複合誘變篩選獲得高效轉化DHEA為3β,7α,15α-三羥基雄甾-5-烯-17-酮菌株的製作方法
2023-05-29 11:58:46 2
專利名稱：複合誘變篩選獲得高效轉化DHEA為3β,7α,15α-三羥基雄甾-5-烯-17-酮菌株的製作方法
技術領域：
本發明涉及通過複合誘變亞麻刺盤孢得到高轉化轉化DHEA為3β，7α，15α -三羥基雄留-5-烯-17-酮突變菌株的方法，屬於生物工程中發酵技術領域。
背景技術：
去氫表雄酮(DHEA)是自然界生物體內重要的活性物質，對生命的代謝活動具有重要的調節作用，其衍生物3 β，7 α，15 α -三羥基雄甾_5_烯_17_酮是第四代口服避孕藥屈羅酮的前體化合物，具有高效、低毒、無副作用等優勢，同時還具備非避孕臨床益處，如控制體重、改善膚質等。目前，屈螺酮為全球銷量第一的女用口服避孕藥，全球年銷售額達14. 5億歐元，故3β，7α，15 α -三羥基雄甾_5_烯_17_酮作為其醫藥中間體，應用前景十分看好。傳統合成屈羅酮的方法是以醋酸去氫表雄酮為底物，通過18步的化學反應合成，其特點是需要高溫高壓、設備投資大、產品收率低成本高，且後期產品回收純化工藝複雜繁瑣、對環境不友好等。近些年來，隨著生物技術的迅猛發展，生物轉化法由於具備反應條件溫和，安全低耗易操作、轉化率相對較高且環境友好等特點而吸引了眾多國內外研究者。但是也存在著微生物轉化效率不高、底物投料濃度低、轉化反應專一性差，副產物較多和提取過程中有機溶劑使用量大造成環境汙染等缺點。這些不足之處直接成為3 β，7 α，15 α -三羥基雄留-5-烯-17-酮工業生產中的瓶頸，因此解決這些問題，是留體工業大規模工業化的關鍵。複合誘變包括兩種或多種誘變劑的先後使用、同一種誘變劑的重複使用、兩種或多種誘變劑的同時使用。由於複合誘變與單因素誘變相比具有獨特的優勢，因此在誘變育種中較多使用。紫外誘變是目前普遍採用的傳統誘變方法，它的誘變機理主要是它引起DNA的變化引起的。由於DNA強烈吸收紫外線，尤其是它鏈上的鹼基，紫外線引起DNA結構變化的形式很多，如DNA鏈的斷裂、DNA分子內和分子間的交聯、核酸與蛋白質的交聯及嘧啶產生兩類化合物，即水合物和二聚體。二聚體大多數為胸腺嘧啶二聚體Τ=Τ，但也有T=C和C=C 二聚體，其中T=T的形成是改變DNA生物活性的重要原因。氮離子注入是指用能量為10 1000 keV量級的氮離子束入射到真菌中去，入射離子逐漸損失能量，最後停留在材料中，與生物的相互作用不僅有物理的和化學的，而且還會引起強烈的生物效應，從而促使生物產生各種變異。N-離子注入過程中與生物體產生複雜的物理、化學和生物學效應。注入的離子通過動量傳遞、質量沉積、動能沉積和電荷交換效應聯合作用而 對遺傳物質產生直接或間接的損傷，同時生物體內各種修復機制被激活，對損傷進行修復，在修復過程中可能出錯或者損傷超過了生物體的修復能力，就會引起突變和致死，突變就可能被穩定遺傳下來。由於其在微生物誘變中的高效性，它正在得到越來越廣泛的使用。
本發明通過紫外線和氮離子注入複合誘變，獲得底物投料濃度高、轉化率高、副產物較少的菌株，為微生物轉化留體藥物工業化提供了基礎。
發明內容
本發明的發明人通過對實驗室原有菌株Iini進行複合誘變,獲得一株轉化效率高、副產物少的突變株，並且測定了突變株18S rDNA、ITS基因序列。並將該氣取命名為{Colletotrichum linf) ST-1 ,於2012年4月24號保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC No. 6051。本發明提供的亞麻刺盤孢突變株7i/ i) ST-1, CGMCC No. 6051的生理形態及18S rDNA、ITS基因序列如下菌株在馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基平板上採用打孔器接種法接種，孔徑0.5 cm，在30 °C培養4 d後菌落直徑為5. 2 cm，平均生長直徑為13.0 mm/d;培養7 d後，菌落邊緣呈橙紅色，中間呈灰黑色、褶皺隆起，可產生橙紅色色素；菌絲與培養基連接緊密，不易挑取；分生孢子梗從菌絲層或子座生出，常不分枝也不分隔，密集成柵欄狀，分生孢子常埋於膠質中，群集時使孢子成橙色等。分生孢子盤有剛毛，剛毛一般生於分生孢子盤的周圍，分生孢子橢圓形或新月形，直或微彎。18SrDNA基因序列如下
I GTTCGACTTT ACTTCTCTAA TGACCGAGTT TGGATAACTT TCCGGCCCTG AGTGGTAGTT 61 GCCCACCTCT CTGGGCCAGT CCGAAAGCCT CACTGAGCCA TTCAATCGGT AGTAGCGACG 121 GGCGGTGTGT ACAAAGGGCA GGGACGTAAT CAACGCAAGC TGATGACTTG CGCTTACTAG 181 GGATTCCTCG TTGAAGAGCA ATAATTGCAA TGCTCTATCC CCAGCACGAC GGAGTTTAAC 241 AAGATTACCC GGGCCTTCCG GCCAAGGGAG TACTCGCTGG CTCCGTCAGT GTAACGCGCG
301TGCGGCCCAG AACATCTAAG GGCATCACAG ACCTGTTATT GCCTCAAACT TCCATCGGCT361 TGAGCCGATA GTCCCTCTAA GAAGCCGGCG TACTGCCAAA GCAATACGGG CTATTTAGCA421 GGTTAAGGTC TCGTTCGTTA TCGCAATTAA GCAGACAAAT CACTCCACCA ACTAAGAACG481 GCCATGCACC ACCACCCACA AAATCAAGAA AGAGCTCTCA ATCTGTCAAT CCTCATTGTG541 TCTGGACCTG GTGAGTTTCC CCGTGTTGAG TCAAATTAAG CCGCAGGCTC CACCCCTGGT601 GGTGCCCTTC CGTCAATTTC TTTAAGTTTC AGCCTTGCGA CCATACTCCC CCTGGAGCCC661 AAGCACTTTG ATTTCTCGTA AGGTGTCGAA CGAGTCAAAA AATAACATCG TCCGATCCCT721 AGTCGGCATA GTTTATGGTT AAGACTACGA CGGTATCTGA TCGTCTTCGA TCCCCTAACT781 TTCGTTCCTG ATAAATGAAA ACATCCTTGG CAAATGCTTT CGCAGTAGTT AGTCTTCAAT841 AAATCCAAGA ATTTCACCTC TGACAATTGA ATACTGATGC CCCCGACTGT CCCTATTAAT901 CATTACGGCG GTCCTAGAAA CCAACAAAAT AGAACCACAC GTCCTATTCT ATTATTCCAT961 GCTAATGTAT TCGAGCATAG GCCTGCCTGG AGCACTCTAA TTTTTTCAAA GTAAAAGTCC1021 TGTTTCCCCG GCACACCCAG TGAAGGGCAT GCGGTTCCAC AGAGGGAAAG GCCCGGCCGG1081 ACCAGTGCAC GCGGTGAGGC GGACCGGCCA GCCAGGCCCA AGGTTCTACT ACGAGCTTTT1141 TAACCACAAC AACTTTAATA TACGCTATTG GAGCTGGAAT TACCGCGGCT GCTGGCACCA1201 GACTTGCCCT CCAATTGTTC CTCGTTAAGG GATTTAAATT GTACTCATTC CAATTACAAG1261 ACCCAAAAGA GCCCTGTATC AGTATTTATC GTCACTACCT CCCCGTGTCG GGATTGGGTA1321 ATTTGCGCGC CT GCTGCCTT CCTTGGATGT AGTAGCCGTT TCTCAGGCTC CTTCTCCGGG1381 GTCGAGCCCT AACCCTCCGT TACCCGTTGT AACCATGCTA GAACACTACT CTAGCATCGA1441 AAGTTGATAG GGAAGAAATT TGAATGAACC ATCGCCGGCG CAAGGCCATG CGATTCGAGA1501 AGTTATTATG AATCACCAGT GAGCCCCGAA GGGCATTGGT TTTTAATCTA ATAAATACAT1561 CCCTTCCGAA GTCGGGATTT TTAGCATGTA TTAGCTCTAG AATTACCACG GTTATCCAAG1621 TAGTAAGGTA CTATCAAATA AACGATAACT TATATAATGA GCCATTCGCA GTTTCGCTGT1681 ATAATGCTTA TACTTAGACA TGCATGGGCT TAATCTTTTT AGACAGCCTA TGACTACCAT1741 CGTTCGAAAG GCAGGCGGTG CAAAACATGG GCGITS基因序列如下
I TTAAGTTCAG CGGGTATTCC TACCTGATCC GAGGTCAACC TGTAAAAGTT TTGGGGGTTT 61 TACGGCAAGA GTCCCTCCGG ATCCCAGTGC GAGACGTTAA GTTACTACGC AAAGGAGGCT 121 CCGGGAGGGT CCGCCACTAC CTTTAAGGGC CTACGTCGAC CGTAGGGCCC CAACACCAAG 181 CCGGGCTTGA GGGTTGAAAT GACGCTCGAA CAGGCATGCC CGCCAGAATG CTGGCGGGCG 241 CAATGTGCGT TCAAAGATTC GATGATTCAC TGAATTCTGC AATTCACATT ACTTATCGCA 301 TTTCGCTGCG TTCTTCATCG ATGCCAGAAC CAAGAGATCC GTTGTTAAAA GTTTTAATTA 361 TTTGCTTGTG CCACTCAGAA GAAACGTCGT TAAAATAGAG TTTGGTATCC TCCGGCGGGC 421 GCCACGCCCG TGAGGGCGCG GCCGGGAGGG GGACCGCCCC CCCGAGGGGG GGTTGTCCTC 481 CTGCCCGCCG AAGCAACAGT TAAGGTATGT TCACAAAGGG TTGTAGAGCG GTAACTCAGT 541 AATGATCCCT CCGCAGGTTC ACCTACGGA
本發明運用全波長掃描和比濁法確定孢子數量首先過濾培養至對數期末期的培養液得到孢子懸液，離心後棄上清，無菌水重新懸浮，全波長掃描確定在455 nm下有最大最大吸收峰，然後將孢子懸液濃度稀釋為IX 106、2X 106、3X 106、4X 106、5X 106、7X 106、8X 106，然後測定不同濃度的孢子懸液在450 nm下的吸光值，建立亞麻刺盤孢對數期末期孢子數目與OD值的回歸方程Y=5. 637Χ 10_2 + 7. 216X IO^8X (P < O. 01)。使用比濁法計數真菌孢子時將測得的OD值代入方程便可快速、準確得出孢子數目。此方法大大減少了工作步驟，提高了工作效率。 本發明運用一種酮康唑抗性篩選法對誘變後的菌株進行初篩
酮康唑為咪唑類抗真菌藥，其作用機制為抑制真菌細胞膜麥角留醇的生物合成，影響細胞膜的通透性，抑制其生長。它的作用機制主要為高度選擇性幹擾真菌的細胞色素Ρ-450的活性，從而抑制真菌細胞膜上麥角固醇的生物合成。酮康唑最低抑菌濃度的確定
首先製作孢子懸液，然後將孢子懸液稀釋到合適的倍數塗布於酮康唑梯度平板上，30°C培養3天，平板菌落計數。未生長菌落的最低酮康唑濃度為最低抑菌濃度。本發明首次對亞麻刺盤孢進行複合誘變
對出發菌株進行紫外誘變和氮離子注入誘變，結合酮康唑抗性進行初篩，挑取含有酮康唑最低抑菌濃度平板上生長良好的菌落接種於種子培養基培養3 4天，待種子液生長為肉眼可見的均勻小球時以10 %的接種量轉接種子培養基培養24 h，然後以10 %的接種量接種發酵培養基，培養至24 h時10 g/L DHEA投料，轉化至72 h停止發酵，取樣乙酸乙酯萃取，TLC、HPLC檢測發酵產物。所述培養基組成種子培養基(g/U :花生餅粉 I %，葡萄糖1. 5 %，KCl 0.1 %，(NH4) SO4 0. 2 %，MgSO4
0.15 %
K2H2PO4 0.1 % ;去離子水定容；PH 7. 0 ；
發酵培養基(g/L):澱粉2 %，酵母膏1. 5 %，葡萄糖2 %，麥芽膏I %，泡敵0. 15 % ;去離子水定容；PH 7. 0 ；
本發明首次通過複合誘變亞麻刺盤孢，得到高底物投料量、高底物轉化率、高產物得率的菌株隨機挑取酮康唑平板上生長良好的單菌落接種種子培養基，兩次活化後，以10 %的接種量接種發酵培養基，進行搖瓶復篩，72 h終止發酵，TLC、HPLC定性定量檢測產物。通過複合誘變，投料10 g/L時，底物轉化率由原來的49. 6 %提高到83. 2%，產物得率由原來的38. 3 %提高到62. 3%，產物得率和底物轉化率都有較大幅度的提高。
圖1 菌株{Colletotrichum Iini ST-1, CGMCC No. 6051)的 PDA 平板菌落形態。圖2 菌株(PoIletotrichum Iini ST-1, CGMCC No. 6051)的菌絲和抱子形態。圖3 菌株{Colletotrichum Iini ST-1, CGMCC No. 6051)底物 10g/L 的發酵過程曲線。圖4 MHCoIletotrichum Iini ST-1, CGMCC No. 6051)發酵產物的 HPLC 圖譜。
具體實施例方式實施實例1:出發菌株的選擇、生長曲線、轉化曲線和轉化能力的測定 出發菌株的選擇
將已有斜面菌株劃線分離單菌落，挑取平板上100株生長良好的單菌落，接種於種子培養基，30 0C >200 r/min培養4 5天後以10 %的接種量二次轉接於種子培養基，培養20 30 h後以10 %的接種量接種於250 mL搖瓶，30 °C >200 r/min培養24 h後以10 g/L DHEA投料，28 °C >200 r/min發酵72 h後終止發酵，取樣乙酸乙酯萃取3 4次，TLC初步檢測底物轉化和產物生成狀況，HPLC定性、定量檢測底物轉化和產物生成。選擇一株底物轉化率和產物得率相對較高的菌株做為出發菌株。出發菌株生長曲線的測定
以10 %的接種量接種於500mL搖瓶(裝液量100 mL)，30 °C>200 r/min培養，每隔4h取樣I mL，烘乾稱乾重(連續稱重三次，重量差別不超過0.5 %)，以時間為橫坐標(0 90
h)，以菌體乾重為縱坐標做菌體生長曲線。出發菌株轉化曲線和轉化能力的測定
以10%的接種量接種於500mL搖瓶(裝液量100 mL)，28 °C >200 r/min培養至24 h分
別以4 g/L,8 g/L、10 g/L、12 g/L、16 g/L投料，投料後每間隔4 8 h取樣，乙酸乙酯萃
取3 4次，HPLC檢測底物轉化和產物生成狀況，以時間(h)為橫坐標，產物生成量和底物
剩餘量(g/L)為縱坐標做菌株轉化曲線。
權利要求
1.一株通過複合誘變篩選得到的高效轉化去氫表雄酮為30，7a，15a-三羥基雄甾-5-烯-17-酮的突變菌株,該菌株為亞麻刺盤孢Iini ) ST-1,保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCC No. 6051，保藏日期為2012年4月24日。
2.亞麻刺盤孢(Cb77e(otricA7i/ i)ST_l保藏號CGMCCNo. 6051的誘變選育方法，其特徵在於 (1)出發菌株的確定將已有斜面菌種平板劃線分離單菌落，隨機挑選生長良好的100株單菌落搖瓶發酵，TLC、HPLC檢測底物轉化和產物生成能力，最終選擇C I為出發菌株； (2)孢子懸液的製備菌液培養至對數期2 4層無菌擦鏡紙過濾得到孢子懸液，10000r/min離心10 min,棄上清後0. 9 %無菌生理鹽水洗劑2 3次後，振蕩打散； (3)孢子計數方法的確定孢子懸液全波長掃描確定最大吸收波長為455nm，然後將孢子懸液濃度分別調整為IX 106、2X 106、3X 106、4X 106、5X 106、7X 106、8X 106，然後測定不同濃度的孢子懸液在450 nm下的吸光值，建立亞麻刺盤孢對數期末期孢子數目與OD值的回歸方程Y=5. 637X 10_2 + 7. 216X 10_8 X (P < 0.01);使用比濁法計數真菌孢子時將測得的OD值代入方程便可快速、準確得出孢子數目； (4)出發菌株生長曲線、紫外致死率曲線和N-離子注入致死率曲線的制定接種後每隔4 h取樣測乾重，以時間為橫坐標，菌體乾重為縱坐標做菌體生長曲線；誘變孢子懸液至於 25 w、30 cm 紫夕卜燈下分別照身寸 I min、2 min、3 min、4 min、5 min、6 min、7 min、8 min,稀釋塗布PDA平板，選擇80 % 90 %的致死率照射時間進行誘變；取誘變孢子懸液0.1 ml均勻塗布於直徑為90 _的無菌空白平皿中央，至於超淨臺下由無菌風吹乾製成菌膜，注入前靶室用紫外燈滅菌30 min，將孢子懸液放於靶室，分別用2. 6X1014 ions/cm2的0、20、40、60、80、100、120和140倍的不同劑量注入離子；將誘變孢子適當稀釋，塗布PDA平板，以置於小靶室真空中不經離子注入的孢子懸液為對照，計算存活率，做致死率曲線；選擇70% 80 %的致死率注入劑量作為最佳注入劑量； (5)使用酮康唑抗性對誘變菌株初篩首先確定酮康唑最低抑菌濃度，孢子懸液塗布於酮康唑梯度平板，未生長菌落的酮康唑平板濃度即為最低抑菌濃度；誘變後塗布菌懸液與含有酮康唑最低抑菌濃度的PDA平板，30 °C培養3 4天，挑取生長良好的單菌落搖瓶復篩。
3.利用突變株亞麻刺盤孢Iini)ST-1保藏號CGMCC No. 6051轉化去氫表雄酮為30，7a，15a-三羥基雄甾_5_烯_17_酮的方法，其特徵為250 mL三角瓶裝30 mL的種子培養基，接種量按體積比為10 %，培養溫度30 °C，搖床轉速200 r/min，培養24 h後投入底物去氫表雄酮，繼續轉化60 72 h，乙酸乙酯萃取，TLC、HPLC檢測底物轉化和產物生成；所述培養基組成種子培養基(g/L):花生餅粉I %，葡萄糖1. 5 %，KCl 0.1%，(NH4) SO4 0. 2 %，MgSO4 0. 15 %，K2H2PO4 0.1 % ;去離子水定容；PH 7. 0 ;發酵培養基(g/L)澱粉2 %，酵母膏1. 5 %，葡 萄糖2 %，麥芽膏I %，泡敵0. 15 % ;去離子水定容；PH 7. 0 ；.121 "€高壓蒸汽下滅菌20 min。
全文摘要
本發明屬生物工程中發酵技術領域，具體涉及通過紫外和氮離子注入複合誘變篩選得到高效轉化去氫表雄酮為3β,7α,15α-三羥基雄甾-5-烯-17-酮的高產突變株(Colletotrichumlini)ST-1。本發明通過紫外線和氮離子注入複合誘變，獲得底物投料濃度高、轉化率高、副產物較少的菌株，為微生物轉化甾體藥物工業化提供了基礎。
文檔編號C12P33/06GK103060201SQ20121042772
公開日2013年4月24日 申請日期2012年11月1日 優先權日2012年11月1日
發明者許正宏, 李傳鵬, 李會, 史勁松, 竇文芳 申請人:江南大學