一種信號增強型免疫層析金標試紙條及其製備方法
2023-05-29 06:06:26
專利名稱：一種信號增強型免疫層析金標試紙條及其製備方法
一種信號增強型免疫層析金標試紙條及其製備方法技術領域
本發明屬於食品安全、檢驗檢疫、環境檢測以及疾病早期診斷用的金標試紙條技術領域，具體涉及一種信號增強型超靈敏膠體金標記免疫層析試紙條及其製備方法。
背景技術：
隨著社會的發展和國際進出口貿易量的增加，檢驗檢疫以及食品安全檢測所面臨的檢測任務越來越重，海量檢測樣品量對檢驗檢疫和食品安全檢測提出了新的需求。傳統依靠儀器的檢測方法具有檢測靈敏度高，檢測結果穩定性好等優點。但由於大型儀器具有價格昂貴，操作人員必須具有相關的專業知識，以及檢測成本昂貴等缺點決定了依靠大型儀器的檢測方法不能夠在各種基層和現場檢測中廣泛推廣使用。基於免疫分析技術的檢測方法在一定程度上緩解了當前檢測所面臨的嚴峻形勢。如酶聯免疫吸附分析法，具有檢測靈敏度高，檢測成本相對低廉等特點。膠體金檢測試紙條的出現對於檢測時間上有了極大的革新，在小於1小時的時間範圍內實現目標物的快速檢測。同時，由於金標試紙條檢測技術在檢測過程中不需要其他複雜的儀器，只需通過肉眼觀察即可判斷試紙條的檢測結果。 在這樣的條件下，試紙條的檢測靈敏度對於檢測結果的判斷具有重要意義。但金標試紙條發展至今，其檢測靈敏度的優化一直是試紙條相關檢測方法的研究重點之一。發明內容
本發明針對現有金標試紙條及其相關檢測方法的靈敏度有待進一步提高的研究現狀，利用納米材料的比表面效應，進行金標試紙條檢測信號增強的研究，提供了一種信號增強型免疫層析金標試紙條及其製備方法，實現對目標檢測物進行超靈敏現場快速檢測。
本發明具體的技術方案如下一種信號增強型超靈敏免疫層析金標試紙條包括塑料襯板，所述塑料襯板上分別依次粘貼有樣品玻璃纖維膜，免疫探針金標墊，信號擴增金標墊，硝酸纖維膜和吸水玻璃纖維膜五種粘貼物；相鄰粘貼物之間重疊部分的長度為2 mm，乾燥封裝，溫度4°C 常溫條件下保存。
一種信號增強型免疫層析金標試紙條的製備方法的具體製備操作步驟如下 (1)目標檢測物金標免疫探針的製備選取粒徑為30 40nm的膠體金溶液，用濃度為0. 1 M的碳酸鉀(K2CO3)溶液調節膠體金溶液的PH值至8. 5 9. 5，得調節後膠體金溶液A ；將濃度為Img 2 mg /ml的兔抗目標檢測物抗體溶液與濃度為1 mg 2 mg /mL的牛血清白蛋白(BSA)溶液以摩爾比1 :100混合，得混合溶液；取混合溶液10 μ L加入到1 mL調節後膠體金溶液A中，室溫下振蕩反應15min ； 在溫度4°C條件下，以10000 rpm的速度離心20 min，去除上清未結合的抗體和牛血清白蛋白(BSA)；將離心得到的沉澱重新分散於磷酸緩衝溶液(PBS)中，得到目標檢測物金標免疫探針；(2)金標信號擴增探針的製備選取粒徑為15 20 nm的膠體金溶液，用濃度為0.1 M的碳酸鉀(K2CO3)溶液調節膠體金溶液的PH值至8. 5 9. 5，得調節後膠體金溶液B ；以1 :1000 1 :3000的標記比例將濃度為lmg/mL的牛血清白蛋白(BSA)抗體溶液加入到調節後膠體金溶液B中，室溫下反應15min ；溫度4°C條件下，以10000 rpm的速度離心 20 min後，去除上清中未結合的牛血清白蛋白(BSA)抗體；將離心得到的沉澱重新分散於磷酸緩衝溶液(PBS)中，得到金標信號擴增探針；(3)目標檢測物免疫探針金標墊和目標檢測物信號擴增金標墊的製備將目標檢測物金標免疫探針和金標信號擴增探針分別噴塗到兩塊玻璃纖維膜上，得到目標檢測物免疫探針金標墊和目標檢測物信號擴增金標墊；(4)具有檢測線和參照線的硝酸纖維膜的製備在一塊硝酸纖維膜上用濃度為lmg/mL的目標檢測物-卵清蛋白偶聯物溶液和濃度為 lmg/mL的羊抗兔抗體溶液分別畫兩條線平行的線，目標檢測物-卵清蛋白偶聯物劃線作為檢測線，羊抗兔抗體溶液劃線為參照線；(5)信號增強型免疫層析金標試紙條的製備將樣品玻璃纖維膜、目標檢測物免疫探針金標墊、目標檢測物信號擴增金標墊、具有檢測線和參照線的硝酸纖維膜和吸水玻璃纖維膜五種粘貼物分別依次粘貼到塑料襯板上；相鄰粘貼物之間的重疊部分的長度為2 mm，得到信號增強型超靈敏檢測金標試紙條，乾燥封裝，溫度4°C 常溫條件下保存。
所述步驟1中的兔抗目標檢測物抗體為兔抗雙酚A抗體，兔抗鄰苯二甲酸酯抗體或兔抗萊科多巴胺抗體。
本發明的有益技術效果體現在以下方面1、本發明將納米粒子比表面積大這一顯著特點應用於傳統的金標試紙條的建立和相應的檢測方法，建立了可用於現場快速超靈敏檢測的信號增強型膠體金標記試紙條和相關的檢測方法，通過肉眼直接觀察實現目標檢測物的快速定性檢測和通過檢測條帶上顯色程度的降低對目標檢測物進行定量檢測。無需其他輔助儀器設備，檢測工作可在10-15分鐘內完成並得到檢測結果；2、本發明最為核心的部分為通過信號增強功能的設計，能夠顯著提高傳統試紙條檢測方法的靈敏度，實現傳統試紙條無法實現的低濃度特定目標物的超靈敏檢測；3、本發明為通用型免疫層析膠體金標記試紙條，只需將試紙條中免疫識別探針所用的抗體進行相應替換，即可實現其他目標物的檢測；4、本發明還具有特異性高，穩定性好，應用範圍廣，成本低廉，操作使用方法簡單易於推廣應用。可應用於醫院、家庭、以及食品安全與檢驗檢疫的海關、機場等口岸等需要現場快速檢測機構。
圖1為信號增強型金標試紙條的側面結構示意圖。
圖1中序號樣品玻璃纖維膜1、免疫探針金標墊2、信號擴增金標墊3、具有檢測線和參照線的硝酸纖維膜4、吸水玻璃纖維膜5、塑料襯板10、檢測線11、參照線12。
圖2為信號增強型金標試紙條的正面檢測結果示意圖。
具體實施方式
下面結合實施例，對本發明作進一步地描述。
實施例1一種信號增強型雙酚A免疫層析金標試紙條的製備方法具體操作步驟如下 (1)兔抗雙酚A金標免疫探針的製備選取粒徑為40nm的膠體金溶液，用濃度為0. 1 M的碳酸鉀(K2CO3)溶液調節膠體金溶液的PH值至8. 5，得調節後膠體金溶液A ；將濃度為Img /mL的兔抗雙酚A抗體溶液與濃度為1 mg /mL的牛血清白蛋白(BSA)溶液以摩爾比1 :100混合，得混合溶液；取混合溶液10 μ L加入到1 mL調節後膠體金溶液A中，室溫下振蕩反應15min ； 在溫度4°C條件下，以10000 rpm的速度離心20 min，去除上清未結合的抗體和牛血清白蛋白(BSA)；將離心得到的沉澱重新分散於磷酸緩衝溶液(PBS)中，得到兔抗雙酚A金標免疫探針； (2)兔抗雙酚A金標信號擴增探針的製備選取粒徑為20 nm的膠體金溶液，用濃度為0.1 M的碳酸鉀(K2CO3)溶液調節膠體金溶液的PH值至8. 5，得調節後膠體金溶液B ；以1 :1000的標記比例將濃度為lmg/mL的牛血清白蛋白(BSA)抗體溶液加入到調節後膠體金溶液B中，室溫下反應15min ；溫度4°C條件下，以10000 rpm的速度離心20 min後， 去除上清中未結合的牛血清白蛋白(BSA)抗體；將離心得到的沉澱重新分散於磷酸緩衝溶液(PBS)中，得到兔抗雙酚A金標信號擴增探針；(3)兔抗雙酚A免疫探針金標墊和兔抗雙酚A信號擴增金標墊的製備將兔抗雙酚A金標免疫探針和兔抗雙酚A金標信號擴增探針分別噴塗到兩塊玻璃纖維膜上，得到兔抗雙酚A免疫探針金標墊和兔抗雙酚A信號擴增金標墊；(4)具有檢測線和參照線的硝酸纖維膜的製備在一塊硝酸纖維膜上用濃度為lmg/mL的雙酚A-卵清蛋白偶聯物溶液和濃度為lmg/mL 的羊抗兔抗體溶液分別畫兩條線平行的線，兔抗雙酚A-卵清蛋白偶聯物劃線作為檢測線， 羊抗兔抗體溶液劃線為參照線；(5)信號增強型雙酚A免疫層析金標試紙條的製備參見圖1，在塑料襯板10上分別依次粘貼樣品玻璃纖維膜1、兔抗雙酚A免疫探針金標墊2、兔抗雙酚A信號擴增金標墊3、具有檢測線和參照線的硝酸纖維膜4和吸水玻璃纖維膜5 ；相鄰粘貼物之間的重疊部分的長度為2 mm，得到信號增強型雙酚A超靈敏檢測金標試紙條，乾燥封裝，溫度4°C 常溫條件下保存。
使用時，將信號增強型兔抗雙酚A金標試紙條的樣品玻璃纖維膜端插入到待檢測的溶液中，等待10 min後取出用肉眼觀察檢測結果。如果膜上的檢測條帶和對照條帶同時顯色表明檢測結果是有效的；與空白對照組的檢測條帶相比較，如果檢測組的檢測條帶顏色變淺表明待檢測溶液中含有目標物兔抗雙酚A，顯色越淺檢測溶液中兔抗雙酚A濃度越高，為陽性結果；如只有檢測條帶顯色而對照條帶不顯色，表明檢測結果無效。
實施例2:一種信號增強型鄰苯二甲酸酯免疫層析金標試紙條的製備方法具體操作步驟如下(1)兔抗鄰苯二甲酸酯金標免疫探針的製備選取粒徑為30nm的膠體金溶液，用濃度為0. 1 M的碳酸鉀(K2C03)溶液調節膠體金溶液的PH值至9. 5，得調節後膠體金溶液A ；將濃度為ang /mL的兔抗鄰苯二甲酸酯抗體溶液與濃度為aiig /mL的牛血清白蛋白 (BSA)溶液以摩爾比1 :100混合，得混合溶液；取混合溶液10 μ L加入到1 mL調節後膠體金溶液A中，室溫下振蕩反應15min ； 在溫度4°C條件下，以10000 rpm的速度離心20 min，去除上清未結合的抗體和牛血清白蛋白(BSA)；將離心得到的沉澱重新分散於磷酸緩衝溶液(PBS)中，得到兔抗鄰苯二甲酸酯金標免疫探針；(2)兔抗鄰苯二甲酸酯金標信號擴增探針的製備選取粒徑為15nm的膠體金溶液，用濃度為0. 1 M的碳酸鉀(K2C03)溶液調節膠體金溶液的PH值至9. 5，得調節後膠體金溶液B ；以1 :3000的標記比例將濃度為lmg/mL的牛血清白蛋白(BSA)抗體溶液加入到調節後膠體金溶液B中，室溫下反應15min ；溫度4°C條件下，以10000 rpm的速度離心20 min後， 去除上清中未結合的牛血清白蛋白(BSA)抗體；將離心得到的沉澱重新分散於磷酸緩衝溶液(PBS)中，得到兔抗鄰苯二甲酸酯金標信號擴增探針；(3)兔抗鄰苯二甲酸酯免疫探針金標墊和兔抗鄰苯二甲酸酯信號擴增金標墊的製備將兔抗鄰苯二甲酸酯免疫探針和兔抗鄰苯二甲酸酯信號擴增探針分別噴塗到兩塊玻璃纖維膜上，分別得到兔抗鄰苯二甲酸酯免疫探針金標墊和兔抗鄰苯二甲酸酯信號擴增金標墊；(4)具有檢測線和參照線的硝酸纖維膜的製備在一塊硝酸纖維膜上用濃度為0. 5 mg/mL的兔抗鄰苯二甲酸酯-卵清蛋白偶聯物溶液和濃度為0. 5 mg/mL的羊抗兔抗體溶液分別畫兩條線平行的線，兔抗鄰苯二甲酸酯-卵清蛋白偶聯物劃線作為檢測線，羊抗兔抗體溶液劃線為參照線；(5)信號增強型兔抗鄰苯二甲酸酯免疫層析金標試紙條的製備參見圖1，在塑料襯板1上分別依次粘貼樣品玻璃纖維膜2、兔抗鄰苯二甲酸酯免疫探針金標墊3、兔抗鄰苯二甲酸酯信號擴增金標墊4、具有檢測線和參照線的硝酸纖維膜5和吸水玻璃纖維膜6 ；相鄰粘貼物之間的重疊部分的長度為2 mm，得到信號增強型鄰苯二甲酸酯超靈敏檢測金標試紙條，乾燥封裝，溫度4°C 常溫條件下保存。
實施例3一種信號增強型兔抗萊科多巴胺免疫層析金標試紙條的製備方法具體操作步驟如下(1)兔抗萊科多巴胺金標免疫探針的製備選取粒徑為30nm的膠體金溶液，用濃度為0. 1 M的碳酸鉀(K2CO3)溶液調節膠體金溶液的PH值至9. 5，得調節後膠體金溶液A ；將濃度為ang /mL的兔抗萊科多巴胺抗體溶液與濃度為aiig /mL的牛血清白蛋白 (BSA)溶液以摩爾比1 :100混合，得混合溶液；取混合溶液10 μ L加入到1 mL調節後膠體金溶液A中，室溫下振蕩反應15min ； 在溫度4°C條件下，以10000 rpm的速度離心20 min，去除上清未結合的抗體和牛血清白蛋白(BSA)；將離心得到的沉澱重新分散於磷酸緩衝溶液(PBS)中，得到兔抗萊科多巴胺金標免疫探針；(2)兔抗萊科多巴胺金標信號擴增探針的製備選取粒徑為15nm的膠體金溶液，用濃度為0. 1 M的碳酸鉀(K2CO3)溶液調節膠體金溶液的PH值至9. 5，得調節後膠體金溶液B ；以1 :3000的標記比例將濃度為lmg/mL的牛血清白蛋白(BSA)抗體溶液加入到調節後膠體金溶液B中，室溫下反應15min ；溫度4°C條件下，以10000 rpm的速度離心20 min後， 去除上清中未結合的牛血清白蛋白(BSA)抗體；將離心得到的沉澱重新分散於磷酸緩衝溶液(PBS)中，得到兔抗萊科多巴胺金標信號擴增探針；(3)兔抗萊科多巴胺免疫探針金標墊和兔抗萊科多巴胺信號擴增金標墊的製備將兔抗萊科多巴胺免疫探針和兔抗萊科多巴胺信號擴增探針分別噴塗到兩塊玻璃纖維膜上，分別得到兔抗萊科多巴胺免疫探針金標墊和兔抗萊科多巴胺信號擴增金標墊；(4)具有檢測線和參照線的硝酸纖維膜的製備在一塊硝酸纖維膜上用濃度為0. 5 mg/mL的兔抗萊科多巴胺-卵清蛋白偶聯物溶液和濃度為0. 5 mg/mL的羊抗兔抗體溶液分別畫兩條線平行的線，兔抗萊科多巴胺-卵清蛋白偶聯物劃線作為檢測線，羊抗兔抗體溶液劃線為參照線；(5)信號增強型兔抗萊科多巴胺免疫層析金標試紙條的製備參見圖1，在塑料襯板1上分別依次粘貼樣品玻璃纖維膜2、兔抗萊科多巴胺免疫探針金標墊3、兔抗萊科多巴胺信號擴增金標墊4、具有檢測線和參照線的硝酸纖維膜5和吸水玻璃纖維膜6 ；相鄰粘貼物之間的重疊部分的長度為2 mm，得到信號增強型兔抗萊科多巴胺超靈敏檢測金標試紙條，乾燥封裝，溫度4°C 常溫條件下保存。
實施例4:參見圖2，其中序號2為樣品玻璃纖維膜，長度為18mm ；序號3為金標免疫識別探針墊， 長度為4 mm ；序號4為金標信號擴增探針墊，長度為4 mm ；序號5為硝酸纖維膜，長度為20 mm;序號6為吸水墊，長度為18 mm，序號11為檢測線，寬度為1mm，序號12為參照線，寬度為1 mm。圖中箭頭表示液體毛細作用方向。
圖2為利用信號增強性膠體金標記試紙條進行目標物檢測過程中，檢測結果的判斷依據。如何通過信號增強型金標試紙條的檢測結果對檢測樣品中目標物的含量進行判斷，是檢測方法的重要組成部分。具體檢測結果判斷依據如下所示圖2中左一為信號增強型金標試紙條的陰性檢測結果示意圖， 圖2中左二為信號增強型金標試紙條的弱陽性檢測結果示意圖， 圖2中右一為信號增強型金標試紙條的陽性檢測結果示意圖，圖2中右二為無效的信號增強型金標試紙條檢測結果示意圖。
權利要求
1.一種信號增強型免疫層析金標試紙條，其特徵在於金標試紙條包括塑料襯板，所述塑料襯板上分別依次粘貼有樣品玻璃纖維膜，免疫探針金標墊，信號擴增金標墊，硝酸纖維膜和吸水玻璃纖維膜五種粘貼物；相鄰粘貼物之間重疊部分的長度為2 mm，乾燥封裝，溫度4°C 常溫條件下保存。
2.一種信號增強型免疫層析金標試紙條的製備方法，其特徵在於具體製備操作步驟如下(1)目標檢測物金標免疫探針的製備選取粒徑為30 40nm的膠體金溶液，用濃度為0. 1 M的碳酸鉀(K2CO3)溶液調節膠體金溶液的PH值至8. 5 9. 5，得調節後膠體金溶液A ；將濃度為Img 2 mg /ml的兔抗目標檢測物抗體溶液與濃度為1 mg 2 mg /mL的牛血清白蛋白(BSA)溶液以摩爾比1 :100混合，得混合溶液；取混合溶液10 μ L加入到1 mL調節後膠體金溶液A中，室溫下振蕩反應15min ；在溫度4°C條件下，以10000 rpm的速度離心20 min，去除上清未結合的抗體和牛血清白蛋白(BSA)；將離心得到的沉澱重新分散於磷酸緩衝溶液(PBS)中，得到目標檢測物金標免疫探針； (2)金標信號擴增探針的製備選取粒徑為15 20 nm的膠體金溶液，用濃度為0.1 M的碳酸鉀(K2CO3)溶液調節膠體金溶液的PH值至8. 5 9. 5，得調節後膠體金溶液B ；以1 :1000 1 :3000的標記比例將濃度為lmg/mL的牛血清白蛋白(BSA)抗體溶液加入到調節後膠體金溶液B中，室溫下反應15min ；溫度4°C條件下，以10000 rpm的速度離心 20 min後，去除上清中未結合的牛血清白蛋白(BSA)抗體；將離心得到的沉澱重新分散於磷酸緩衝溶液(PBS)中，得到金標信號擴增探針；(3)目標檢測物免疫探針金標墊和目標檢測物信號擴增金標墊的製備將目標檢測物金標免疫探針和金標信號擴增探針分別噴塗到兩塊玻璃纖維膜上，得到目標檢測物免疫探針金標墊和目標檢測物信號擴增金標墊；(4)具有檢測線和參照線的硝酸纖維膜的製備在一塊硝酸纖維膜上用濃度為lmg/mL的目標檢測物-卵清蛋白偶聯物溶液和濃度為 lmg/mL的羊抗兔抗體溶液分別畫兩條線平行的線，目標檢測物-卵清蛋白偶聯物劃線作為檢測線，羊抗兔抗體溶液劃線為參照線；(5)信號增強型免疫層析金標試紙條的製備將樣品玻璃纖維膜、目標檢測物免疫探針金標墊、目標檢測物信號擴增金標墊、具有檢測線和參照線的硝酸纖維膜和吸水玻璃纖維膜五種粘貼物分別依次粘貼到塑料襯板上；相鄰粘貼物之間的重疊部分的長度為2 mm，得到信號增強型超靈敏檢測金標試紙條，乾燥封裝，溫度4°C 常溫條件下保存。
3.根據權利要求2所述的一種信號增強型免疫層析金標試紙條的製備方法，其特徵在於所述步驟1中的兔抗目標檢測物抗體為兔抗雙酚A抗體，兔抗鄰苯二甲酸酯抗體或兔抗萊科多巴胺抗體。
全文摘要
本發明公開了一種信號增強型免疫層析金標試紙條及其製備方法。所述金標試紙條的製備步驟如下(1)不同粒徑膠體金納米粒子的合成；(2)膠體金免疫檢測探針的製備；(3)膠體金信號增強探針的製備；(4)信號增強型試紙條的裝配；(5)信號增強型試紙條檢測方法的建立。本發明可用於現場快速超靈敏檢測，無需其他輔助儀器設備。檢測工作可在10-15分鐘內完成並得到檢測結果；能夠顯著提高傳統試紙條檢測方法的靈敏度，實現傳統試紙條無法實現的低濃度特定目標物的超靈敏檢測；本發明只需將試紙條中免疫識別探針所用的抗體進行相應替換，即可實現其他目標物的檢測；本發明還具有特異性高，穩定性好，應用範圍廣，成本低廉等優點，易於推廣應用。
文檔編號G01N33/531GK102507929SQ20111033181
公開日2012年6月20日 申請日期2011年10月28日 優先權日2011年10月28日
發明者餘曉峰, 劉永勝, 吳晶晶, 梅佔龍, 胥傳來, 鄭磊, 陳偉, 陳寒清 申請人:合肥工業大學