萊克多巴胺-克倫特羅螢光微球檢測試紙條及製備與應用的製作方法

2023-05-29 06:06:21 1

專利名稱：萊克多巴胺-克倫特羅螢光微球檢測試紙條及製備與應用的製作方法
技術領域：
本發明屬於食品安全檢驗領域，涉及一種萊克多巴胺-克倫特羅螢光微球檢測試紙條及製備與應用。
背景技術：
萊克多巴胺(RAC)和克倫特羅(CL)同屬興奮劑類藥物，能夠加強心臟收縮、擴張骨骼肌血管和支氣管平滑肌，獸醫學和醫學上用於治療休克和支氣管痙攣。由於這兩種藥物能促進動物骨骼肌增生，一些養殖戶非法將其用作飼料添加劑，以提高禽畜產品的瘦肉率，增加經濟效益。我國已明令禁止生產、銷售和使用這兩種物質。萊克多巴胺(RAC)和克倫特羅(CL)被動物攝入後會殘留於動物的肌肉、肝、肺組織中，人食用這些組織後會出現一系列的毒副反應，如血壓升高、血管擴張、心跳加快、呼吸加劇、體溫升高、肌肉顫抖，頭痛、暈眩、神經過敏、肌肉痛疼、心悸、噁心、嘔吐等症狀，特別是對高血壓、心臟病、甲亢和前列腺肥大等疾病患者危害更大，嚴重的可導致死亡，孕婦中毒可導致癌變、胎兒致畸。 螢光微球標記層析檢測技術是繼膠體金標記技術以後，在螢光染料標記技術上發展起來的，作為一種免疫學檢測方法，它是免疫親和技術、免疫標記技術、免疫層析技術的結合，它與膠體金標記層析技術一樣具有快速、穩定、操作簡便等優點。突光微球標記層析技術是將不同粒徑的突光微球與含有氨基、羧基、輕基、巰基的生物大分子物質結合，當螢光微球標記的蛋白質(抗原/抗體)被包被在硝酸纖維素膜上的抗原/抗體捕獲時，螢光微球在相應的區域內聚集，在一定波長範圍的激發光照射下，發出特定顏色的可見光，從而被人眼或者儀器識別。目前國內外檢測萊克多巴胺(RAC)、克倫特羅(CL)的主要方法有高效液相色譜法(HLCP)、液相色譜-質譜聯用法(LC-MC)、氣相色譜-質譜聯用法(GC-MC)、酶聯免疫吸附法(ELISA)和膠體金免疫層析技術。這些方法都存在著不同程度的缺陷。高效液相色譜法(HLCP )、液相色譜-質譜聯用法(LC-MC)、氣相色譜質譜聯用法(GC-MC)屬理化檢測方法，這幾種方法靈敏度高、特異性好，但操作複雜、樣品前處理過程較長、檢測設備昂貴且需要專業的操作人員。酶聯免疫吸附法(ELISA)和膠體金免疫層析技術屬免疫學檢測技術，ELISA方法檢測靈敏度較高，有許多加樣和洗滌步驟，流程相對繁瑣和耗時，顯色所用的底物有致癌性，讀值所用的酶標儀價格也相對昂貴；膠體金免疫層析技術操作簡便、快速，但靈敏度低，只適合大量樣品的初篩且要接觸重金屬離子。相比上述檢測方法，螢光微球標記層析檢測技術同時具有檢測靈敏度高、操作簡便的優點。

發明內容
為了克服以上現有技術的不足，本發明的首要目的在於提供一種萊克多巴胺-克倫特羅螢光微球檢測試紙條。本發明的另一目的在於提供所述的萊克多巴胺-克倫特羅螢光微球檢測試紙條的製備方法。本發明的再一目的在於提供所述的萊克多巴胺-克倫特羅螢光微球檢測試紙條的應用。本發明的目的通過以下技術方案實現一種萊克多巴胺-克倫特羅螢光微球檢測試紙條，包含附著於底板上且依次緊密相連的樣品吸收墊、結合墊、層析膜和吸水墊；其中，結合墊上含有螢光聚苯乙烯微球標記蛋白；層析膜上設置有兩條檢測線和一條質控線，檢測線靠近結合墊，質控線靠近吸水墊；一條檢測線上包被有萊克多巴胺蛋白質偶聯物，另一條檢測線上包被有克倫特羅蛋白質偶聯物，質控線上包被有能與螢光聚苯乙烯微球標記蛋白中的蛋白結合且不和萊克多巴胺和克倫特羅結合的蛋白偶聯物；螢光聚苯乙烯微球標記蛋白為螢光聚苯乙烯微球標記的萊克多巴胺單克隆抗體和螢光聚苯乙烯微球標記的克倫特羅單克隆抗體；所述的樣品吸收墊的材質優選為玻璃纖維膜； 所述的結合墊的材質優選為聚酯膜；所述的層析膜的材質優選為硝酸纖維素膜；所述的吸水墊的材質優選為吸水紙；所述的質控線優選由羊抗鼠免疫球蛋白G溶液製備得到；所述的螢光聚苯乙烯微球標記蛋白優選通過如下方法製備得到(I)螢光聚苯乙烯微球的活化將螢光聚苯乙烯微球分散於吐溫-20水溶液中，得到螢光聚苯乙烯微球懸液，離心，收集沉澱；沉澱用4-嗎啉乙磺酸(MES)緩衝溶液溶解後，加入I-乙基-3-(3- 二甲基氨基丙基)碳醯二亞胺(EDC)，再加入N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)，混勻後反應30 60min，離心洗滌沉澱，再用MES緩衝液溶解沉澱，得到活化後的螢光聚苯乙烯微球懸液；其中，I-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳醯二亞胺與螢光聚苯乙烯微球按30 50mg/ (I. 5 X IO11個)配比；N_羥基琥珀醯亞胺與螢光聚苯乙烯微球按20 30mg/ (I. 5X IO11 個)配比；(2)螢光聚苯乙烯微球標記蛋白溶液的製備將萊克多巴胺單克隆抗體和克倫特羅單克隆抗體加入到步驟(I)製備的活化後的螢光聚苯乙烯微球懸液中，混勻後攪拌反應I 3h ;接著加入甘氨酸，攪拌反應O. 5 2h，離心洗滌，沉澱用封閉溶液溶解後進行超聲處理，得到封閉後的螢光微球標記抗體懸液；步驟(I)中所述的螢光聚苯乙烯微球的直徑為50 200nm ;優選的直徑為130nm ；步驟(I)中所述的吐溫-20水溶液的濃度優選為體積百分比O. 5% ；步驟(I)中所述離心的條件優選為12000 13000rpm離心15 30min ；步驟(I)中所述的4-嗎啉乙磺酸緩衝液優選為O. 1Μ、ρΗ值為5. 5的4_嗎啉乙磺酸緩衝液；步驟(I)中所述的所述離心洗滌沉澱的次數為2 3次，離心轉速為10000 IlOOOrpm,每次離心I 2min ；步驟(2)中所述的萊克多巴胺單克隆抗體與所述的螢光聚苯乙烯微球按質量比20 IOOyg/ (I. 5 X IO11 個)配比，優選為 60 μ g/ (I. 5 X IO11 個)配比;步驟(2)中所述的克倫特羅單克隆抗體與所述的螢光聚苯乙烯微球按質量比20 IOOyg/ (I. 5 X IO11 個)配比，優選為 60 μ g/ (I. 5 X IO11 個)配比;
步驟(2)中所述的甘氨酸的作用為通過甘氨酸的氨基將螢光聚苯乙烯微球上的羧基封閉住；用量優選為每I. 5 X IO11個螢光聚苯乙烯微球使用O. 01 O. 03mol甘氨酸；步驟(2)中所述的離心洗滌的次數為2 3次，離心轉速為7000 9000rpm，每次離心I 2min ；步驟(2)中所述的封閉溶液為含40 60% (w/v)鹿糖、I 2% (w/v)牛血清白蛋白(BSA)和I 2% (v/v)吐溫-20 (Tween-20)的磷酸鹽緩衝液；磷酸鹽緩衝液的濃度為O. 015M, pH 值為 7. 4 ；步驟(2)中所述的超聲處理的條件為100W、2 4min ；所述的萊克多巴胺蛋白質偶聯物是將萊克多巴胺偶聯到蛋白質得到的，其中的蛋白質不參與反應；優選可通過N-羥基琥珀醯亞胺和二環己基碳二亞胺的作用，將萊克多巴胺偶聯到蛋白上；
所述的蛋白優選為牛血清白蛋白；所述的萊克多巴胺蛋白質偶聯物更優選通過包含如下步驟的方法得到I)將鹽酸萊克多巴胺和琥珀酸酐溶於無水吡啶中，攪拌反應後乾燥，得到衍生物；2)將衍生物溶解於N，N』 - 二甲基甲醯胺(DMF)中，加入N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)和二環己基碳二亞胺(DCC)攪拌條件下反應過夜；離心，取上清；3)將步驟2)得到的上清滴加入2 8°C預冷的牛血清白蛋白溶液中，2 8°C攪拌反應過夜，2 8°C離心，取上清，將上清置於磷酸鹽緩衝液中於2 8°C透析，得到萊克多巴胺蛋白質偶聯物；其中，鹽酸萊克多巴胺、琥珀酸酐、N-羥基琥珀醯亞胺、二環己基碳二亞胺和牛血清白蛋白按質量比50 15 11 :20 250進行配比；所述的牛血清白蛋白溶液為將牛血清白蛋白溶於磷酸鹽緩衝液得到；所述的磷酸鹽緩衝液的濃度為O. 015M，pH值為7. 4 ;步驟I)中所述的攪拌反應的時間優選為24h ；步驟2)中所述的離心的轉速優選為IOOOrpm ；步驟3)中所述的磷酸鹽緩衝液的濃度為O. 015M，pH值為7. 4 ;步驟3)中所述的透析的時間優選為2 4天；所述的克倫特羅蛋白質偶聯物是將克倫特羅偶聯到蛋白質得到的，其中的蛋白質不參與反應；所述的克倫特羅蛋白質偶聯物更優選通過包含如下步驟的方法得到①將鹽酸克倫特羅溶於鹽酸溶液中，預冷至2 8°C後加入亞硝酸鈉溶液進行反應，一邊加入亞硝酸鈉溶液，一邊用澱粉碘化鉀試紙檢測，當澱粉碘化鉀試紙顯示為棕紫色，停止加入亞硝酸鈉溶液，加入尿素終止反應，得到淡黃色的溶液A ；②將步驟①製備的溶液A滴加入2 8°C預冷的牛血清白蛋白溶液中，2 8°C攪拌反應過夜，得到橙黃色的溶液B ；③將步驟②製備的溶液B置於磷酸鹽緩衝液中於2 8°C透析，得到克倫特羅蛋白質偶聯物；鹽酸克倫特羅與牛血清白蛋白按質量比1:4 1:6進行配比，更優選為按質量比1:5配比；步驟①中所述的鹽酸溶液的濃度優選為O. 28 O. 29mol/L ；步驟②中所述的牛血清白蛋白溶液為將牛血清白蛋白溶於磷酸鹽緩衝液得到；所述的磷酸鹽緩衝液的濃度為O. 015M，pH值為7. 4 ;步驟③中所述的磷酸鹽緩衝液的濃度為O. 015M，pH值為7. 4 ；一種萊克多巴胺-克倫特羅螢光微球檢測試卡，含有上述萊克多巴胺-克倫特羅螢光微球檢測試紙條和外殼；外殼包裹住所述的萊克多巴胺-克倫特羅螢光微球檢測試紙條，其中在外殼上開有加樣孔和觀察孔，加樣孔正對著萊克多巴胺-克倫特羅螢光微球檢測試紙條的樣品吸收墊，觀察孔正對著萊克多巴胺-克倫特羅螢光微球檢測試紙條的檢測線Tl、檢測線T2和質控線C所在區域；
所述的萊克多巴胺-克倫特羅螢光微球檢測試紙條的製備方法，包括以下操作步驟I、萊克多巴胺蛋白質偶聯物的製備將鹽酸萊克多巴胺和琥珀酸酐溶於無水吡啶中，攪拌反應後乾燥，得到衍生物；將衍生物溶解於N，N』 - 二甲基甲醯胺(DMF)中，加入N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)和二環己基碳二亞胺(DCC)攪拌條件下反應過夜；離心，取上清A ；將上清A滴加入2 8°C預冷的牛血清白蛋白溶液中，2 8°C攪拌反應過夜，2 8°C離心，取上清B，將上清B置於磷酸鹽緩衝液中於2 8°C透析，得到萊克多巴胺蛋白質偶聯物；其中，鹽酸萊克多巴胺、琥珀酸酐、N-羥基琥珀醯亞胺、二環己基碳二亞胺和牛血清白蛋白按質量比50 15 11 :20 250進行配比；II、克倫特羅蛋白質偶聯物的製備將鹽酸克倫特羅溶於鹽酸溶液中，預冷至2 8°C後加入亞硝酸鈉溶液進行反應，一邊加入亞硝酸鈉溶液，一邊用澱粉碘化鉀試紙檢測，當澱粉碘化鉀試紙顯示為棕紫色，停止加入亞硝酸鈉溶液，加入尿素終止反應，得到淡黃色的溶液A ;將溶液A滴加入2 8°C預冷的牛血清白蛋白溶液中，2 8°C攪拌反應過夜，得到橙黃色的溶液B ;將溶液B置於磷酸鹽緩衝液中於2 8°C透析，得到克倫特羅蛋白質偶聯物；其中，鹽酸克倫特羅與牛血清白蛋白按質量比1:4 1:6進行配比；III、螢光聚苯乙烯微球標記蛋白的製備(I)螢光聚苯乙烯微球的活化將螢光聚苯乙烯微球分散於吐溫-20水溶液中，得到螢光聚苯乙烯微球懸液，離心，收集沉澱；沉澱用4-嗎啉乙磺酸(MES)緩衝溶液溶解後，加入I-乙基-3-(3- 二甲基氨基丙基)碳醯二亞胺(EDC)，再加入N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)，混勻後反應30 60min，離心洗滌沉澱，再用MES緩衝液溶解沉澱，得到活化後的螢光聚苯乙烯微球懸液；其中，I-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳醯二亞胺與螢光聚苯乙烯微球按30 50mg/ (I. 5 X IO11個)配比；N_羥基琥珀醯亞胺與螢光聚苯乙烯微球按20 30mg/ (I. 5X IO11 個)配比；(2)螢光聚苯乙烯微球標記蛋白溶液的製備將萊克多巴胺單克隆抗體和克倫特羅單克隆抗體加入到步驟(I)製備的活化後的螢光聚苯乙烯微球懸液中，混勻後攪拌反應I 3h ;接著加入甘氨酸，攪拌反應O. 5 2h，離心洗滌，沉澱用封閉溶液溶解後進行超聲處理，得到封閉後的螢光微球標記抗體懸液；IV、含有螢光微球標記蛋白的聚酯膜的製備在聚酯膜上均勻噴塗步驟III製備的封閉後的螢光微球標記抗體懸液，烘乾，得到塗抹螢光微球標記蛋白的聚酯膜；
V、包被抗原或抗體的硝酸纖維素膜的製備將步驟I製備的萊克多巴胺蛋白質偶聯物、步驟II製備的克倫特羅蛋白質偶聯物、羊抗鼠免疫球蛋白G分別用包被溶液稀釋，得到萊克多巴胺蛋白質偶聯物溶液、克倫特羅蛋白質偶聯物溶液和羊抗鼠免疫球蛋白G溶液，將以上三種溶液依次噴於硝酸纖維素膜上，分別為檢測線Tl、檢測線T2和質控線C，檢測線Tl、檢測線T2和質控線C三線間隔同為3_，烘乾，得到包被後的硝酸纖維素膜；包被溶液的組成如下十二水磷酸氫二鈉28. 94g、磷酸二氫鉀2. 61g、氯化鈉8. 0g、氯化鉀O. 2g、二乙烯三胺五乙酸O. 06g,蒸懼水定容至IOOOml ；VI、試紙條的製備首先，在底板的中心黏貼上層析膜，即步驟V製備的包被抗原或抗體的硝酸纖維素膜；在層析膜靠近質控線C的一端搭接黏貼上吸水墊；在層析膜的另一端搭接黏貼上結合墊，即步驟IV製備的含有螢光微球標記蛋白的聚酯膜；在結合墊的另一端搭接黏貼上樣品吸收墊，得到萊克多巴胺-克倫特羅螢光微球檢測試紙條。步驟I中所述的攪拌反應的時間優選為24h ;所述的離心的轉速優選為IOOOrpm ；所述的磷酸鹽緩衝液的濃度為O. 015M，pH值為7. 4 ;所述的透析的時間優選為2 4天；
步驟II中所述的鹽酸溶液的濃度優選為O. 28 O. 29mol/L ;所述的磷酸鹽緩衝液的濃度為O. 015M，pH值為7. 4 ;步驟III (I)中所述的螢光聚苯乙烯微球的直徑為50 200nm ;優選的直徑為130nm ；步驟III (I)中所述的吐溫-20水溶液的濃度優選為體積百分比O. 5% ；步驟III (I)中所述的離心的條件優選為12000 13000rpm離心15 30min ；步驟III (I)中所述的4-嗎啉乙磺酸緩衝液優選為O. 1Μ、ρΗ值為5. 5的4_嗎啉乙磺酸緩衝液；步驟III (I)中所述的離心洗滌沉澱的次數為2 3次，離心轉速為10000 IlOOOrpm,每次離心I 2min ；步驟III (2)中所述的萊克多巴胺單克隆抗體與所述的螢光聚苯乙烯微球按質量比 20 IOOyg/ (I. 5 X IO11 個)配比，優選為 60 μ g/ (I. 5 X IO11 個)配比;步驟III (2)中所述的克倫特羅單克隆抗體與所述的螢光聚苯乙烯微球按質量比20 IOOyg/ (I. 5 X IO11 個)配比，優選為 60 μ g/ (I. 5 X IO11 個)配比;步驟III (2)中所述的甘氨酸的作用為通過甘氨酸的氨基將螢光聚苯乙烯微球上的羧基封閉住；用量優選為每I. 5X1011個螢光聚苯乙烯微球使用O. 01 O. 03mol甘氨酸；步驟III (2)中所述的離心洗滌的次數為2 3次，離心轉速為7000 9000rpm，每次離心I 2min ；步驟III (2)中所述的封閉溶液為含40 60% (w/v)蔗糖、I 2% (w/v)牛血清白蛋白(BSA)和I 2% (v/v)吐溫-20 (Tween-20)的磷酸鹽緩衝液；磷酸鹽緩衝液的濃度為 O. 015M, pH 值為 7. 4 ；步驟III (2)中所述的超聲處理的條件為100W、2 4min ；步驟V中所述的羊抗鼠免疫球蛋白G溶液的濃度為O. 25 lmg/ml包被溶液；步驟V中所述的萊克多巴胺蛋白質偶聯物溶液的濃度為O. 05 O. 3mg/ml包被溶液；步驟V中所述的鹽酸克倫特羅蛋白質偶聯物溶液的濃度為O. 05 O. 3mg/ml包被溶液；步驟V中所述的烘乾的條件是37°C乾燥72h ；所述的萊克多巴胺-克倫特羅螢光微球檢測試紙條的應用，包含以下步驟 (I)當檢測樣品為液體樣品時，直接將樣品滴加於樣品吸收塾上，IOmin後在450nm激發光照射下判讀結果；(2)當檢測樣品為固體樣品時，將固體樣品進行消解，再將消解後得到的溶液滴加於樣品吸收墊上，IOmin後在450nm激發光照射下判讀結果；(3)結果的判斷①當檢測線Tl、檢測線T2和質控線C在450nm激發光照射下同時顯現綠色螢光印 跡，表示檢測結果為陰性，說明被檢測樣本中不含克倫特羅和萊克多巴胺或含有克倫特羅和萊克多巴胺的濃度小於2ng/ml ；②當檢測線Tl、檢測線T2在450nm激發光照射下不顯現綠色螢光印跡，只有質控線C在激發光下同時顯現綠色螢光印跡，表示檢測結果為陽性，說明被檢測樣品中同時含克倫特羅和萊克多巴胺且二者的濃度大於2ng/ml ；③當檢測線Tl在450nm激發光照射下不顯現綠色螢光印跡，檢測線T2和質控線C在450nm激發光照射下同時顯現綠色螢光印跡，表示檢測結果為陽性，說明被檢測樣品萊克多巴胺的濃度大於2ng/ml ；④當檢測線T2在450nm激發光下不顯現綠色螢光印跡，檢測線Tl和質控線C在450nm激發光照射下同時顯現綠色螢光印跡，表示檢測結果為陽性，說明被檢測樣品中克倫特羅的濃度大於2ng/ml。所述的檢測樣品為豬肉時，消解的過程如下A、取脂肪豬肉組織樣本於均質機中於IOOOrpm均質lmin，得到均質物；B、在2. 5g均質物加入O. 5ml IM HCl，震蕩混勻IOmin ；C、加入 100 μ I 4Μ NaOH,劇烈震蕩 30s 後，室溫下 4000rmp 離心 15min ；D、取上清，在上清中加入50μ I 4Μ NaOH，震蕩混勻，再加入8ml乙酸乙酯，震蕩5min ；E、取上層有機相6ml於試管中，65 °C氮氣吹乾；F、向步驟E吹乾後的試管中依次加入O. 3ml正己烷和O. 3ml含體積百分比
O.5%Tween-20的磷酸鹽緩衝液，充分溶解試管壁上的殘留物，靜置分層後，下層溶液即為消解液。本發明的原理是表面帶有羧基基團的聚苯乙烯螢光微球在EDC的作用下與含有氨基的抗萊克多巴胺的單克隆抗體和抗克倫特羅的單克隆抗體共價結合形成穩定的醯胺鍵(-CO-NH-),當待測樣品中不含有萊克多巴胺與克倫特羅時，螢光微球標記的萊克多巴胺單克隆抗體和/或克倫特羅單克隆抗體被包被在硝酸纖維素膜上的萊克多巴胺蛋白質偶聯物和/或克倫特羅蛋白質偶聯物捕獲，螢光微球在相應的區域內聚集，在450nm激發光照射下，發出明亮的綠色螢光，從而被人眼或者儀器識別。當待測樣品中含有萊克多巴胺和/或克倫特羅時，待測樣品中的萊克多巴胺和/或克倫特羅會與被包被在硝酸纖維素膜上的萊克多巴胺蛋白質偶聯物和/或克倫特羅蛋白質偶聯物競爭性結合螢光微球標記的萊克多巴胺單克隆抗體和/或克倫特羅單克隆抗體，待測樣品中萊克多巴胺和/或克倫特羅的濃度越高，與檢測抗原結合的螢光微球標記的萊克多巴胺單克隆抗體和/或克倫特羅單克隆抗體越少，檢測線(Tl或T2線)上的螢光強度越小甚至消失，因此可根據檢測線(Tl或T2線)上的螢光強度判斷待測樣品中萊克多巴胺和/或克倫特羅的含量。與現有技術相比，本發明具有以下有益效果(I)本發明所述的螢光微球層析試紙條與高效液相色譜法、液相色譜-質譜聯用法、氣相色譜質譜聯用法和酶聯免疫吸附法相比具有操作簡單、安全，檢測時間短等優點；與膠體金免疫層析試紙條相比，本發明具有避免接觸重金屬離子、檢測靈敏度高等優點。(2)本發明所述的螢光微球層析試紙條使用間接競爭法檢測尿液、組織等樣本中萊克多巴胺與克倫特羅的殘留，具有快速、簡單、靈敏等優點，可實現對萊克多巴胺和克倫特羅殘留的同時現場監測。



圖I為萊克多巴胺-克倫特羅螢光微球檢測試紙條的結構示意圖，其中I為PVC底板，2為樣品吸收墊，3為結合墊，4為層析膜，5為吸水墊，6為檢測線Tl、7為檢測線Τ2，8為質控線C。圖2是將萊克多巴胺-克倫特羅螢光微球檢測試紙條的檢測結果示意圖。
具體實施例方式下面結合實施例及附圖對本發明做進一步詳細的描述，但本發明的實施方式不限於此。實施例I(I)萊克多巴胺蛋白質偶聯物的製備稱取鹽酸萊克多巴胺50mg、琥珀酸酐15mg溶於無水吡啶，室溫下攪拌反應24h，離心濃縮儀抽乾，得到衍生物A ;將衍生物A溶解於N，N』 - 二甲基甲醯胺(DMF)中，加入N-羥基琥珀醯亞胺(NHS) llmg、二環己基碳二亞胺(DCC) 20mg室溫攪拌條件下反應過夜；IOOOrpm離心，取上清得到B液；稱取250mg牛血清白蛋白溶於O. 015M、pH=7. 4的磷酸鹽緩衝液中，4°C預冷；冰浴攪拌條件下將B液逐滴加入到牛血清白蛋溶液中，4°C攪拌反應過夜；4°C，5000rpm離心5min，取上清得到C液；將C液置於4°C，0. 015M、pH=7. 4的磷酸鹽緩衝液中透析三天，得到萊克多巴胺蛋白質偶聯物。(2)克倫特羅蛋白質偶聯物的製備稱取25mg克鹽酸克倫特羅溶於ImllM鹽酸中，再加入2. 5ml蒸餾水，4°C預冷；緩慢加入IM亞硝酸鈉溶液，用澱粉碘化鉀試紙檢測至為棕紫色為止；加固體尿素終止反應，得到淡黃色的A液；稱取125mg牛血清白蛋白溶於
O.015M、pH=7. 4的磷酸鹽緩衝液中，4°C預冷；將A液逐滴加入牛血清白蛋溶液中，4°C攪拌過夜得橙黃色的BI液；將BI液置於4°C，O. 015M、pH=7. 4的磷酸鹽緩衝液透析三天，得克倫特羅蛋白質偶聯物。(3)製備萊克多巴胺-鹽酸克倫特羅螢光微球檢測試紙條，方法如下A.突光聚苯乙烯微球(130nm,購於上海照康生物科技有限公司，最大激發光波長為468nm，最大發射光波長為508nm ;內含有機螢光染料羅丹明B)的活化調整螢光聚苯乙烯微球在Tween-20水溶液(O. 5%v/v)中的濃度為I. 5X IO11個/ml，得到螢光聚苯乙烯微球懸液；取Iml突光聚苯乙烯微球懸液,於12000rpm離心20min,收集沉澱；用4ml O. 1M、pH5. 5的4-嗎啉乙磺酸(MES)緩衝溶液溶解沉澱後，加入40mgl-乙基-3-(3- 二甲基氨基丙基)碳醯二亞胺(EDC)和25mg N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)，混勻，室溫放置30min，離心洗滌2次，每次IlOOOrpm離心2min，沉澱用4ml MES緩衝液(O. 1M、ρΗ5· 5)溶解，4°C放置，即得活化後的螢光聚苯乙烯微球懸液；B.螢光聚苯乙烯微球的標記將萊克多巴胺單克隆抗體和克倫特羅單克隆抗體各60 μ g分別加入到步驟A製備的活化後的螢光聚苯乙烯微球溶液中，混勻後室溫攪拌反應2h，得到螢光聚苯乙烯微球標記蛋白溶液；C.螢光聚苯乙烯微球的封閉；加入200μ I O. IM甘氨酸溶液到上述步驟B中的螢光聚苯乙烯微球標記蛋白溶液中，室溫攪拌反應lh，離心洗滌2次，每次8000rpm、離心2min,沉澱用含60%鹿糖(w/v)、l% (w/v) BSA (牛血清白蛋白)和1% (v/v)吐溫-20(tween-20)的O. 015M、pH=7. 4的磷酸鹽緩衝液溶解，並用100W超聲波處理2min，4°C放置，得到封閉後的螢光聚苯乙烯微球懸液；
D.螢光微球標記蛋白懸液塗抹聚酯膜的製備藉助噴金儀在聚酯膜上以2微升/釐米的噴量均勻噴塗上步驟C封閉後的螢光微球標記抗體懸液，37°C烘乾，4°C避光乾燥保存，得到塗抹螢光微球標記蛋白的聚酯膜。E.包被抗體或抗原的硝酸纖維素膜的製備將步驟(I)、(2)中已製備好的萊克多巴胺蛋白質偶聯物、克倫特羅蛋白質偶聯物和羊抗鼠免疫球蛋白G分別用包被溶液(將十二水磷酸氫二鈉28. 94g、磷酸二氫鉀2. 61g、氯化鈉8. 0g、氯化鉀O. 2g、二乙烯三胺五乙酸O. 06g加入蒸餾水中溶解並定容至IOOOml得到)稀釋，分別得到萊克多巴胺蛋白質偶聯物溶液(濃度為O. 3mg/ml)、克倫特羅蛋白質偶聯物溶液(濃度為O. 3mg/ml)和羊抗鼠免疫球蛋白G溶液(濃度為O. 5mg/ml)，將以上三種溶液依次噴於硝酸纖維素膜上(NC膜)，分別作檢測線Tl和T2線及質控線C線，C線、Tl線與T2線三線間隔同為3mm，均勻分布，37°C烘乾72h，得到包被後的硝酸纖維素膜。F.萊克多巴胺-克倫特羅螢光微球檢測試紙條的製備如圖I所示，在PVC底板I上用不乾膠依次粘貼相互搭接的樣品吸收墊2 (材質為玻璃纖維膜)、結合墊3 (即步驟D製備的塗抹螢光微球標記蛋白的聚酯膜)、層析膜4 (即步驟E製備的包被抗體或抗原的硝酸纖維素膜)以及吸水墊5 (材質為吸水紙即)，得到萊克多巴胺-克倫特羅螢光微球檢測試紙條。其中，檢測線Tl (6)靠近吸收墊2，質控線C (8)靠近吸水墊，檢測線T2 (7)位於檢測線Tl (6)和質控線C (8)中間。萊克多巴胺-克倫特羅螢光微球檢測試紙條用於一檢多項的檢測結果如圖2所示如果檢測線Tl線、T2線和控制線C線在450nm激發光照射下同時顯現綠色螢光印跡，表示檢測結果為陰性，說明被檢測樣本中不含克倫特羅和萊克多巴胺或是含有的克倫特羅和萊克多巴胺的濃度小於2ng/ml，見圖2 (a);如果檢測線Tl線、T2線在450nm激發光照射下不顯現綠色螢光印跡，只有控制線C線在激發光下同時顯現綠色螢光印跡，表示檢測結果為陽性，說明被檢測樣品中同時含克倫特羅和萊克多巴胺且二者的濃度大於Zngml/1，見圖2 (b);如果檢測線Tl線在450nm激發光照射下不顯現綠色螢光印跡，檢測線T2線和控制線C線在450nm激發光照射下同時顯現綠色螢光印跡，表示檢測結果為陽性，說明被檢測樣品萊克多巴胺的濃度大於2ng/ml，見圖2 (c);如果檢測線T2線在450nm激發光下不顯現綠色螢光印跡，檢測線Tl線和控制線C線在450nm激發光照射下同時顯現綠色螢光印跡，表示檢測結果為陽性，說明被檢測樣品中克倫特羅的濃度大於2ng/ml，見圖2 (d);如果控制線C線在450nm激發光下不顯現綠色螢光印跡，表示該檢測試紙條失效，見圖2 (e)。實施例2進行以下試驗，驗證用本發明製備的檢測試紙條的檢測特異性a、分別用磷酸緩衝液配製萊克多巴胺(RAC)、克倫特羅(CL)及沙丁胺醇(SAL)的系列梯度的標準溶液(濃度分別為O、O. 5、l、2、3、、5、20ng/ml)。b、用滴管吸取步驟a所得標準溶液各3滴(約100 μ I )，滴加於試紙條的樣品吸收墊上，滴加樣品後開始計時；c、IOmin後在450nm激發光照射下判讀結果；通過對製得的萊克多巴胺-克倫特羅螢光微球檢測試紙條進行特異性交叉反應 測試，結果如下表I為萊克多巴胺、克倫特羅與其他類似物的交叉反應結果
權利要求
1.一種萊克多巴胺-克倫特羅螢光微球檢測試紙條，包含附著於底板上且依次緊密相連的樣品吸收墊、結合墊、層析膜和吸水墊；其特徵在於結合墊上含有螢光聚苯乙烯微球標記蛋白；層析膜上設置有兩條檢測線和一條質控線，檢測線靠近結合墊，質控線靠近吸水墊；一條檢測線上包被有萊克多巴胺蛋白質偶聯物，另一條檢測線上包被有克倫特羅蛋白質偶聯物，質控線上包被有能與螢光聚苯乙烯微球標記蛋白中的蛋白結合且不和萊克多巴胺和克倫特羅結合的蛋白偶聯物；螢光聚苯乙烯微球標記蛋白為螢光聚苯乙烯微球標記的萊克多巴胺單克隆抗體和螢光聚苯乙烯微球標記的克倫特羅單克隆抗體。
2.根據權利要求I所述的萊克多巴胺-克倫特羅螢光微球檢測試紙條，其特徵在於 所述的樣品吸收墊的材質為玻璃纖維膜； 所述的結合墊的材質為聚酯膜； 所述的層析膜的材質為硝酸纖維素膜； 所述的吸水墊的材質為吸水紙； 所述的質控線由羊抗鼠免疫球蛋白G溶液製備得到。
3.根據權利要求I所述的萊克多巴胺-克倫特羅螢光微球檢測試紙條，其特徵在於所述的螢光聚苯乙烯微球標記蛋白通過如下方法製備得到 (1)螢光聚苯乙烯微球的活化將螢光聚苯乙烯微球分散於吐溫-20水溶液中，得到螢光聚苯乙烯微球懸液，離心，收集沉澱；沉澱用4-嗎啉乙磺酸緩衝溶液溶解後，加入I-乙基-3-(3- 二甲基氨基丙基)碳醯二亞胺，再加入N-羥基琥珀醯亞胺，混勻後反應30 60min,離心洗滌沉澱，再用MES緩衝液溶解沉澱，得到活化後的螢光聚苯乙烯微球懸液；其中，I-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳醯二亞胺與螢光聚苯乙烯微球按30 50mg/(I. 5X IO11個)配比；N-羥基琥珀醯亞胺與螢光聚苯乙烯微球按20 30mg/(l. 5X IO11個)配比； (2)螢光聚苯乙烯微球標記蛋白溶液的製備將萊克多巴胺單克隆抗體和克倫特羅單克隆抗體加入到步驟(I)製備的活化後的螢光聚苯乙烯微球懸液中，混勻後攪拌反應I 3h ;接著加入甘氨酸，攪拌反應O. 5 2h，離心洗滌，沉澱用封閉溶液溶解後進行超聲處理，得到封閉後的螢光微球標記抗體懸液。
4.根據權利要求3所述的萊克多巴胺-克倫特羅螢光微球檢測試紙條，其特徵在於 步驟(I)中所述的螢光聚苯乙烯微球的直徑為50 200nm ； 步驟(I)中所述的吐溫-20水溶液的濃度為體積百分比O. 5% ； 步驟(I)中所述的離心的條件為12000 13000rpm離心15 30min ； 步驟(I)中所述的4-嗎啉乙磺酸緩衝液為O. 1M、pH值為5. 5的4-嗎啉乙磺酸緩衝液； 步驟(I)中所述的離心洗滌沉澱的次數為2 3次，離心轉速為10000 llOOOrpm，每次離心I 2min ； 步驟(2)中所述的萊克多巴胺單克隆抗體與所述的螢光聚苯乙烯微球按質量比20 .100 μ g/ (I. 5X IO11 個)配比； 步驟(2)中所述的克倫特羅單克隆抗體與所述的螢光聚苯乙烯微球按質量比20 .100 μ g/ (I. 5X IO11 個)配比； 步驟(2)中所述的甘氨酸的用量為每I. 5X1011個螢光聚苯乙烯微球使用O. 01 O.03mol甘氨酸； 步驟(2)中所述的離心洗滌的次數為2 3次，離心轉速為7000 9000rpm，每次離心I 2min ； 步驟(2)中所述的封閉溶液為含質量體積比40 60%蔗糖、質量體積比I 2%牛血清白蛋白和體積百分比I 2%吐溫-20的磷酸鹽緩衝液；磷酸鹽緩衝液的濃度為O. 015M，PH值為7.4； 步驟(2)中所述的超聲處理的條件為100W、2 4min。
5.根據權利要求I所述的萊克多巴胺-克倫特羅螢光微球檢測試紙條，其特徵在於所述的萊克多巴胺蛋白質偶聯物通過包含如下步驟的方法得到 1)將鹽酸萊克多巴胺和琥珀酸酐溶於無水吡啶中，攪拌反應後乾燥，得到衍生物； 2)將衍生物溶解於N，N』-二甲基甲醯胺中，加入N-羥基琥珀醯亞胺和二環己基碳二亞胺攪拌條件下反應過夜；離心，取上清； 3)將步驟2)得到的上清滴加入2 8°C預冷的牛血清白蛋白溶液中，2 8°C攪拌反應過夜，2 8°C離心，取上清，將上清置於磷酸鹽緩衝液中於2 8°C透析，得到萊克多巴胺蛋白質偶聯物； 其中，鹽酸萊克多巴胺、琥珀酸酐、N-羥基琥珀醯亞胺、二環己基碳二亞胺和牛血清白蛋白按質量比50 :15:11 20 :250進行配比； 所述的克倫特羅蛋白質偶聯物通過包含如下步驟的方法得到 ①將鹽酸克倫特羅溶於鹽酸溶液中，預冷至2 8°C後加入亞硝酸鈉溶液進行反應，一邊加入亞硝酸鈉溶液，一邊用澱粉碘化鉀試紙檢測，當澱粉碘化鉀試紙顯示為棕紫色，停止加入亞硝酸鈉溶液，加入尿素終止反應，得到淡黃色的溶液A ； ②將步驟①製備的溶液A滴加入2 8°C預冷的牛血清白蛋白溶液中，2 8°C攪拌反應過夜，得到橙黃色的溶液B ； ③將步驟②製備的溶液B置於磷酸鹽緩衝液中於2 8°C透析，得到克倫特羅蛋白質偶聯物； 鹽酸克倫特羅與牛血清白蛋白按質量比1:4 1:6進行配比。
6.根據權利要求5所述的萊克多巴胺-克倫特羅螢光微球檢測試紙條，其特徵在於 步驟I)中所述的攪拌反應的時間為24h ； 步驟2)中所述的離心的轉速為IOOOrpm ； 步驟3)中所述的磷酸鹽緩衝液的濃度為O. 015M, pH值為7. 4 ; 步驟3)中所述的透析的時間為2 4天； 步驟①中所述的鹽酸溶液的濃度為O. 28 O. 29mol/L ； 步驟②中所述的牛血清白蛋白溶液為將牛血清白蛋白溶於磷酸鹽緩衝液得到； 所述的磷酸鹽緩衝液的濃度為O. 015M, pH值為7. 4 ; 步驟③中所述的磷酸鹽緩衝液的濃度為O. 015M, pH值為7. 4。
7.一種萊克多巴胺-克倫特羅突光微球檢測試卡，其特徵在於含有權利要求I 6任一項所述的萊克多巴胺-克倫特羅螢光微球檢測試紙條和外殼；外殼包裹住所述的萊克多巴胺-克倫特羅螢光微球檢測試紙條，其中在外殼上開有加樣孔和觀察孔，加樣孔正對著萊克多巴胺-克倫特羅螢光微球檢測試紙條的樣品吸收墊，觀察孔正對著萊克多巴胺-克倫特羅螢光微球檢測試紙條的檢測線Tl、檢測線T2和質控線C所在區域。
8.權利要求I 6任一項所述的萊克多巴胺-克倫特羅螢光微球檢測試紙條的製備方法，其特徵在於包括以下操作步驟 I、萊克多巴胺蛋白質偶聯物的製備將鹽酸萊克多巴胺和琥珀酸酐溶於無水吡啶中，攪拌反應後乾燥，得到衍生物；將衍生物溶解於N，N』- 二甲基甲醯胺中，加入N-羥基琥珀醯亞胺和二環己基碳二亞胺攪拌條件下反應過夜；離心，取上清A ;將上清A滴加入2 8°C預冷的牛血清白蛋白溶液中，2 8°C攪拌反應過夜，2 8°C離心，取上清B，將上清B置於磷 酸鹽緩衝液中於2 8°C透析，得到萊克多巴胺蛋白質偶聯物；其中，鹽酸萊克多巴胺、琥珀酸酐、N-羥基琥珀醯亞胺、二環己基碳二亞胺和牛血清白蛋白按質量比50 15 11 :20 250進行配比； II、克倫特羅蛋白質偶聯物的製備將鹽酸克倫特羅溶於鹽酸溶液中，預冷至2 8°C後加入亞硝酸鈉溶液進行反應，一邊加入亞硝酸鈉溶液，一邊用澱粉碘化鉀試紙檢測，當澱粉碘化鉀試紙顯示為棕紫色，停止加入亞硝酸鈉溶液，加入尿素終止反應，得到淡黃色的溶液A ;將溶液A滴加入2 8°C預冷的牛血清白蛋白溶液中，2 8°C攪拌反應過夜，得到橙黃色的溶液B ;將溶液B置於磷酸鹽緩衝液中於2 8°C透析，得到克倫特羅蛋白質偶聯物；其中，鹽酸克倫特羅與牛血清白蛋白按質量比1:4 1:6進行配比； III、螢光聚苯乙烯微球標記蛋白的製備 (1)螢光聚苯乙烯微球的活化將螢光聚苯乙烯微球分散於吐溫-20水溶液中，得到螢光聚苯乙烯微球懸液，離心，收集沉澱；沉澱用4-嗎啉乙磺酸緩衝溶液溶解後，加入I-乙基-3-(3- 二甲基氨基丙基)碳醯二亞胺，再加入N-羥基琥珀醯亞胺，混勻後反應30 60min,離心洗滌沉澱，再用MES緩衝液溶解沉澱，得到活化後的螢光聚苯乙烯微球懸液；其中，I-乙基-3-(3- 二甲基氨基丙基)碳醯二亞胺與螢光聚苯乙烯微球按30 50mg/(I. 5X IO11個)配比；N-羥基琥珀醯亞胺與螢光聚苯乙烯微球按20 30mg/(l. 5X IO11個)配比； (2)螢光聚苯乙烯微球標記蛋白溶液的製備將萊克多巴胺單克隆抗體和克倫特羅單克隆抗體加入到步驟(I)製備的活化後的螢光聚苯乙烯微球懸液中，混勻後攪拌反應I 3h ;接著加入甘氨酸，攪拌反應O. 5 2h，離心洗滌，沉澱用封閉溶液溶解後進行超聲處理，得到封閉後的螢光微球標記抗體懸液； IV、含有螢光微球標記蛋白的聚酯膜的製備在聚酯膜上均勻噴塗步驟III製備的封閉後的螢光微球標記抗體懸液，烘乾，得到塗抹螢光微球標記蛋白的聚酯膜； V、包被抗原或抗體的硝酸纖維素膜的製備將步驟I製備的萊克多巴胺蛋白質偶聯物、步驟II製備的克倫特羅蛋白質偶聯物、羊抗鼠免疫球蛋白G分別用包被溶液稀釋，得到萊克多巴胺蛋白質偶聯物溶液、克倫特羅蛋白質偶聯物溶液和羊抗鼠免疫球蛋白G溶液，將以上三種溶液依次噴於硝酸纖維素膜上，分別為檢測線Tl、檢測線T2和質控線C，檢測線Tl、檢測線T2和質控線C三線間隔同為3_，烘乾，得到包被後的硝酸纖維素膜；包被溶液的組成如下十二水磷酸氫二鈉28. 94g、磷酸二氫鉀2. 61g、氯化鈉8. 0g、氯化鉀O. 2g、二乙烯三胺五乙酸O. 06g,蒸懼水定容至IOOOml ； VI、試紙條的製備首先，在底板的中心黏貼上層析膜，即步驟V製備的包被抗原或抗 體的硝酸纖維素膜；在層析膜靠近質控線C的一端搭接黏貼上吸水墊；在層析膜的另一端搭接黏貼上結合墊，即步驟IV製備的含有螢光微球標記蛋白的聚酯膜；在結合墊的另一端搭接黏貼上樣品吸收墊，得到萊克多巴胺-克倫特羅螢光微球檢測試紙條。
9.根據權利要求8所述的製備方法，其特徵在於 步驟I中所述的攪拌反應的時間為24h ;所述的離心的轉速為IOOOrpm ;所述的磷酸鹽緩衝液的濃度為O. 015M，pH值為7. 4 ;所述的透析的時間為2 4天； 步驟II中所述的鹽酸溶液的濃度為O. 28 O. 29mol/L ;所述的磷酸鹽緩衝液的濃度為 O. 015M, pH 值為 7. 4 ； 步驟III (I)中所述的螢光聚苯乙烯微球的直徑為50 200nm ;所述的吐溫-20水溶液的濃度為體積百分比O. 5% ;所述的離心的條件為12000 13000rpm離心15 30min ;所述的4-嗎啉乙磺酸緩衝液為O. 1Μ、ρΗ值為5. 5的4-嗎啉乙磺酸緩衝液；所述離心洗滌沉澱的次數為2 3次,離心轉速為10000 IlOOOrpm,每次離心I 2min ； 步驟III (2)中所述的萊克多巴胺單克隆抗體與所述的螢光聚苯乙烯微球按質量比20 100 μ g/ (I. 5X IO11個)配比；所述的克倫特羅單克隆抗體與所述的螢光聚苯乙烯微球按質量比20 100 μ g/(l. 5X IO11個)配比；所述的甘氨酸的用量為每I. 5X IO11個螢光聚苯乙烯微球使用O. 01 O. 03mol甘氨酸；所述的離心洗滌的次數為2 3次，離心轉速為7000 9000rpm,每次離心I 2min ;所述的封閉溶液為含質量體積比40 60%鹿糖、質量體積比I 2%牛血清白蛋白和體積百分比I 2%吐溫-20的磷酸鹽緩衝液；磷酸鹽緩衝液的濃度為O. 015M，pH值為7. 4 ;所述的超聲處理的條件為100W、2 4min ； 步驟V中所述的羊抗鼠免疫球蛋白G溶液的濃度為O. 25 lmg/ml包被溶液； 步驟V中所述的萊克多巴胺蛋白質偶聯物溶液的濃度為O. 05 O. 3mg/ml包被溶液； 步驟V中所述的鹽酸克倫特羅蛋白質偶聯物溶液的濃度為O. 05 O. 3mg/ml包被溶液； 步驟V中所述的烘乾的條件是37°C乾燥72h。
10.權利要求I 6任一項所述的萊克多巴胺-克倫特羅螢光微球檢測試紙條的應用，其特徵在於包含以下步驟 Cl)當檢測樣品為液體樣品時，直接將樣品滴加於樣品吸收墊上，IOmin後在450nm激發光照射下判讀結果； (2)當檢測樣品為固體樣品時，將固體樣品進行消解，再將消解後得到的溶液滴加於樣品吸收墊上，IOmin後在450nm激發光照射下判讀結果； (3)結果的判斷: ①當檢測線Tl、檢測線T2和質控線C在450nm激發光照射下同時顯現綠色螢光印跡，表示檢測結果為陰性，說明被檢測樣本中不含克倫特羅和萊克多巴胺或含有克倫特羅和萊克多巴胺的濃度小於2ng/ml ； ②當檢測線Tl、檢測線T2在450nm激發光照射下不顯現綠色螢光印跡，只有質控線C在激發光下同時顯現綠色螢光印跡，表示檢測結果為陽性，說明被檢測樣品中同時含克倫特羅和萊克多巴胺且二者的濃度大於2ng/ml ； ③當檢測線Tl在450nm激發光照射下不顯現綠色螢光印跡，檢測線T2和質控線C在450nm激發光照射下同時顯現綠色螢光印跡，表示檢測結果為陽性，說明被檢測樣品萊克多巴胺的濃度大於2ng/ml ；④當檢測 線T2在450nm激發光下不顯現綠色突光印跡,檢測線Tl和質控線C在450nm激發光照射下同時顯現綠色螢光印跡，表示檢測結果為陽性，說明被檢測樣品中克倫特羅的濃度大於2ng/ml。
全文摘要
本發明公開一種萊克多巴胺-克倫特羅螢光微球檢測試紙條及製備與應用。該試紙條包含附著於底板上且依次緊密相連的樣品吸收墊、結合墊、層析膜和吸水墊；其中，結合墊上含有螢光聚苯乙烯微球標記蛋白；層析膜上設置有兩條檢測線和一條質控線，檢測線靠近結合墊，質控線靠近吸水墊；一條檢測線上包被有萊克多巴胺蛋白質偶聯物，另一條檢測線上包被有克倫特羅蛋白質偶聯物，質控線上包被有能與螢光聚苯乙烯微球標記蛋白中的蛋白結合且不和萊克多巴胺和克倫特羅結合的蛋白偶聯物；螢光聚苯乙烯微球標記蛋白為螢光聚苯乙烯微球標記的萊克多巴胺單克隆抗體和克倫特羅單克隆抗體。該試紙條能同時檢測萊克多巴胺和克倫特羅，快速、簡便、靈敏、準確檢測。
文檔編號G01N33/558GK102830230SQ20121030935
公開日2012年12月19日 申請日期2012年8月28日 優先權日2012年8月28日
發明者唐勇, 崔浩 申請人:暨南大學