CDM+5g/L硫酸銨；和c)含有培養基中一半濃度的胺基酸+5g/L酵母提取物和5g/L硫酸銨的改進的CDM。
在這些發酵中白喉毒素的生產如下表10所示表10補充有機和無機氮的CDM培養基中的白喉毒素生產
使用統計學設計對培養基中的不同組分進行最優化以得到更高的毒素產量使用計算機統計學設計(FusionPro)來最優化培養基組成。在設計中，三種組分(酵母提取物，胺基酸混合物和鐵)的三個不同濃度被用作統計學設計中的輸入項。選擇分數的因子設計(參見表11)，如下表11試驗設計改變酵母提取物、胺基酸和鐵濃度的量來最優化白喉棒桿菌的毒素生產
磷酸鹽和氯化鈣溶液保持為常量。
在不同條件下進行試驗，並通過ELISA對所製備的毒素的量進行定量。儘管毒素的濃度是大約150Lf/mL，但是所產生的毒素比在發酵過程中使用動物組分所得毒素要純。在鐵濃度為0.34mL/L下，酵母提取物和胺基酸量的反應圖被外推為使胺基酸混合物的濃度加倍，如圖1所示。在這種酵母提取物濃度(3g/L)和胺基酸濃度(2x)條件下，根據等值線作圖分析，毒素的量加倍。但是，在實踐中，這個並不容易實施，因為它將會提高成本以及培養基的摩爾滲透壓濃度，導致細胞死亡。
統計學設計表明，在毒素產量中有重要的變量互作效應。最重要的影響(如圖1所示)是酵母提取物-胺基酸互作效應(A*B)。酵母提取物和胺基酸對毒素產量有負效應。如果酵母提取物濃度太高(即，5g/L)，那麼該條件將支持細菌生長，但不支持毒素產生。而且，如果胺基酸濃度提高至兩倍，就可能會由於滲透壓不平衡而出現對生長不利的環境。因此，需對酵母提取物和胺基酸濃度進行最優化以製備高毒素濃度。圖5的一般回歸統計學表明R方值是0.92。這意味著所觀察到的毒素產量數據非常接近由FusionPro設計預期的毒素產量數據。
毒素的最佳量在酵母提取物濃度3g/L、1倍胺基酸濃度以及鐵濃度0.34mL/L條件下產生。
基於早期的發酵試驗以及在生長和毒素產生階段胺基酸消耗狀況，發現胺基酸Asp、Glu、Asn、Ser、Gln、Gly和Thr消耗較快，且在毒素表達階段不可利用。這些胺基酸而非所有19種胺基酸是由FusionPro外推反應曲線推定的獲得更高產量的毒素以2x濃度所需要的關鍵胺基酸。從而進行了2x濃度關鍵胺基酸(改進的CDM1+3g/L YE)對毒素合成的影響的搖瓶研究。將上述關鍵胺基酸的濃度加倍會使毒素水平(289μg/mL)與1x濃度的(157μg/mL)相比加倍，這一點支持如下假定這些胺基酸在生長期完全消耗，是毒素合成所需要的。將這些胺基酸的2x濃度條件按比例擴大至20L發酵罐，發現細胞生長很差。最優化的不含動物成分的培養基是CDM+3g/L酵母提取物，如表12所示。
表12CDM+3g/L酵母提取物的培養基組成
白喉類毒素的純化和去毒將10L發酵培養物在12,500×g，4℃下離心20分鐘，收集上清液。然後，將上清液通過0.22μm薄膜濾器過濾以除去殘餘的細菌。在4℃，持續攪拌下，將27％(w/v)的硫酸銨加入過濾後的上清液中，然後在12,500g，4℃下離心20分鐘。收集上清液用於進一步加工。持續攪拌下，將13％(w/v)的硫酸銨加入上清液。將混合物進一步在4℃攪動過夜，然後在12,500g，4℃下離心20分鐘。所得沉澱溶解在約1000mL的0.9％(w/v)的鹽水中。
將上述毒素溶液用具有10kDa盒子(cassette)的超濾單元對0.9％(w/v)鹽水進行滲濾以除去硫酸銨。存留物用0.22μm的薄膜濾器過濾，然後保存在4-8℃。在去毒之前，將存留物用0.9％(w/v)的鹽水稀釋至500 Lf/mL。白喉毒素的純度為至少75％。在室溫持續攪動下在20分鐘內將0.5％(v/v)甲醛和0.5％(w/v)碳酸氫鈉加至稀釋的毒素溶液。20分鐘後，加入溶於0.9％(w/v)鹽水中的0.913％(w/v)L-賴氨酸溶液，接著將混合物通過0.22μm的薄膜濾器過濾，然後在37℃持續振蕩下溫育6周以去毒。將類毒素保存在4-8℃。
用含有動物成分和不含動物成分的培養基製備的白喉毒素和類毒素的表徵將用含有動物成分和不含動物成分的培養基製備的白喉毒素和類毒素通過SDS-PAGE、蛋白印跡、圓二色性譜確定以及N-末端測序進行分析。結果表明用含有動物成分和不含動物成分的培養基製備的白喉毒素和類毒素基本不能區分。
總蛋白的濃度通過用二辛可寧酸(bicinchoninic acid)(BCA)進行微量培養板BCA測定及通過與濃度已知的參考標準蛋白對比而進行。
SDS PAGE進行SDS-PAGE以確定白喉毒素和類毒素的相對分子量(Mr)，從而評價毒素和類毒素的純度；以及評估蛋白帶的分布模式。蛋白通過在還原條件下在12.5％聚丙烯醯胺凝膠上的SDS-PAGE進行分析。凝膠用考馬斯藍染色，接著進行光密度分析。參考圖2，顯示了為確定白喉毒素和類毒素的相對分子量(Mr)而進行的SDS-PAGE，以評價毒素和類毒素的純度以及蛋白帶的分布模式。蛋白在還原條件下在12.5％的聚丙烯醯胺凝膠上通過SDS-PAGE進行分析。凝膠用考馬斯藍染色，接著進行光密度分析。泳道是1.MW標記物(kDa)，250，150，100，75，50，37，25，15，10kDa；2.白喉毒素，CO3105(含動物成分的培養基)；3.白喉毒素Diph-20L-40F(含動物成分的培養基)；3.白喉毒素Diph-20L-48F(CDM+含酵母提取物的培養基)；4.白喉毒素Diph-20L-50F(CDM+含酵母提取物的培養基)；5.白喉毒素Diph-20L-55F(CDM+含酵母提取物的培養基)；6.白喉類毒素CO3152；7.白喉類毒素Diph-20L-40F(含動物成分的培養基)；8.白喉類毒素Diph-20L-48F(CDM+含酵母提取物的培養基)；9.白喉類毒素Diph-20L-50F(CDM+含酵母提取物的培養基)蛋白印跡分析參考圖3，顯示了用白喉毒素特異性抗體進行的蛋白印跡分析。樣品在12.5％ SDS-PAGE凝膠上進行分辨，然後轉移到PVDF膜，並用DT特異性抗體進行印跡。泳道是1.相對分子量標記物(kDa)，250，150，100，75，50，37，25，15，10kDa；BioRad MW標記物；2.白喉毒素CO3105；3.白喉毒素Diph-20L-40F(含動物成分的培養基)；4.白喉毒素Diph-20L-48F(CDM+含酵母提取物的培養基)；5.白喉毒素Diph-20L-50F(CDM+含酵母提取物的培養基)；6.白喉毒素Diph-20L-55F(CDM+含酵母提取物的培養基)；7.白喉類毒素CO3152；8.白喉類毒素Diph-20L-40F(含動物成分的培養基)；9.白喉類毒素Diph-20L-48F(CDM+含酵母提取物的培養基)；10.白喉類毒素Diph-20L-50F(CDM+含酵母提取物的培養基)。
N-末端測序N-末端測序分析用於監控導致N-末端變化的任何蛋白修飾。將蛋白在12.5％SDS-PAGE凝膠上進行分辨，然後轉移到固體支持物如PVDF。通過傳統的Edman降解方法將N-末端胺基酸釋放並衍生化，然後通過反相高效液相色譜(RP-HPLC)進行鑑定。對於加工的對照白喉毒素和類毒素以及「不含動物」的毒素/類毒素均觀察到期望的N-末端序列。
表13白喉毒素的N-末端序列
表14白喉類毒素的N-末端序列
-缺失的序列循環是由於儀器問題等電聚焦(IEF)用參考蛋白估計白喉毒素的等電點。參考圖3，顯示等電聚焦凝膠。泳道是1.IEF stds-pI＝7.80，7.50，7.10，7.00，6.50，6.00，5.10，4.65；2.白喉毒素CO3105(含動物成分的培養基)；3.白喉毒素Diph-20L-11(含NZ Amine的培養基)；4.白喉毒素Diph-20L-31(CDM+含酵母提取物的培養基)；5.白喉毒素Diph-20L-31(CDM+含酵母提取物的培養基)；6.白喉類毒素CO3152(含動物成分的培養基)；7.白喉類毒素Diph-20L-11(CDM+含酵母提取物的培養基)；8.白喉類毒素Diph-20L-31(CDM+含酵母提取物的培養基)；9.白喉類毒素Diph-20L-31(CDM+含酵母提取物的培養基)。
圓二色性譜圓二色性(CD)分析用於確定各批次構象或二級結構的不一致性。通過軟體程序分析樣品對圓偏振光的吸收光譜，得到α-螺旋、β-摺疊、轉角和無規捲曲結構的相對百分比組成。用Jasco CD旋光分光計在22℃分析白喉毒素和類毒素。(參見圖5-7)。
N-末端測序。將蛋白在12.5％SDS-PAGE凝膠上進行分辨，然後轉移到固體支持物如PVDF。通過傳統的Edman降解方法將N-末端胺基酸釋放並衍生化，然後通過反相高效液相色譜(RP-HPLC)進行鑑定。
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權利要求
1.一種培養白喉棒桿菌菌株以製備一定水平的白喉毒素或其類似物的培養基，其中培養基基本不含有動物來源的產物，並含有a.水；b.碳水化合物源和氮源；c.起始濃度的大量游離胺基酸，其中每種游離胺基酸的起始濃度不會限制白喉毒素或其類似物的生產水平。
2.權利要求1的培養基，其含有所有天然存在的胺基酸。
3.權利要求1的培養基，其中所述碳水化合物源包含麥芽糖。
4.權利要求1的培養基，其基本不含有葡萄糖。
5.權利要求1的培養基，其中所述氮源包含酵母提取物。
6.權利要求1或2或3或4或5的培養基，其中所述培養基不含有動物來源的產物。
7.一種白喉棒桿菌的培養基，其含有碳水化合物源和氮源及含有至少四種游離胺基酸的添加劑系統，其每一種的量足以促進白喉棒桿菌產生一定水平的白喉毒素或其類似物，其中所述培養基基本不含動物來源的產物。
8.權利要求7的培養基，其含有所有天然存在的胺基酸。
9.權利要求7的培養基，其中所述碳水化合物源是麥芽糖。
10.權利要求7的培養基，其中所述氮源是酵母提取物。
11.權利要求7或8或9的培養基，其中所述胺基酸的濃度範圍是每升培養基大約0.5g-大約1g。
12.權利要求7或8或9或10或11的培養基，其中所述培養基不含動物來源的產物。
13.一種製備白喉毒素或其類似物的方法，其包含步驟在允許白喉毒素生產的條件下，在培養基中培養白喉棒桿菌菌株，其中所述培養基基本不含動物來源的產物並含有含有水；a.碳水化合物源及氮源；b.起始濃度的大量游離胺基酸，其中每種游離胺基酸的起始濃度不會限制白喉毒素或其類似物的生產水平。
14.權利要求13的方法，其中所述培養基含有所有天然存在的胺基酸。
15.權利要求13的方法，其中所述碳水化合物源包含麥芽糖。
16.權利要求13的方法，其中所述培養基基本不含有葡萄糖。
17.權利要求13的方法，其中所述氮源包含酵母提取物。
18.權利要求13的方法，其中所述白喉棒桿菌生長直至穩定期。
19.權利要求13的方法，其中獲得至少100Lf/mL的白喉毒素或其類似物生產。
20.權利要求10的方法，其進一步包括回收白喉毒素或其類似物以提供回收的白喉毒素或其類似物的步驟。
21.權利要求17的方法，其進一步包括純化回收的白喉毒素或其類似物以提供純化的白喉毒素或其類似物的步驟。
22.權利要求17或18的方法，其進一步包括使回收或純化的白喉毒素或其類似物去毒以提供白喉類毒素或其類似物的步驟。
23.權利要求19的方法，其進一步包括將白喉類毒素或其類似物配製成疫苗以免疫宿主以免於其患由白喉棒桿菌感染引起的疾病。
24.權利要求13-23任一項的方法，其中所述培養基不含動物來源的產物。
25.一種免疫宿主以免於其患由白喉棒桿菌感染引起的疾病的方法，其包括給宿主施用權利要求23的疫苗。
26.權利要求23的疫苗在免疫宿主以免於其患由白喉棒桿菌感染引起的疾病的用途。
27.權利要求22的白喉類毒素或其類似物在製備免疫宿主以免於其患由白喉棒桿菌感染引起的疾病的藥物中的用途。
28.一種組合物，其含有白喉棒桿菌菌株和用於製備白喉毒素或其類似物的培養基，其中所述培養基基本不含有動物來源的產物並含有其中所述培養基基本不含有動物來源的產物並含有含有a.水；b.碳水化合物源和氮源；c.起始濃度的大量游離胺基酸，其中每種游離胺基酸的起始濃度不會限制白喉毒素或其類似物的生產水平。
29.權利要求24的方法的組合物，其中所述培養基含有所有天然存在的胺基酸。
30.權利要求24的方法的組合物，其中所述碳水化合物源包含麥芽糖。
31.權利要求24的組合物，其中所述培養基基本不含葡萄糖。
32.權利要求24的方法的組合物，其中所述氮源包含酵母提取物。
33.權利要求21或22或23或24或25的培養基，其中所述培養基不含有動物來源的產物。
34.一種製備白喉毒素或其類似物的方法，其包括在培養基中培養白喉棒桿菌，以及給培養物提供至少一種被選的胺基酸，以防止被選胺基酸的濃度限制毒素的生產，其中培養基基本不含動物來源的產物。
35.權利要求1的方法，其中所述培養基進一步包含酵母提取物。
36.權利要求4的方法，其中所述酵母提取物的濃度大約是3g/L。胺基酸的濃度。
37.在培養基中培養白喉棒桿菌的培養方法，所述培養基含有用於製備一定生產水平的白喉毒素或其類似物的胺基酸，並且在培養過程中其中至少一種被選胺基酸被耗盡並限制白喉毒素或其類似物的生產水平，所述改進包括在所述培養過程中外源添加額外量的至少一種被選胺基酸，並且其中所述至少一種被選胺基酸不限制白喉毒素或其類似物的生產水平。
38.權利要求33的方法，其中所述至少一種被選胺基酸選自Glu、Asn、Ser、His、Gly、Thr、Met、Trp和異亮氨酸。
39.權利要求33的方法，其中所述培養基含有酵母提取物。
40.權利要求35的方法，其中所述酵母提取物的濃度大約為3g/L。
全文摘要
提供了用於製備白喉毒素的白喉棒桿菌(Corynebacterium diphtheriae)培養基以及製備毒素的方法。培養基基本不含有動物來源的產物並含有水、碳水化合物源、氮源以及起始濃度的大量游離胺基酸，其中每種游離胺基酸的起始濃度不會限制毒素的生產。
文檔編號A61P31/00GK1894399SQ200480037069
公開日2007年1月10日 申請日期2004年11月30日 優先權日2003年12月12日
發明者T·李, X·餘 申請人:聖諾菲·帕斯圖爾有限公司