一種抗豬瘟病毒的肽核酸的製作方法

2023-05-28 23:59:21

專利名稱：一種抗豬瘟病毒的肽核酸的製作方法
技術領域：
本發明的目的是克服現有技術的不足之處，提供一種抗豬瘟病毒的肽核酸。
背景技術：
豬痕(HogCholera, HC),又稱之為經典豬痕(Classical Swine Fever, CSF),不同於非洲豬瘟，系由豬瘟病毒(CSFV)引起的一種高度接觸性傳染病。豬瘟最早於19世紀30年代在美國的俄亥俄州發現，是一種接觸性傳染，流行廣、死亡率高的豬的傳染病。豬瘟造成的經濟損失巨大，歷來是各國研究的熱點，國際獸醫局(OIE)國際委員會將豬瘟列入A類16種法定傳染病之一。 我國是世界上養豬最多的國家，也是豬瘟流行嚴重的國家之一，我國近幾年因各種疾病死亡的豬佔飼養總數的8% 10%，其中1/3以上由豬瘟致死，每年的直接經濟損失數十億元，造成了巨大的人力和資源浪費。間接影響如豬群中存在豬瘟時主要國際市場都禁止進口其活豬和豬肉。根據發病的程度，將其分為急性、亞急性、慢性、非典型性和不明顯型。急性CSF由強毒株引發，一般導致高發病率和死亡率，而弱毒病毒感染則無明顯臨床症狀。介於疫苗的廣泛應用，有效地控制了豬瘟的大流行，減少了急性死亡。但自上世紀70年代末以來，全世界豬瘟流行的特點均發生了重大變化，如臨床症狀不典型，病程變長，呈周期性、波浪形的地區散發性流行，持續感染普遍存在，疫苗的預防效果明顯下降。同時疫點明顯減少，多局限於所謂的「豬瘟的不穩定地區」的散發性流行。近年來，國內又出現豬瘟的反彈現象，而且疫情變得異常複雜，如既有區域性大流行又有零散式發生，既有高死亡率的急性症狀，又有頑固的持續發生的溫和性症狀。目前世界各國針對CSF疫情的處理主要有兩種手段:1，撲殺，建立完善且嚴格的疫情監測與報告體系，及時發現、劃定及封鎖疫區、採取徹底撲殺所有感染豬群與感染動物並進行無害化處理和徹底消毒環境，消滅傳染源；2，免疫，強化以豬瘟病毒(CSFV)疫苗接種為主要手段。中國豬瘟兔化弱毒(C2株)疫苗自從問世以來，一直享譽海內外，被許多國家竟相引用。自從二十世紀60年代以來，C2株疫苗及其換代產品(細胞苗)在我國以防為主的豬瘟防治策略的實施中起到了決定性的作用，有效地控制了豬瘟在我國的急性發生和大流行。但自20世紀80年代以來，非典型性豬瘟成為該病的主要發生形式，持續感染普遍存在，疫苗的預防效果明顯下降，使豬瘟防制遇到了新的困難。經流行病學調研發現近年來豬瘟流行毒已呈遠向疫苗毒的方向演變，近期豬瘟流行毒與古典豬瘟毒之間有較大差異(核酸和胺基酸同源性分別為82.2% 84.3%和87.9% 90.4%)。豬痕病毒屬於黃病毒科(Flaviviridae)痕病毒屬。病毒顆粒呈圓形,直徑為40 -50 nm,有囊膜,病毒表面有6 nm 8 nm類似穗樣的突起，內部為二十面體的對稱核衣殼，內部核心直徑大約30 nm，豬瘟病毒不耐熱，pH5 10時穩定，不耐酸(如<pH3.0)，對乙醚、氯仿和去氧膽酸鹽等脂溶劑敏感，可很快使病毒失活。參考豬瘟流行毒株的序列，該病毒可分為三個群=CSFV-1,稱為古典豬瘟，以Brescia株為代表。CSFV-2，以Alfort株為代表。CSFV-3，與上述二個群均有較大差異，包括了一些日本、泰國和臺灣地區近年來流行毒株。中國流行的優勢毒株多屬CSFV-2。CSFV基因組為單股線性正鏈RNA分子，基因組大約12.5 kb,由5』非編碼區(5』 -UTR)、一個開放閱讀框(ORF)和3』-非編碼區(3』-UTR)構成。其5'端無甲基化帽子結構，3'端也無poly (A)尾巴結構。5'端UTR長度為373 nt或374 nt，有莖環，髮夾等複雜二級結構，其5'端沒有帽子結構，因而翻譯起始機制與一般真核生物的mRNA分子不同，是由5'端UTR內有一個稱為核糖體內部進入位點(Internal Ribosome Entry Site, IRES)的結構元件與核糖體40S亞基結合，啟動蛋白質的翻譯。5'端UTR不僅與翻譯有關，與病毒基因組的複製也有關。3』端長度215 nt 239 nt，隨毒株不同而有差異。在所有瘟病毒中3'端是高度保守的，特別是最後大約100 nt的區域。3'端在病毒的複製繁殖過程中有重要作用，它參與病毒基因組的複製、多聚蛋白的翻譯和病毒粒子的裝配。中間的ORF編碼一個3898個胺基酸的多聚蛋白，分子量約438 kDa的多聚蛋白(NpM、C、Ems (E0),EUE2、p7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A、NS5B)，並進一步在病毒和宿主細胞蛋白酶的作用下加工為成熟蛋白，CSFV的所有結構蛋白和非結構蛋白均由該ORF所編碼。蛋白及其功能
C蛋白為豬瘟病毒的核衣殼蛋白，為結構蛋白，由86 89個胺基酸殘基組成，分子質量14 kDa，又被稱之為pl4，該蛋白的N端為Serl9。C蛋白富含鹼性胺基酸(賴氨酸和精氨酸)，帶正電荷。C蛋白除構成病毒的核衣殼外，同時在病毒增殖過程中對基因表達調控發揮著重要的作用。研究表明，該蛋白179 180、194 198、208 212胺基酸的突變將顯著降低病毒的增殖能力。C蛋白主要分布在細胞核和細胞漿中，這可能與C蛋白參與病毒複製和轉錄調控有關，但其具體作用機制還需深入研究。另有研究表明，重組表達的C蛋白可激活人HSP70基因的啟動子，但對SV40啟動子具有抑制作用，這也證明了 C蛋白對基因表達有調節作用，而且對不同的啟動子有截然相反的調控作用。pro蛋白及其功能 Npro蛋白，也稱p23，為豬瘟病毒編碼的非結構蛋白，分子量為23kDa，處於ORF編碼的多聚蛋白N端的第一位，由168個胺基酸殘基組成，是一種具有蛋白水解酶活性的半胱氨酸蛋白酶，其具有在自身C端剪切產生病毒核衣殼蛋白的N端的功能，是病毒在細胞內增殖所必需的構件，當它缺失後，從培養物中分離不到存活的病毒。研究表明Npix)有助於CSFV逃避機體的自然免疫，建立持續性感染。Xu等通過基因沉默技術，幹擾Npix)表達可有效抑制CSFV在PK-15細胞中的繁殖。Wen等以家兔為模型，發現家兔感染CSFV後，幹擾Npro表達同樣可以能有效抑制豬瘟病毒的增殖。Ruggli等研究表明，Npix)能抑制機體的天然免疫系統，使病毒逃避宿主的免疫清除，因此，Npro實可能與豬瘟病毒的毒力及致病性有關。反義核酸(antisense nucleic acid)是一段與革E基因(mRNA或DNA)的某段序列互補的天然存在或人工合成的核苷酸序列，反義核酸通過鹼基配對方式特異性的與病毒靶基因結合形成雜交分子，從而在複製、轉錄和翻譯水平調節靶基因的表達，或誘導RNase H識別並切割mRNA，進而使其功能喪失。反義核酸包括反義RNA (antisense RNA)和反義DNA (antisense DNA),具有合成方便、序列設計簡單、容易修飾、選擇性高、親和力強等特點。反義核酸作為一種新的抗病毒、抗腫瘤藥物，掀起了一場藥理學領域的革命，即新的藥物受體mRNA通過新受體結合方式(Watson-Crick雜交)、引發新的藥物受體結合後反應:(I) RNase H介導的祀RNA的降解；(2)抑制DNA的複製和轉錄及轉錄後的加工和翻譯等。可以說反義寡核苷酸(ODNs)療法比傳統的藥物治療手段有更高的特異性。從二十世紀70年代末到現在，在這三十年的時間中，反義核酸藥物已走出實驗室，進入了實際臨床應用。特別是第一個反義核酸藥物Fomivirsen通過FDA批准上市後,人們對反義療法尤為關注。反義核酸作用原理基於鹼基配對原則，可通過與靶RNA進行鹼基配對結合的方式參與對相關基因表達的調控。其作用方式可能有:①反義RNA與病毒mRNA結合形成互補雙鏈阻斷核糖體與病毒mRNA的結合，從而抑制了病毒mRNA翻譯成蛋白質的過程。②反義DNA能與祀基因形成一種三鏈核酸(triple helix nucleic acid),它通過作用於控制基因轉錄的轉錄子、增強子和啟動子區，對基因的轉錄進行調控。③反義核酸與病毒mRNA的結合可阻擋mRNA向細胞質的運輸。④反義核酸與病毒mRNA結合後使得mRNA更加易被核酸酶識別降解，從而大大縮短mRNA的半衰期。上述四種作用途徑都可表現為對病毒基因表達的抑制或調控，且這種調控是高度特異性的。反義核酸是通過鹼基互補配對的原理來識別所打靶的基因，從理論來分析，研究人員以動物細胞為例，其染色體大約有幾十億對鹼基，如果4個鹼基(A、G、C和T)的數目大致相同，並在整個基因中隨機分布，那麼按照統計學原理，大於17個鹼基的反義核酸與非靶基因雜交的可能性不大，所以長度超過17個鹼基的反義核酸分子與靶基因的結合可以說是唯一的，從而使反義核酸具有高度的特異性。研究表明，在細胞內部一個拷貝的基因會產生200-300條mRNA，翻譯出10萬個具有生物活性的蛋白質分子。傳統藥物主要作用於有生物功能的蛋白分子的某結構域上的幾個作用位點，事實上蛋白的結構是非常複雜的，且在生物體內，活性蛋白的空間結構又是千變萬化的，以傳統藥物有限的幾種作用位點來控制靶分子的動態的和整體的功能很難達到理想的效果，因而不難看出傳統藥物的局限性。由mRNA可翻譯出幾十到幾百個蛋白，反義核酸在mRNA水平對靶基因直接進行調控 ，這個步驟相當於將傳統藥物作用放大了數十到數百倍，可見反義核酸的調控是極其經濟合理的。毒理學研究表明，反義核酸在體內具有很低的毒性，儘管其在生物體內的存留時間有長有短，但最終都將被降解消除，這避免了如轉基因療法中外源基因整合到宿主染色體上的危險性。與傳統藥物相比，反義核酸藥物具有特異性強，效率高和毒副作用低等優點，在抑制腫瘤生長和抗病毒複製等方面顯現出了良好的應用價值。目前已有多個藥物進入美國和歐洲市場，另還有30多種反義核酸藥物正在進行臨床前期的研究或開發後進入了 1、II和III期實驗。由於動物體內存在大量的核酸外切酶，反義核酸若不經過化學修飾，很快就被降解，失去活性。目前對反義核酸的化學修飾有很多方法，常見的有硫代修飾反義核酸及2』-甲氧基修飾反義核酸等。且目前硫代修飾藥物的研究最為全面，它可有效抵抗核酸酶的降解，同時可促進核酸酶Rase H的活性，目前這種修飾方法已成功用於臨床的反義核酸藥物。但這些還只是第一代反義核酸的修飾方法，隨著技術的發展與進步，新的修飾途徑與方法被開發出來，使得反義核酸的研究進入了第二、三代，其中肽核酸的修飾最為引人關注。肽核酸(peptidenucleic acids, PNAs),是一種以中性醯胺鍵為骨架的全新的DNA類似物，其骨架的結構單元為N (2-氨基乙基)-甘氨酸，鹼基部分通過亞甲基羰基連接於主骨架的氨基N上。儘管PNA在結構上相對寡核苷酸有了顯著的改變，但PNA與互補核酸之間的結合仍遵循鹼基互補配對原則，甚至比天然核苷酸具有更高的親和性。PNA可序列特異性地靶向作用於DNA或RNA，為反義核酸的第二、三代產品。PNA與對應的DNA或RNA形成穩定的PNA-DNA或PNA-RNA結構，這種結構非常穩定，幾乎不受環境因素變化的影響，如離子，PH值等。近年來，科研人員對最初開發出的PNA進一步優化，在結構方面作了很大改進(如骨架結構、在N-(2-氨基乙基)甘氨酸上連接手性和非手性的基團、鹼基的類型等)，提高其生物學穩定性和利用度、靶結合特性以及藥代動力學特性，並將PNA應用於診斷和治療等方面。殼聚糖是天然多糖中唯一的鹼性多糖，具有來源豐富、無毒、易化學修飾性、生物相容性和可再生性等優越的功能性質和獨特分子結構。殼聚糖作為可生物降解材料用於新型給藥系統，通過改變給藥途徑可大大提高藥物療效，具有控制釋放、增加靶向性、減少刺激和降低毒副作用以及提高疏水性藥物通過細胞膜、增加藥物穩定性等作用特點。
權利要求
1.一種抗豬瘟病毒的肽核酸，其特徵在於，所說的肽核酸為針對抗豬瘟病毒的C蛋白和/或Npn5蛋白的反義核酸序列，所述的針對C蛋白的反義核酸序列選自SEQ ID.1、SEQID.2和SEQ ID.3核苷酸序列中的一種或一種以上；所述的針對Npn5蛋白的反義核酸序列選自SEQ ID.4、SEQ ID.5和SEQ ID.6核苷酸序列中的一種或一種以上。
2.有如權利要求1述的抗豬瘟病毒的肽核酸的藥物組合物。
3.按權利要求1所述的抗豬瘟病毒在製備動物藥物上的用途。
全文摘要
本發明提供了一種抗豬瘟病毒的肽核酸，所說的肽核酸為針對抗豬瘟病毒的C蛋白和/或Npro蛋白的反義核酸序列。本發明還提供了含有所述的抗豬瘟病毒的肽核酸的藥物組合物。本發明還提供了所述的抗豬瘟病毒在製備動物藥物上的用途。本發明的用於防控豬瘟病毒CSFV的特異性抗病毒肽核酸動物藥物，是針對CSFVC和Npro的基因保守部分設計高效特異性的反義核酸序列，並採用特定工藝人工合成肽核酸片段，該序列與上述保守性靶基因互補，根據鹼基互補原理，反義核酸序列特異性地與CSFVC和Npro的對應的靶基因相結合，誘導核酶對靶基因進行降解，從而阻斷靶基因的轉錄與表達，抑制CSFV在機體內複製與裝配，以達到防控豬瘟的目的。
文檔編號A61K48/00GK103088025SQ201310014160
公開日2013年5月8日 申請日期2013年1月15日 優先權日2013年1月15日
發明者韓健寶, 曲向陽, 顧宏偉, 王遠孝, 馬國輔 申請人:韓健寶