一種鮑魚肌肉多糖及其製備方法與應用與流程

2023-05-29 04:32:36 2

本發明涉及一種多糖，尤其涉及一種從鮑魚肌肉提取的新型多糖及其製備工藝和應用。

背景技術：

鮑魚被譽為海洋人參，蛋白、多糖等營養物質和生物活性成分有助於促進人體健康。由於鮑魚來源的多糖具有良好的抗氧化、增強免疫調節、抗腫瘤和抗凝血活性等功能，因此近年來從鮑魚提取多糖已引起廣泛的關注。中國專利公開號CN102898538 A公開一種鮑魚內臟酸性多糖及含有其的保健品和應用，其鮑魚內臟多糖主要是由鼠李糖、葡萄糖醛酸和半乳糖構成，可以用作一種保肝護肝的功能因子。然而，有關鮑魚肌肉多糖的結構和功能卻鮮有報導。

技術實現要素：

本發明的目的在於提供一種鮑魚肌肉多糖，所述多糖從鮑魚肌肉中提取，具有良好的抑制乳腺癌和肝癌細胞生長繁殖的活性。

本發明還提供了所述鮑魚肌肉多糖的製備工藝和應用。

本發明的內容為：

一種鮑魚肌肉多糖，主要由葡萄糖及甘露糖組成，分子量為3200Da，其主鏈是由葡萄糖通過1→4糖苷鍵和1→6糖苷鍵構成，側鏈是由1→6糖苷鍵組成，糖殘基為α構型，具體結構為：

本發明還提供了所述鮑魚肌肉多糖的製備方法，步驟為：

1、鮑魚肌肉去除表面雜質後，與2-4倍重量冷水混合攪碎，然後在10-30℃下攪拌萃取0.5-2h，通過5000rpm離心15-30min除去不溶物後，獲得上清液。

2、將步驟1獲得的上清液用氫氧化鈉調整pH至9.0，然後先後加入上清液質量體積比的1-2g/L鹼性蛋白酶和1-2g/L膠原酶，在45-55℃下酶解1-3h。

3、用鹽酸將步驟2獲得的上清液的pH調整至6.0-7.0，再分別加入液體質量體積比的1-2g/L中性蛋白酶和1-2g/L木瓜蛋白酶，在45-55℃下酶解1-3h。

4、酶解結束後，通過旋蒸濃縮後，往濃縮液中加入無水酒精，使溶液中的酒精濃度達到20-40％，於常溫下靜置30-60min後，過濾除去沉澱。

5、在步驟4獲得的濾液中繼續緩慢添加無水酒精，使溶液中的酒精濃度達到80％，放在4℃下靜置8-16h可以獲得鮑魚肌肉重量5-6％的沉澱物。

6、上述沉澱物用5-10倍沉澱物重量的蒸餾水溶解後，加入溶液質量體積比的5-20g/L的活性炭，在30-40℃下脫色1-3h後，通過5000rpm離心15-30min、過濾除去活性炭後，利用DEAE-52陰離子交換柱分離，收集水洗分離組分，再利用Sephadex-G交聯葡聚糖凝膠層析純化，最後通過冷凍乾燥獲得鮑魚肌肉多糖，純度為92％。

本發明還提供了上述鮑魚肌肉多糖在治療乳腺癌藥品和保健品中的應用。

本發明還提供了上述鮑魚肌肉多糖在治療肝癌藥品和保健品中的應用。

本發明的有益效果：

本發明提取的鮑魚肌肉多糖為3200Da的葡聚糖，易於合成；具有良好的抑制乳腺癌和肝癌細胞生長繁殖的活性；本發明明確了鮑魚肌肉多糖的分子結構，可以為合成提供參考；本發明採用冷水浸提，提取多糖後的鮑魚肌肉殘渣還可以用於其他產品開發，將起到多元化綜合利用。

【附圖說明】

圖1是鮑魚肌肉多糖甲基化前(a)和甲基化後(b)的紅外圖譜；

圖2是鮑魚肌肉多糖的1H NMR譜圖；

圖3是鮑魚肌肉多糖的13C NMR譜圖；

圖4是鮑魚肌肉多糖的HSQC譜圖；

圖5是鮑魚肌肉多糖的COSY譜圖；

圖6是鮑魚肌肉多糖的TOCSY譜圖；

圖7是鮑魚肌肉多糖的HMBC譜圖；

圖8是鮑魚肌肉多糖的ROESY譜圖；

圖9是鮑魚肌肉多糖主鏈分子結構圖；

圖10是鮑魚肌肉多糖對人體肝癌細胞(HepG2細胞)生長抑制的影響；

圖11是鮑魚肌肉多糖對人體乳腺癌細胞(MDA-MB-231細胞)生長抑制的影響。

【具體實施方式】

以下通過具體實施例對本發明作進一步詳細說明，以下對於具體實施方案的描述僅用於解釋本發明，並不限定本發明。

實施例1

1、1kg的鮑魚肌肉去除表面雜質後，與4L冷水混合攪碎，然後在10℃下攪拌萃取2h，通過5000rpm離心15min除去不溶物後，獲得4.5L的上清液。

2、將步驟1獲得的上清液用氫氧化鈉調整pH至9.0，然後先後加入4.5g鹼性蛋白酶和4.5g膠原酶，在50℃下酶解2h。

3、用鹽酸將步驟2獲得的上清液的pH調整至6.5，再分別加入4.5g中性蛋白酶和4.5g木瓜蛋白酶，在50℃下酶解2h。

4、酶解結束後，通過旋蒸濃縮至0.5L，往濃縮液中加入0.33L的無水酒精，於常溫下靜置30min後，過濾除去沉澱。

5、在步驟4獲得的濾液中繼續緩慢添加1.67L的無水酒精，放在4℃下靜置8h可以獲得50g左右的沉澱物。

6、上述沉澱物用0.50L的蒸餾水溶解後，加入5g的活性炭，在30℃下脫色3h後，通過5000rpm離心15min、過濾除去活性炭後，利用DEAE-52陰離子交換柱分離，收集水洗分離組分，再利用Sephadex-G交聯葡聚糖凝膠層析純化，最後通過冷凍乾燥獲得10g鮑魚肌肉多糖，純度為92％。

7、採用苯酚-硫酸法，以半乳糖作為標準品進行檢測鮑魚肌肉多糖的總糖含量；採用凱氏定氮法測量蛋白含量；單糖組成採用高效液相色譜法測定；多糖結構採用核磁共振(NMR)進行分析；多糖對腫瘤細胞的抑制作用通過四唑鹽(MTT)比色法進行檢測。

實施例2

1、1kg的鮑魚肌肉去除表面雜質後，與2L冷水混合攪碎，然後在20℃恆溫箱裡攪拌萃取30min，通過5000rpm離心30min除去不溶物後，獲得2.5L的上清液。

2、將步驟1獲得的上清液用氫氧化鈉調整pH至9.0，然後先後加入5.0g鹼性蛋白酶和5.0g膠原酶，在45℃下酶解1h。

3、用鹽酸將步驟2獲得的上清液的pH調整至6.0，再分別加入5.0g中性蛋白酶和5.0g木瓜蛋白酶，在45℃下酶解1h。

4、酶解結束後，通過旋蒸濃縮至0.4L，往濃縮液中加入0.1L的無水酒精，於常溫下靜置60min後，過濾除去沉澱。

5、在步驟4獲得的濾液中繼續緩慢添加1.5L的無水酒精，放在4℃下靜置16h可以獲得60g左右的沉澱物。

6、上述沉澱物用0.30L的蒸餾水溶解後，加入3g的活性炭，在35℃下脫色1h後，通過5000rpm離心30min、過濾除去活性炭後，利用DEAE-52陰離子交換柱分離，收集水洗分離組分，再利用Sephadex-G交聯葡聚糖凝膠層析純化，最後通過冷凍乾燥獲得11g鮑魚肌肉多糖，純度為92％。

7、採用苯酚-硫酸法，以半乳糖作為標準品進行檢測鮑魚肌肉多糖的總糖含量；採用凱氏定氮法測量蛋白含量；單糖組成採用高效液相色譜法測定；多糖結構採用核磁共振(NMR)進行分析；多糖對腫瘤細胞的抑制作用通過四唑鹽(MTT)比色法進行檢測。

實施例3

1、1kg的鮑魚肌肉去除表面雜質後，與3L冷水混合攪碎，然後在30℃恆溫箱裡攪拌萃取30min，通過5000rpm離心25min除去不溶物後，獲得3.5L的上清液。

2、將步驟1獲得的上清液用氫氧化鈉調整pH至9.0，然後先後加入1.75g鹼性蛋白酶和1.75g膠原酶，在55℃下酶解3h。

3、用鹽酸將步驟2獲得的上清液的pH調整至7.0，再分別加入1.75g中性蛋白酶和1.75g木瓜蛋白酶，在55℃下酶解3h。

4、酶解結束後，通過旋蒸濃縮至0.3L，往濃縮液中加入0.13L的無水酒精，於常溫下靜置60min後，過濾除去沉澱。

5、在步驟4獲得的濾液中繼續緩慢添加0.77L的無水酒精，放在4℃下靜置12h可以獲得60g左右的沉澱物。

6、上述沉澱物用0.40L的蒸餾水溶解後，加入12g的活性炭，在40℃下脫色1h後，通過5000rpm離心25min、過濾除去活性炭後，利用DEAE-52陰離子交換柱分離，收集水洗分離組分，再利用Sephadex-G交聯葡聚糖凝膠層析純化，最後通過冷凍乾燥獲得11.5g鮑魚肌肉多糖，純度為92％。

7、採用苯酚-硫酸法，以半乳糖作為標準品進行檢測鮑魚肌肉多糖的總糖含量；採用凱氏定氮法測量蛋白含量；單糖組成採用高效液相色譜法測定；多糖結構採用核磁共振(NMR)進行分析；多糖對腫瘤細胞的抑制作用通過四唑鹽(MTT)比色法進行檢測。

鮑魚肌肉多糖組成及結構分析

上述3個實施例提取的鮑魚肌肉多糖總量、蛋白含量及單糖組成如表1所示：

表1鮑魚肌肉多糖的化學組成和單糖組成

根據表1的結果，3個實施例提取的鮑魚肌肉多糖中的蛋白含量都低於1％，總糖含量都接近90％，而且以摩爾比例計算，該鮑魚肌肉多糖含有99％以上的D-葡萄糖，表明本發明提取的鮑魚肌肉多糖可能是一種葡聚糖。另外，提取的鮑魚肌肉多糖的分子量大約為3200Da(數據未顯示)。

將鮑魚肌肉多糖甲基化，甲基化前後產物的紅外光譜結果如圖1所示，甲基化後的紅外光譜在3400cm-1附近沒有出現峰，說明鮑魚肌肉多糖甲基化完全。對甲基化產物進行氣相色譜分析，結果如表2所示：

表2鮑魚肌肉多糖甲基化產物分析

由表2可知，葡萄糖Glc檢測出以下四種鍵型：1→，1→4，1→6，1→4,6；甘露糖(Man)檢測出了一種鍵型：1→2。與單糖結果類似，鮑魚肌肉多糖也檢測到少量的支鏈(1→2)Man，因此理論上可以認為所提取的鮑魚肌肉多糖是由D-葡萄糖組成的葡聚糖。

鮑魚肌肉多糖的結構特徵通過1D和2D NMR圖譜確定，如圖2所，1H-NMR圖譜的異頭氫區域分別觀察到δ5.35(d, 3JH-1,H-2＝4.13Hz),5.33(沒有分裂峰),5.24(d,3JH-1,H-2＝4.00Hz)，4.98ppm(d,3JH-1,H-2＝4.13Hz)四個異頭氫信號，表明鮑魚肌肉多糖的糖殘基是通過α-構型的糖苷鍵連接。

從圖3的13C NMR圖譜中可以觀察到δ102.83，101.39，100.76，98.58和94.69ppm五個異頭碳信號，但在圖4的HSQC圖譜的異頭區只觀察到了四個主要的交叉峰。因此可以認為鮑魚肌肉多糖是由四個糖殘基組成，對應的異頭區信號分別為δ5.35/102.83(殘基A)，5.33/100.76(殘基B)，5.24/94.68(殘基C)和4.98/101.63ppm(殘基D)。圖3的13C NMR圖譜還可以說明鮑魚肌肉多糖是一種吡喃糖。另一方面，由圖2中異頭氫信號的信號強度以及甲基化的結果可以將殘基A，B，C，D暫時歸屬為→4)-α-D-Glc-(1→，→4,6)-α-D-Glcp-(1→，→6)-α-D-Glcp-(1→和T-α-D-Glcp-(1→。

根據圖4的HSQC譜圖，圖5的COSY譜圖和圖6的TOCSY譜圖的結果及文獻中的數值對1H NMR和13C NMR中的信號進行歸屬，結果如表3所示：

表3鮑魚肌肉多糖的COSY,TOCSY和HSQC譜峰的歸屬

由表3中的數據可以看出，13C NMR圖譜中的信號值80.80和80.87ppm分別屬於殘基A和殘基B的4位碳，表明殘基A和殘基B的4位碳發生了取代。同樣的，殘基B和殘基C的6位碳也發生了取代。由此進一步證明對殘基A，B，C，D的歸屬是合理的。此外，在甲基化的結果中有檢測到鮑魚肌肉多糖中含有糖殘基→2)-Man-(1→，但是在核磁分析結果(圖2、圖3)中沒有檢測到它的信號，這可能是因為鮑魚肌肉多糖中的甘露糖含量太低的緣故。

從圖7中可以觀察到鮑魚肌肉多糖殘基A的H-1(δ5.35ppm) 和C-4的交叉峰(A H-1/A C-1)，殘基B的H-4(δ3.66ppm)和殘基A的C-1的交叉峰(B H-4/A C-1)，殘基B的H-1(δ5.33ppm)和殘基A的C-4的交叉峰(B H-1/A C-4)，表明殘基A和殘基A以及殘基A和殘基B之間都是通過1,4-糖苷鍵進行連接。

從圖8中可以觀察到鮑魚肌肉多糖殘基A的H-1(δ5.33ppm)和殘基C的H-6的交叉峰(A H-1/C H-6)，殘基D的H-1(δ4.98ppm)和殘基B的H-6的交叉峰(D H-1/B H-6)，表明鮑魚肌肉多糖中的糖殘基A和殘基C以及殘基D和殘基B之間都是以1,4-糖苷鍵進行連接。交叉峰A H-1/A H-4和A H-1/B H-4同樣可以在ROESY圖譜中觀察到。

基於以上所有的化學及光譜分析結果，可以推斷出從鮑魚肌肉中獲得的α-葡聚糖的一個可能的分子結構如圖9：在鮑魚肌肉多糖結構的一個循環單元中，主鏈上包含八個1→4糖苷鍵和一個1→6糖苷鍵，三條側鏈通過1→6糖苷鍵與主鏈相連。

鮑魚肌肉多糖對人體乳腺癌細胞和肝癌細胞的抑制分析

圖10和圖11為鮑魚肌肉多糖對人體乳腺癌細胞(MDA-MB-231細胞)和人體肝癌細胞(HepG2細胞)生長抑制的影響，結果表明提取的鮑魚肌肉多糖對兩種腫瘤細胞的生長抑制作用都有抑制效果和明顯量效關係，可以應用在治療乳腺癌和肝癌藥品和保健品中。

以上所述僅為舉例性，而非為限制性者。任何未脫離本發明之精神與範疇，而對其進行之等效修改或變更，均應包含於後附之申請專利範圍中。