一種低敏性的乳清蛋白水解物及其製備方法

2023-05-29 11:57:01 1

專利名稱：：一種低敏性的乳清蛋白水解物及其製備方法
技術領域：
：本發明屬於食品生物工程領域，具體地說涉及一種乳清蛋白水解物及其製備方法。
背景技術：
：牛乳過敏是一種過敏性疾病。可分為速髮型超敏反應和遲髮型超敏反應兩種類型；其臨床症狀表現為皮膚為過敏性皮炎，呼吸系統為鼻炎、哮喘，消化器官為下痢、嘔吐。這些症狀可能單獨或合併發生，嚴重時也可能表現為全身性過敏，甚至過敏性休克。研究表明，在嬰幼兒中乳蛋白過敏的發生率大約是26%(HillDJ等.PediatrAllergyandImmunology,1997，8(supl.8)，21-26。HoskingCS等.AllergyandClinicalImmunologyInternational,2000，12(5)，198-205);此外，約3%的成年人經歷過對乳製品過敏(BennettL.等.AustralianJournalofDairyTechnology,2001(56):126)。在中國，牛乳過敏問題一直沒有引起足夠的重視，有關牛乳過敏的統計資料報導較少。在我國，治療嬰幼兒牛乳過敏常採取的方法為停用牛乳製品、改用代乳品、服用特定的藥物。但是這些治療手段都是暫時性的，而且容易造成嬰幼兒的營養不良。眾所周知，牛乳是優質的營養食品，幾乎含有人體所必需的全部胺基酸，而且是鈣和磷的良好來源。因此，開發低敏性或無過敏性的牛乳製品是解決牛乳過敏問題的有效途徑。牛乳過敏主要是由牛乳中存在的乳清蛋白引起的，其中P-乳球蛋白(P-lg)和a-乳白蛋白(a-la)是牛乳中最主要的過敏原(VanBeresteijnECH等，JournalofFoodProtection,1994，57(7)，619-625.EnaJM等.JournalofFoodScience,1995，60(1)，104-116.HattoriM等.JournalofAgricutumlandFoodChemistry,2000，48(6),2050-2056)。這兩種蛋白存在許多過敏表位，可以通過破壞或降解過敏表位來降低乳清蛋白的抗原性(SeloI等.ClinicalandExperimentalAllergy,1999，29(8)，1055-1063.AdamsSL等.ImmunologyCellBiology,1991，69，191-197.MaynardF等.IntArchivesofAllergyandImmunology,1997，113，478-488.Jarvi腦KM等.InternationalArchivesofAllergyandImmunology,2001，126，111-118)。目前，破壞或降解乳清蛋白過敏表位的主要有熱處理和蛋白酶降解兩種方法(l)熱處理方法，加熱能引起乳清蛋白的變性，生成聚合物，從而掩蓋了抗原表位，降低了牛乳的過敏性(SvenningC.等，InternationalDairyJournal,2000，10(10)，699-711)。但是熱處理會影響牛乳的營養和感官特性，並產生一定的蒸煮味。(2)蛋白酶降解方法，利用蛋白酶解破壞過敏表位，可以降低乳清蛋白引起的過敏性(NakamuraT等，AnimalScienceandTechnology,1992,63(8)，814-817。MaynardF.等，IntArchivesofAllergyandImmunology,1997，113，478-488;WroblewskaB.等，InternationalJournalofFoodScienceandTechnology,2004，39:839-850)。此外，酶解方法還可產生具有調節免疫功能、抗凝血、降血壓等其他生理功能的活性肽，並且水解後的小分子物質更有利於嬰兒腸道吸收。國外現有一些低敏性的牛乳水解產品，如雀巢公司生產的三種分別名為BebaHA，GoodStart和NANHA的部分水解配方奶粉、日本明治乳業株式會社生產的乳清蛋白水解配方奶粉Nobiyaka。但是它們都是用單一的酶生產的。經檢索，沒有發現採用複合酶生產低敏性的乳清蛋白製品的報導。
發明內容本發明的第一個目的是提供一種低敏性的乳清蛋白水解物。本發明的另一目的是提供上述低敏性的乳清蛋白水解物的製備方法。為實現上述目的，本發明採用的技術方案為本發明一種低敏性的乳清蛋白水解物，按照如下方法製備(1)按照58%的重量比將濃縮乳清蛋白溶於水中，然後在85。C90。C加熱1015min，再降溫至45t:5(rC，得乳清蛋白溶液；(2)將乳清蛋白溶液的pH值調至7.58.0;按照0.080.1%的重量比加入複合蛋白酶，然後在溫度為5055'C、pH值為7.58.0條件下水解23h，再在90。C10(TC保持1015min，得乳清蛋白水解溶液；(3)通過陰陽離子交換樹脂將乳清蛋白水解溶液進行脫鹽，乾燥，得到本發明低敏性的乳清蛋白水解物。上述乳清蛋白水解物步驟(1)中所述的濃縮乳清蛋白可從市場上購買，如美國產的濃縮乳清蛋白WPC-8000等。上述乳清蛋白水解物步驟(1)中所述的將濃縮乳清蛋白溶於水中，可在磁力攪拌器上攪拌均勻，使之充分溶解。上述乳清蛋白水解物步驟(2)中所述的複合蛋白酶由鹼性蛋白酶、木瓜蛋白酶和風味蛋白酶組成，它們之間的組成比例為1:11.5:11.5。上述乳清蛋白水解物步驟(2)中pH值的調節可用lmol/LNaOH或HCl進行調解。上述乳清蛋白水解物步驟(2)中所述的水解可在水浴振蕩器上進行。上述低敏性的乳清蛋白水解物的製備方法，包括如下步驟(1)按照58%的重量比將濃縮乳清蛋白溶於水中，然後在85。C90。C加熱1015min，再降溫至45'C5(TC，得乳清蛋白溶液；(2)將乳清蛋白溶液的pH值調至7.58.0;按照0.080.1%的重量比加入複合蛋白酶，然後在溫度為5055"C、pH值為7.58.0條件下水解23h，再在90。C100。C保持1015min，得乳清蛋白水解溶液；(3)通過陰陽離子交換樹脂將乳清蛋白水解溶液進行脫鹽，乾燥，即得本發明低敏性的乳清蛋白水解物。上述製備方法步驟(1)中所述的濃縮乳清蛋白可從市場上購買，如美國產的濃縮乳清蛋白WPC-8000。上述製備方法步驟(1)中所述的將濃縮乳清蛋白溶於水中，可在磁力攪拌器上攪拌均勻，使之充分溶解。上述製備方法步驟(2)中所述的複合蛋白酶由鹼性蛋白酶、木瓜蛋白酶和風味蛋白酶組成，它們之間的組成比例為l:11.5:11.5。上述製備方法步驟(2)中pH值的調節可用lmol/LNaOH或HCl進行調解。上述製備方法步驟(2)中所述的水解可在水浴振蕩器上進行。本發明具有的優點和有益效果(1)、本發明乳清蛋白水解物的P-乳球蛋白和a-乳白蛋白的抑制率高，所得乳清蛋白的水解產物的(3-lg抑制率可達84%，a-la抑制率可達95。/。；(2)、本發明乳清蛋白水解物能夠明顯降低或消除牛乳過敏反應；(3)、本發明產物還能產生其他生物活性物質，除降低過敏性外，同時還具有免疫促進、易消化吸收及降血壓等功能；(4)、本發明乳清蛋白水解物其安全性高、無副作用；(5)、本發明乳清蛋白水解物無苦味和其它不良風味。圖1乳清蛋白水解物電泳圖1為cx-乳白蛋白和P-乳球蛋白的混合標樣；2為低分子量標準蛋白;3為本發明乳清蛋白水解物。圖2.乳清蛋白及乳清蛋白複合酶解物HPLC色譜圖圖2A乳清蛋白圖2B乳清蛋白水解物具體實施方式實施例1:'低敏性的乳清蛋白水解物的製備稱取8g濃縮乳清蛋白(WPC-8000)溶於100ml水中，於磁力攪拌器上使其充分溶解，在85'C加熱15min使蛋白變性，降溫至45"C;用lmol/LNaOH或HC1將乳清蛋白溶液的pH值調至7.5，接著加入O.lg複合蛋白酶(複合蛋白酶的組成成分及其比例為鹼性蛋白酶、木瓜蛋白酶、風味蛋白酶比例為l:1:1)，並在恆溫水浴振蕩器中55°C、pH7.5條件下水解3h;然後在9(TC保持15min使酶失活。然後將乳清蛋白水解物以50r/min的流速過陽離子交換樹脂柱脫鹽，流速用衡流泵控制，收集流出液，乾燥後得到低敏性的乳清蛋白水解物6.5g。實施例2低敏性的乳清蛋白水解物的製備稱取6g濃縮乳清蛋白(WPC-8000)溶於120ml水中，於磁力攪拌器上使其充分溶解，在9(TC加熱10min使蛋白變性，降溫至48。C;用lmol/LNaOH或HC1將乳清蛋白溶液的pH值調至7.6，接著加入0.096g複合蛋白酶(複合蛋白酶的組成成分及其比例為鹼性蛋白酶、木瓜蛋白酶、風味蛋白酶比例為l:1.2:1)，並在恆溫水浴振蕩器中52°C、pH7.6條件下水解2h;然後在9(TC保持15min使酶失活。然後將乳清蛋白水解物以50r/min的流速過陽離子交換樹脂柱脫鹽，流速用衡流泵控制，收集流出液，乾燥後得到低敏性的乳清蛋白水解物5.0g。實施例3低敏性的乳清蛋白水解物的製備稱取3g濃縮乳清蛋白(WPC-8000)溶於50ml水中，於磁力攪拌器上使其充分溶解，在85i:加熱15min使蛋白變性，降溫至45°C;用lmol/LNaOH或HCl將乳清蛋白溶液的pH值調至7.8，接著加入0.045g複合蛋白酶(複合蛋白酶的組成成分及其比例為鹼性蛋白酶、木瓜蛋白酶、風味蛋白酶比例為1:1:1.5)，並在恆溫水浴振蕩器中50°C、pH7.8條件下水解3h;然後在IO(TC保持10min使酶失活。然後將乳清蛋白水解物以50r/min的流速過陽離子交換樹脂柱脫鹽，流速用衡流泵控制，收集流出液，乾燥後得到低敏性的乳清蛋白水解物2.5g。試驗實施例1本發明乳清蛋白水解物抗原抑制率的測定利用間接競爭ELISA法測定水解物抗原抑制率，具體步驟如下(1)抗原包被以a-LA(或p-LG)作為抗原，用包被液稀釋，加入到96(8x12)孔酶標板，每孔100(iL，4"C包被過夜。(2)抗原和一抗反應在反應管中加入實施例1所得乳清蛋白水解物樣品和等體積一定稀釋度的抗血清。另設不加抗原或樣品的反應管作為無競爭體系，4'C冰箱過夜。(3)洗滌次日傾去孔內的液體，PBST洗滌4次，每孔250pL，每次3min，並間歇搖動，於乾淨吸水紙上拍幹。(4)封閉用1%BSA封閉液進行封閉，每孔100|iL，37°Clh，PBST洗滌4次，拍幹。(5)加樣將步驟(2)中樣品和一抗的混合物加入到酶標板中，每孔100pL，保鮮膜覆蓋37"C孵育lh。PBST洗滌4次，拍幹。(6)加酶標二抗加入封閉液稀釋的羊抗兔IgG-辣根過氧化物酶(HRP)標記物，每孔100pL，37r反應lh，PBST洗滌4次，拍幹。(7)顯色加新鮮配製的TMB底物溶液100^1/孔，37'C暗處反應10min，顯示藍色。(8)終止反應每孔加入2mol/LH2S045(HiL以中止反應，顏色變為黃色。(9)比色用酶標檢測儀雙波長測定各孔的OD450禾nOD630值，OD=OD450-OD630。(10)數據處理間接競爭ELISA中被測物和包被抗原競爭與抗體結合，因此包被抗原與抗體生成複合物的量與被測物中抗原量成反比。被測物的抗原性大小可用抗原抑制率表示，按下式計算抗原抑制率(％)=B/Bqx100%其中B表示各被測樣的A值，Bo為無競爭體系的A值。抑制率與被測物的抗原量成反比。測定結果首先經方陣滴定法優化出ELISA最佳反應條件oc-LA包被濃度為2ng/ml，對應抗血清稀釋度為1:128000，酶標二抗的稀釋度為1:10000;p-LG包被濃度為0.5|ig/ml，對應抗血清稀釋度為l:6400，酶標二抗的稀釋度為l:10000;兩種蛋白的抗原抗體反應均為37。Clh。利用確定出的最佳反應條件測定乳清蛋白酶解物的抗原抑制率，結果(見表l)本發明乳清蛋白水解物中a-LA和P-LG的抑制率高，說明它們明顯受到抑制。表1.乳清蛋白複合酶解物a-LA和P-LG抑制率formulaseeoriginaldocumentpage8試驗實施例2乳清蛋白水解物苦味值的評定稱取奎啉0.1g溶於50mL5。/。乙醇溶液中，從中取5ml溶液用蒸餾水稀釋到100ml，得到1.0xl0、/ml奎啉溶液，再進一步稀釋成5xl0—5、2.5xl(T5、lx10—5、5xio"g/ml等濃度奎啉溶液，其苦味值分別定為IO、5、2.5、1、0.5，將實施例1製得的乳清蛋白水解物與不同濃度奎啉溶液比較，從而確定乳清蛋白水解物的苦味值。經品嘗可知，實施例l所得乳清蛋白水解物基本沒有苦味，因此確定本發明乳清蛋白水解物苦味值為0。說明利用本發明的酶解方法能夠很好地控制，沒有苦味即其他不良風味。試驗實施例3乳清蛋白水解物電泳檢測電泳條件如下凝膠濃度分別為緻密膠16.5%，夾層膠10%，濃縮膠4%，灌膠前，各種丙烯醯胺溶液分別加入10nL過硫酸銨和l(iLTEMED，隨即灌膠，先灌入緻密膠，再覆蓋夾層膠，最後鋪濃縮膠。凝膠配製方法(見表2)，各層膠添加量各層膠添加量濃縮膠1.4mL，夾層膠l.lmL，緻密膠2.2mL;電流強度為恆流20mA，電泳時間為3h左右，當溴酚藍前沿距離玻璃板底部0.5cm時結束電泳。電泳結束後，用0.1%的考馬斯亮藍R250染色30min，然後脫色至背景透明無色，用去離子水漂洗、保存電泳凝膠版。表2.tableseeoriginaldocumentpage9結果(見圖1)乳清蛋白水解物的分子量主要集中在30006000Da，酶解產物中P-乳球蛋白還有少量剩餘，而oi-乳白蛋白已經基本被水解完全。試驗實施例4乳清蛋白水解物的高效液相色譜分析方法如下色譜條件色譜柱DiamonsilRP-d8色譜柱(5[imx250mmx4.6mm);流動相A:0.1。/。的TFA水溶液，B:0.09%的TFA乙腈溶液；梯度條件流動相B保持10%lmin，在9min內從10%上升到20%，然後在5min內從20%上升到25%，在5min內由25%上升到40%，再在5min內由40%上升到45°/。，再在3min內從45°/。上升到51%，在8min內由51%上升到59%，在2min內由59%上升到70%，在2min內從70%上升到80%，在5min內從80%上升到90%，再在5min內從90°/。下降到30%，在20min內由30%下降到10%;流速0.5mL/min;檢測器二極體陣列檢測器；檢測波長280nm;柱溫25°C;樣品乳清蛋白和實施例l乳清蛋白水解物進樣量10|iL。結果(見圖2)a-乳白蛋白和P-乳球蛋白在複合蛋白酶的作用下生成許多多肽物質，酶解結束時整個水解過程產生了16種主要的多肽物質，這些短肽易消化吸收，且a-LA和p-LG己經大部分被水解，所以其抗原性降低。權利要求1.一種低敏性的乳清蛋白水解物，其特徵在於按照如下方法製備(1)按照5～8％的重量比將濃縮乳清蛋白溶於水中，然後在85℃～90℃加熱10～15min，再降溫至45℃～50℃，得乳清蛋白溶液；(2)將乳清蛋白溶液的pH值調至7.5～8.0；按照0.08～0.1％的重量比加入複合蛋白酶，然後在溫度為50～55℃、pH值為7.5～8.0條件下水解2～3h，再在90℃～100℃保持10～15min，得乳清蛋白水解溶液；(3)通過陰陽離子交換樹脂將乳清蛋白水解溶液進行脫鹽，乾燥，得到本發明低敏性的乳清蛋白水解物。2、按照權利要求l所述的乳清蛋白水解物，其特徵在於其步驟(2)中所述的複合蛋白酶由鹼性蛋白酶、木瓜蛋白酶和風味蛋白酶組成。3、按照權利要求2所述的乳清蛋白水解物，其特徵在於所述的複合蛋白酶中鹼性蛋白酶、木瓜蛋白酶和風味蛋白酶之間的比例為1:11.5:11.5。4、按照權利要求13任一所述的乳清蛋白水解物，其特徵在於其步驟(1)中所述的濃縮乳清蛋白是濃縮乳清蛋白WPC-8000。5、權利要求l所述的低敏性的乳清蛋白水解物的製備方法，其特徵在於包括如下步驟(1)按照58%的重量比將濃縮乳清蛋白溶於水中，然後在85T:9(TC加熱1015min，再降溫至45。C50。C，得乳清蛋白溶液；(2)將乳清蛋白溶液的pH值調至7.58.0;按照0.080.1%的重量比加入複合蛋白酶，然後在溫度為5055°C、pH值為7.58.0條件下水解23h，再在90'C10(TC保持1015min，得乳清蛋白水解溶液；(3)通過陰陽離子交換樹脂將乳清蛋白水解溶液進行脫鹽，乾燥，即得本發明低敏性的乳清蛋白水解物。6、按照權利要求5所述的製備方法，其特徵在於其步驟(2)中所述的複合蛋白酶由鹼性蛋白酶、木瓜蛋白酶和風味蛋白酶組成。7、按照權利要求6所述的製備方法，其特徵在於所述的複合蛋白酶中鹼性蛋白酶、木瓜蛋白酶和風味蛋白酶之間的比例為1:11.5:11.5。8、按照權利要求57任一所述的製備方法，其特徵在於其步驟(1)所述的濃縮乳清蛋白是濃縮乳清蛋白WPC-8000。全文摘要本發明公開了一種低敏性的乳清蛋白水解物及其製備方法，主要是將濃縮乳清蛋白在水中溶解，然後在高溫下變性，接著利用由鹼性蛋白酶、木瓜蛋白酶和風味蛋白酶組成的複合蛋白酶進行水解，再將乳清蛋白水解溶液進行脫鹽、乾燥即可得本發明乳清蛋白水解物。本發明乳清蛋白水解物β-乳球蛋白和α-乳白蛋白的抑制率高，可降低或消除牛乳過敏反應；其次，還能產生其他活性物質，因而還具有免疫促進、易消化吸收和降血壓功能；本發明安全性高、無副作用；並且無苦味和其他不良風味。文檔編號A23J3/00GK101297674SQ20081010344公開日2008年11月5日申請日期2008年4月3日優先權日2008年4月3日發明者布冠好,羅永康,海鄭申請人:中國農業大學