用於治療癌症的修飾細胞因子的製作方法

2023-06-14 16:02:46

專利名稱：用於治療癌症的修飾細胞因子的製作方法
技術領域：
本發明涉及用於治療癌症的修飾細胞因子。更詳細地講，本發明涉及能夠「自動靶向」腫瘤血管和抗原呈遞細胞的細胞因子衍生物。
部分細胞因子的抗腫瘤活性是眾所周知的並已有描述。部分細胞因子也已經應用於人類治療(29)。已經證實諸如白介素-2(IL-2)和α幹擾素(IFNα)的細胞因子對不同類型腫瘤(例如腎轉移癌、毛細胞白血病、卡波濟氏肉瘤、黑素瘤、多發性骨髓瘤(multiple mieloma)等)患者具有可靠的抗腫瘤活性。其它細胞因子如IFNβ、腫瘤壞死因子(TNF)α、TNFβ、IL-1、IL-4、IL-6、IL-12、IL-15和集落刺激因子(CFS)對某些類型的腫瘤具有一定的抗腫瘤活性，因此將其作為進一步研究的目標。
一般來說，細胞因子的治療性應用主要受限於其全身性毒性。例如最初發現TNF能夠誘導某些腫瘤出血性壞死(1)，對不同腫瘤系具有體外細胞性作用(2)，但是隨後證實它具有強烈促炎活性，在過量產生的情況下嚴重危害人類身體健康(3)。
因為所述全身性毒性是細胞因子人類藥理活性劑量的基本問題，所以旨在減少這種生物學效應物的毒性作用而維持其治療效力的新的衍生物和治療策略現正在評定中。
一些新的方法涉及a)研製能夠將TNF傳遞到腫瘤並增加局部濃度的融合蛋白。例如，已生產出由TNF和腫瘤特異性抗體組成的融合蛋白(4)；b)研製保持抗腫瘤活性而全身性毒性降低的TNF突變體。因此，已製備出僅能選擇性識別一種受體(p55或p75)的突變體(5)；c)能夠降低TNF部分毒性作用而不影響抗腫瘤活性的抗TNF抗體的應用。該抗體在文獻中已有描述(30)；d)具有較長半衰期的TNF衍生物的應用(例如與與聚乙二醇綴合的TNF)。
關於能夠選擇性地靶向腫瘤位點的TNF衍生物的製備最近已有報導。例如關於融合蛋白已有描述，將抗轉鐵蛋白受體的單克隆抗體重鏈基因和TNF基因融合獲得融合蛋白(4)，或者將TNF和針對腫瘤相關抗原TAG72的單克隆抗體鉸鏈區融合獲得的融合蛋白(6)，或者Fv-TNF融合蛋白(6)。
EP 251 494公開了一種給予診斷試劑或治療藥物的體系，該體系包括一種綴合有抗生物素蛋白或鏈黴抗生物素蛋白的抗體，一種能夠使所述綴合抗體和綴合有生物素的診斷試劑或治療藥物組成的化合物複合的試劑，它們序貫給予而且適當延遲，以便讓所述診斷試劑或治療藥物通過生物素-鏈黴抗生物素蛋白在抗體識別的靶細胞上相互作用而定位。所述診斷試劑或治療藥物包括金屬螯合物，特別是放射性核素和低分子量抗腫瘤藥物(例如順鉑、阿黴素等)的螯合物。
EP 496 074公開了一種提供序貫給予生物素化抗體、抗生物素蛋白或鏈黴抗生物素蛋白以及生物素化診斷試劑或治療藥物的方法。儘管一般性列舉了細胞毒性藥物如蓖麻蛋白，但關於放射性同位素標記化合物的應用公開最多。
WO 95/15979公開了一種用於將高毒性藥物定位在細胞靶上的方法，該方法基於給予包含綴合配體或抗配體的的特異性靶分子的第一綴合物，接著給予包含與抗配體或配體結合的毒性藥物的第二綴合物。
WO 99/13329公開了一種將分子靶向腫瘤生血管血管的方法，該方法基於所述分子與NGR受體配體綴合。許多分子已被認為是可能的候補物質，但僅有阿黴素被明確描述。沒有NGR受體配體作為細胞因子載體誘導免疫應答的用途被公開。
現在令人驚訝的發現是，某些細胞因子的治療指數能被顯著提高並且其免疫治療特性能通過與氨基肽酶-N受體(CD13)的配體偶聯而增強。CD13是一種在不同物種中高度保守的150kDa的跨膜糖蛋白。它在正常的細胞中表達，也在骨髓性腫瘤系、生血管內皮以及一些上皮細胞中表達。CD13受體通常稱為「NGR」受體，因為它的肽配體共有「NGR」胺基酸基元。
按照第一個方面，本發明提供選自TNF及IFNγ的細胞因子和CD13受體配體的綴合製品。所述配體可以是抗體或其片段(例如Fab、Fv、單鏈Fv)、肽或肽模擬物(即能夠結合CD13受體的肽樣分子，任選包含修飾而非天然存在的胺基酸)。所述配體優選包含所述NGR基元的直鏈或環肽，例如CNGRCVSGCAGRC、NGRAHA、GNGRG、環肽CVLNGRMEC或環肽CNGRC，或者更優選CNGRC肽。所述肽可直接與細胞因子結合或通過一個接頭(可以是單個胺基酸、胺基酸序列或有機殘基(例如6-氨基癸醯基-N-羥基琥珀醯亞胺))與細胞因子間接結合。所述結合方法是本領域技術人員所周知的，包括遺傳工程技術或化學合成技術。
所述肽配體最好與細胞因子N末端連接，從而最小化所述修飾細胞因子與其受體結合時的任何幹擾。另一方面，所述肽能連接到胺基酸殘基上，所述胺基酸殘基是天然存在於所述分子或用遺傳工程技術人工插入的醯胺鍵或羧基鍵接受者。所述修飾細胞因子最好使用包含編碼所述肽的5』連續序列的cDNA來製備。
按照一個優選實施方案，提供TNF和CNGRC序列的綴合製品。更優選TNF的氨基末端通過接頭G(甘氨酸)連接到肽CNGRC。
所述合成製品(NGR-TNF)在RMA-T淋巴瘤動物模型上證明比TNF更有效。而且，用NGR-TNF處理的動物能夠更進一步地抵制致瘤劑量的RMA-T或RMA細胞。同通常TNF相比，能夠在免疫正常動物觀測到這種抗腫瘤活性增加而在免疫缺陷動物觀測不到這種作用。說明所述綴合「NGR」肽的TNF抗腫瘤活性增加是由於免疫應答的增強而不是綴合物的直接細胞毒性作用。
還證實NGR-TNF的體內免疫作用與CD13受體直接相關。例如已觀察到，抗CD13受體及GNGRC配體的抗體在體內與NGR-TNF競爭，從而提示NGR-TNF靶向受體的機制。
應用能夠選擇性結合兩種TNF受體(p75TNFR和p55TNFR)中的一種受體的突變型TNF能更進一步改善所述TNF/CD13配體綴合物的治療指數。所述TNF突變體能通過定點誘變獲得(5；7)。
本發明修飾細胞因子的藥物代謝動力學能通過製備聚乙二醇衍生物得到改善，聚乙二醇衍生物可延長所述細胞因子本身的血漿半衰期。
本發明再一實施方案為雙功能衍生物，其中用所述CD13配體修飾的細胞因子同針對腫瘤抗原或其它腫瘤血管形成標記物(如αv整聯蛋白、金屬蛋白酶或血管生長因子)的抗體或其片段或者針對胞外基質組分的抗體或其片段(如抗肌腱蛋白抗體或抗纖連蛋白EDB結構域)相結合。TNF與針對胃腺癌和卵巢腺癌表達的腫瘤相關性TAG72抗原的單克隆抗體鉸鏈區的融合產物的製備近來已有報導(6)。
本發明另一實施方案是以生物素/抗生物素蛋白系統預靶向腫瘤。按照這種途徑，一種三元複合物在不同階段的腫瘤抗原位點上，其組成為1)生物素化單克隆抗體，2)抗生物素蛋白(或鏈黴抗生物素蛋白)，3)用所述CD13配體和生物素修飾的二價細胞因子。許多論文證實，與用免疫綴合物常規靶向相比，所述預靶向方法能確實增加在靶部位結合的活性分子與游離活性分子的比率，從而減少治療毒性(11，10，9，8)。這種方法利用生物素化TNF產生了良好結果，該生物素化TNF能夠在體外誘導細胞毒性並在正常TNF不起作用的情況下降低腫瘤細胞生長(14，26)。所述預靶向方法還可以通過使用雙特異性抗體(同時結合所述腫瘤抗原和所述修飾細胞因子)的兩相程序來實現。針對癌胚抗原和TNF的雙特異性抗體用作TNF腫瘤預靶向的手段近來已有報導(31)。
按照再一實施方案，本發明包含在不同TNF亞基上同時與CD13配體和抗體或其片段綴合(直接綴合或通過生物素-抗生物素蛋白橋間接綴合)的TNF分子，，所述抗體或其片段針對腫瘤細胞表達的抗原或其它腫瘤基質組分(如肌腱蛋白和纖連蛋白EDB結構域)。使得所述修飾細胞因子的腫瘤尋靶特性更進一步改善以及後者在腫瘤微環境中通過三聚體-單體-三聚體的轉變得到緩慢釋放。實際上以前的研究工作證實，所述TNF綴合物的修飾亞基能與靶向複合物解離並再締合，形成未修飾的三聚體TNF分子，然後擴散在腫瘤微環境中。已證明所述生物活性TNF的釋放在靶向後24-48小時內發生(21)。
治療應用時，本發明修飾細胞因子適合製備成用於口或腸道外給予的藥物製劑。優選腸道外給予的製劑，它們包括注射溶液劑或混懸液劑以及輸注用液體劑。對於所述腸道外型製劑，將有效劑量的所述活性組分溶解或懸浮在無菌媒介物中，任選添加賦形劑如助溶劑、等滲劑、防腐劑、穩定劑、乳化劑或分散劑，隨後將其分裝在密封管形瓶或安瓿中。
脂質體形式的所述細胞因子製劑能改善它的生物學活性。事實上在體外已觀測到所述TNF的氨基基團醯基化使其疏水性增加而不損失生物學活性。而且據報導，結合脂類的TNF的體外細胞毒性不受影響、體內免疫調節作用不受影響而體內毒性減低(12，13)。
人體快速濃注TNF的最大耐受劑量為218-410μg/m2(32)，比在動物中的有效劑量低約10倍。根據來自小鼠模型的數據認為，要在人類中達到抗腫瘤效果至少高十倍的劑量是必需的(15)。對肢體高溫隔離灌注的首個臨床研究中，以4mg TNF與苯丙氨酸氮芥和幹擾素γ聯合應用獲得了高反應率(16)。其它研究表明，可以不要幹擾素γ，更低劑量的TNF也能充分引起治療性反應(17，18)。因為所述兩種細胞因子對內皮細胞上發揮協同作用，它們的聯合選擇性靶向可能導致更強的抗腫瘤活性，從而克服相同細胞因子聯合應用在癌症治療中通常遇到的全身性毒性問題。此外，已知TNF能降低內皮性血管的屏障功能，從而提高它們對大分子的通透性。利用本發明修飾TNF分子的治療毒性降低和它們的腫瘤血管尋靶特性，另一個可供選擇的應用是它們增加腫瘤血管對其它化合物的通透性，無論是治療目的或還是診斷目的。例如在腫瘤的放射免疫閃爍成像法或放射免疫治療中所述修飾TNF可用以增加腫瘤攝取放射性標記抗體或放射性標記激素(腫瘤成像化合物)。另一方面，還可增強化學治療藥物、免疫毒素、攜帶藥物或基因的脂質體或者其它抗癌藥物的攝取也能增加，從而增強其抗腫瘤作用。
所以，癌症治療或診斷時，本發明細胞因子也可與其它診斷或治療物質一起以組合、分開或貫序的製劑形式應用。
本發明最後一個方面涉及編碼本文公開的綴合細胞因子的cDNA，它可由所述細胞因子的cDNA增加編碼所述CD13配體、優選上述尋靶肽的5』-或3』-連續DNA序列製備。所述聯合cDNA可原樣用於基因治療或插入載體後用於基因治療。所述合適載體的製備和治療性應用在(19)中公開，其通過引用結合到本文中。
附圖描述

圖1TNF和NGR-TNF對RMA-T淋巴瘤生長(a和b)以及動物體重(c和d)的作用。
5隻動物/組，在腫瘤移植10天後用單一劑量的TNF或NGR-TNF(腹腔內注射)治療。根據對數曲線內推不同劑量(b)的第14天的腫瘤面積值和治療後體重的降低(第11天和第12天的平均值)(d)。在第14天1μg或9μg的NGR-TNF的抗腫瘤作用比相當劑量的TNF作用的更強(分別P＝0.024和P＝0.032)，而治療後體重降低是相似的。箭頭指示產生類似作用的TNF和NGR-TNF外推劑量。圖2單克隆抗體R3-63和CNGRC對NGR-TNF(a)和TNF(b)的抗腫瘤活性的作用。
腫瘤移植12天後，用混合NGR-TNF或TNF的單抗R3-63或CNGRC對具有RMA-T腫瘤的動物給藥(n＝5隻動物/組)。在一個單獨的實驗(c)中對具有11天大的腫瘤的動物用TNF和NGR-TNF與CNGRC或CARAC(對照肽)聯合給藥(n＝5)。1μg NGR-TNF的抗腫瘤作用比9μg TNF的抗腫瘤作用強(P＝0.009，第20天t-檢驗)並且抗腫瘤活性被CNGRC(P＝0.035)和單抗R3-63(P＝0.011)顯著抑制。圖3NGR-TNF和TNF的限制性胰蛋白酶消化對它們的分子量(a)和抗腫瘤活性(b)的作用。
按照廠商說明書將1mg胰蛋白酶偶聯到1ml活化CH瓊脂糖凝膠(Pharmacia-Upjohn)上製備出胰蛋白酶-瓊脂糖。NGR-TNF和TNF(在300μl 0.15M氯化鈉和0.05M磷酸鈉中各170μg，pH7.3)與15μl樹脂混懸液(1∶4)或單獨的緩衝液混合併且在37℃端對端旋轉持續所示時間。所述四種產物通過0.22μm Spin-X儀器(Costar，Cambridge，MA)過濾並在使用之前保存在-20℃。(a)電噴霧質譜分析。每一個峰指出分子量大小和相應的產物(N-末端序列)。序列上的箭頭指示裂解位點。(b)1μg或3μg的NGR-TNF和TNF(沒用胰蛋白酶溫育(上圖)或用胰蛋白酶溫育(下圖))對RMA-T腫瘤生長和動物體重的作用(用1μg和3μg劑量治療的組平均值±SE)。在腫瘤移植13天後治療動物(n＝5隻動物/組)。圖4變性/再摺疊前後人NGR-TNF的SDS-PAGE和抗腫瘤活性。
人TNF(a)、NGR-TNF在實施例V所述變性/再摺疊過程前(b)和後(c)在非還原條件下的SDS-PAGE(A)。
TNF和未再摺疊的NGR-TNF對所述RMA-T淋巴瘤的生長(B)和對體重(C)的作用。人TNF(D)和再摺疊的NGR-TNF(包含＞95％的具有鏈內二硫鍵的三聚體)(E)對腫瘤生長的作用。在腫瘤移植10天後用一個劑量的TNF或NGR-TNF腹腔內注射治療動物(如圖所示，15或5隻小鼠/組)。
下列實施例進一步說明本發明。
實施例I小鼠TNF和NGR-TNF的製備細胞質cDNA在大腸桿菌中表達製備小鼠重組TNF和Cys-Asn-Gly-Arg-Cys-Gly-TNF(NGR-TNF)。用5′-CTGGATCCTCACAGAGCAATGACTCCAAAG-3′和5′-TGCCTCACATATGCTCAGATCATCTTCTC-3′作為3′和5′引物，對分離自脂多糖刺激的小鼠RAW-264.7單核巨噬細胞的mRNA通過反轉錄-聚合酶鏈反應(RT-PCR)製備編碼小鼠Met-TNF1-156的cDNA(20)。
將所述擴增片段用Nde I和Bam HI(New England Biolabs，Beverley，MA)酶切並克隆到預先用相同的酶酶切得到的pET-11b(Novagen，Madison，WI)中(pTNF)。
用5′-GCAGATCATATGTGCAACGGCCGTTGCGGCCTCAGATCATCTTCTC-3′作為5′引物和上述的3′引物，通過對pTNF的PCR擴增編碼Cys-Asn-Gly-Arg-Cys-Gly-TNF1-156的所述cDNA。將擴增片段如上所述酶切並克隆到pET-11b中並用來轉化BL21(DE3)大腸桿菌細胞(Novagen)。按照所述pET-11b的廠商說明書，用異丙基-β-D-硫代半乳糖苷誘導TNF和NGR-TNF的表達。在2mM乙二胺四乙酸、20mM Tris-HCl，pH8.0緩衝液中經過超聲處理細菌，接著離心(15000×g，20分鐘，4℃)從兩升培養物中回收可溶性的TNF和NGR-TNF。兩種提取液都與硫酸銨混合(飽和度25％)，4℃放置1小時，如上所述再離心。使上清液中的硫酸銨達到65％的飽和度，4℃放置24小時並再離心。將各沉澱物溶於200ml緩衝液(1M硫酸銨，50mM Tris-HCl，pH8.0)中，在Phenyl-Sepharose 6 Fast Flow(Pharmacia-Upjohn)上經疏水層析純化(梯度洗脫，緩衝液A50mM磷酸鈉，pH8.0，含1M硫酸銨；緩衝液B20％甘油，5％甲醇，50mM磷酸鈉，pH8.0)。合併含TNF免疫活性物的流分(蛋白質印跡法)，用2mM乙二胺四乙酸，20mM Tris-HCl，pH8.0的緩衝液透析，並在DEAE-Sepharose FastFlow(Pharmacia-Upjohn)上經離子交換層析進一步純化(梯度洗脫，緩衝液A20mM Tris-HCl，pH8.0；緩衝液B1M氯化鈉，20mMTris-HCl，pH8.0)。合併含TNF免疫活性的流分並在Sephacryl-S-300HR(Pharmacia-Upjohn)上經凝膠過濾層析純化，用150mM氯化鈉，50mM磷酸鈉，pH7.3的緩衝液(PBS)預平衡並洗脫。合併相當於40000-50000Mr產物的流分，等分並凍存於-20℃。用於所述層析步驟中的所有溶液都是用無菌無內毒素的水(Salf，Bergamo，Italy)製備的。最後產量為45mg TNF和34.5mg NGR-TNF。
純化的TNF和NGR-TNF的分子量用電噴霧質譜測定法測定。蛋白質含量用市售蛋白測定試劑盒(Pierce，Rockgord，IL)測定。用定量產色鱟變形細胞溶解產物(LAL)檢驗法(Bio Whittaker)測定NGR-TNF和TNF的內毒素含量分別是0.75單位/μg和1.38單位/μg。
按照標準程序，用12.5％或15％的聚丙烯醯胺凝膠進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯醯胺凝膠電泳(SDS-PAGE)和蛋白質印跡分析。
少量TNF和NGR-TNR在如下可溶性p55-TNF受體(sTNF-R1)-Sepharose(按照文獻(22)所述製備5mg重組sTNF-R1並按廠商說明書結合到2ml Activated-CH-Sepharose(Pharmacia))上經親和層析進一步純化。用無菌無內毒素的溶液徹底清洗兩個單獨的柱子(每個柱子1ml)，用PBS中純化的TNF或NGR-TNF上樣並經梯度洗脫解除吸附(1h，緩衝液APBS；緩衝液B0.5M氯化鈉，0.2M甘氨酸-鹽酸)。中和包含TNF-抗原的組分的流分並用無菌生理鹽水透析。在透析前加入無內毒素的人血清白蛋白(0.5mg/ml)防止蛋白吸附在膜上。用ELISA和細胞溶解試驗測定每一流分的TNF含量。
與預期的TNF單體(未顯示)一樣，TNF的非還原性SDS-PAGE顯示出17-18kDa的單一條帶。相矛盾的是，NGR-TNF的非還原性SDS-PAGE和蛋白質印跡分析顯示出可能相當於單體、二聚體和三聚體的不同免疫活性型的18、36和50kDa。在還原條件下大多數50和36kDa的條帶轉變為18kDa的形式，說明存在具有鏈間二硫鍵的NGR-TNF分子。所述18kDa條帶佔總物質的2/3，而所述36kDa的條帶佔剩餘部分的大多數。這些電泳圖譜表明NGR-TNF是由具有正確的鏈內二硫鍵(至少50％)的三個單體亞基組成的三聚體和其餘部分(大多數為具有一個或多個鏈間二硫鍵的三聚體)的混合物。還原性SDS-PAGE仍然觀察到36kDa條帶表明NGR-TNF還包含不可逆變性的二聚體(大約為總數的10％)。
通過電噴霧質譜測定法測定TNF和NGR-TNF單體的分子量分別是17386.1±2.0Da和17843.7±2.5Da。所述檢測值與Met-TNF1-156(17386.7Da)和CNGRCG-TNF1-156(17844.2Da)的預期分子量非常接近。
實施例II小鼠TNF和NGR-TNF的體外細胞毒性活性如文獻(23)所述，通過基於L-M小鼠成纖維細胞(ATCC CCL1.2)的標準細胞溶解試驗測定TNF和NGR-TNF的生物學活性。在30ng/ml放線菌素D存在的條件下測定TNF和NGR-TNF對RMA-T細胞的細胞溶解活性。每一樣品在三種不同濃度下以雙份試驗進行分析。結果用2-3個獨立試驗的平均值±SD表示。
按照L-M細胞的標準細胞溶解試驗，所述TNF和NGR-TNF的體外細胞毒性活性分別為(1.2±0.14)×108單位/mg和(1.8±0.7)×108單位/mg。這些結果表明所述NGR-TNF分子中的CNGRCG部分未阻止其摺疊、寡聚化和綴合TNF受體。
在先前的研究中我們已證明，在30ng/ml放線菌素D存在的條件下RMA-T細胞能被TNF殺死，然而在缺少轉錄抑制劑的條件下，甚至在培育幾天後這些細胞對TNF仍然有抵抗力。根據用TNF((1.2±0.14)×108單位/mg)作為標準品進行的測定，在放線菌素D存在的條件下NGR-TNF對RMA-T細胞的體外細胞毒性活性為(1.4±0.8)×108單位/mg。
實施例III小鼠TNF和NGR-TNF的治療活性和毒性的表徵Rauscher病毒引起的C57BL/6 RMA淋巴瘤在體外用RPMI1640、5％胎牛血清(FBS)、100U/ml青黴素、100μg/ml鏈黴素、0.25μg/ml兩性黴素B、2mM谷醯氨和50μM 2-巰基乙醇維持。RMA-T是由編碼Thy 1.1等位基因的構建物轉染RMA細胞系衍生來的，按照文獻(14)所述培養。
B16F1黑素瘤細胞培養在RPMI 1640、5％FBS、100U/ml青黴素、100μg/ml鏈黴素、0.25μg/ml兩性黴素B、2mM谷醯氨、1％無必需胺基酸的MEM中(BioWhittaker Europe，Verviers，Belgium)。
在動物模型的體內研究得到the Ethical Committee of the SanRaffaele H Scientific Institute批准並按照規定方針執行。在左肋側分別用5×104RMA-T或B16F1活細胞皮下注射攻擊C57BL/6(CharlesRiver Laboratories，Calco，Italy)(16-18g)。腫瘤移植12天後，腹腔內注射250μlTNF或NGR-TNF溶液(0.9％的無內毒素氯化鈉稀釋)治療小鼠。初步實驗表明添加人血清白蛋白(作為載體)到TNF和NGR-TNF溶液中沒有改變所述抗腫瘤活性。每組用5隻小鼠進行每個實驗。每天用卡尺測量腫瘤大小監測腫瘤生長。通過計算r1×r2估計腫瘤面積，而通過計算rl×r2×r3×4/3估計腫瘤體積，r1和r2是縱向半徑和橫向半徑，r3是從正常皮膚表面凸起的腫瘤厚度。在腫瘤直徑達到1.0-1.3cm前殺死動物。腫瘤大小以平均值±SE表示(每組5-10隻動物，如圖例說明所示)並通過t-檢驗比較。
用在C57BL6小鼠中的RMA-T淋巴瘤和B16F1黑素瘤模型比較NGR-TNF和TNF的抗腫瘤活性和毒性。因為所述RMA--T模型以前已經進行了特徵鑑定並用研究不同靶向草案(26)的TNF抗腫瘤活性，所以我們決定在本文的研究中也使用這個模型。
小鼠TNF給予帶有皮下注射建立的RMA-T腫瘤的動物，24h後引起腫瘤質量減少和腫瘤中心部位的出血性壞死，繼之顯著生長抑制持續數天(26)。用單一TNF治療不能引起腫瘤完全消退(甚至在劑量接近LD50時)，因為在治療後數天腫瘤壞死區域附近殘存的活細胞重新開始生長。
在第一套實驗中我們研究TNF或NGR-TNF的各種劑量(腹腔內注射)對動物存活率的影響。為避免過多的痛苦當所述腫瘤直徑大於1-1.3cm時殺死動物。治療後3天，TNF和NGR-TNF的致死率相似(LD50分別為60μg和45μg)而它們的抗腫瘤活性顯著不同(表1)。
表1.用小鼠TNF和NGR-RNF治療帶有RMA-T淋巴瘤的小鼠的存活率治療動物(數量)劑量(μg)治療後存活率(％)a)第3天 第7天 第14天 第21天 第30天 第38天 第62天 第92天(2nd(3och.)b)ch)b)無18 0 100 0TNF4 1 100 20 09 3 100 55 09 9 100 55 22 11 014 27100 57 14 709 5455 55 09 1080NGR-TNF10 1 100 70 10 10 10 010 3 100 80 20 20 20 09 9 100 88 55 22 11 11 1113 27100 85 30 23 15 15 15 119 5433 33 0159 1080a)腫瘤移植10天後用TNF或NGR-TNF(腹腔內注射)治療帶腫瘤的動物。當腫瘤直徑超過1-1.3cm時殺死動物。b)存活動物在指示的時間再用50,000RMA-T細胞(第二次攻擊)或50,000RMA(第三次)攻擊。在每個時間用5隻正常動物監測注射細胞的致腫瘤性。所有對照動物10天內生長出腫瘤(數據未列出)。
例如，1或3μg的NGR-TNF比27μg的TNF更有效延遲腫瘤生長，說明NGR-TNF更有效至少1個數量級。有趣的是，一些動物用低於LD50的劑量NGR-TNF治癒，而用TNF根本沒有動物被治癒。治癒動物抵制致瘤劑量的RMA-T或野生型RMA細胞的進一步攻擊，表明用NGR-TNF單一治療能誘導保護性免疫。值得注意的是，增加TNF或NGR-TNF劑量至9-27μg以上毒性顯著增加而治療活性很少或沒有增加。
伴隨TNF治療的體重減少是眾所周知的全身性毒性表現(26)。因此為進一步比較TNF和NGR-TNF的效力/毒性比，我們監測治療後腫瘤生長和動物體重。1μgNGR-TNF對腫瘤生長的效果相似或高於9μgTNF的(圖1a)，而治療後1-2天的體重減少效果與1μgTNF治療類似(圖1c)。當我們內推以劑量-反應作圖的對數曲線數據時發現，9μgTNF第14天的治療效果能用少到0.6μg的NGR-TNF獲得(圖1b)。相反，必需8.5μg才引起類似的毒性作用(圖1d)。因此，在這些條件下計算出的NGR-TNF效力/毒性比比TNF大14倍。
周B16F1黑素瘤模型獲得了相似的結果。在第11天和17天用1μgNGR-TNF治療，在第19天引起的抗腫瘤反應大於用4μgTNF獲得的反應而與12μgTNF獲得的相似(數據未列出)。相反，1μgNGR-TNF引起的體重減少顯著地低於由4μg和12μgTNF引起的體重減少。用12μgNGR-TNF治療產生強得多的抗腫瘤效果，而毒性效果與12μgTNF相似。
當在第19天第三次注射時，1-2天後所有組中有一些動物死亡(鹽水和12μgNGR-TNF治療組中5隻中2隻死亡，其它組中5隻中1隻死亡)。值得注意的是，用12μgNGR-TNF治療的一隻動物徹底消除了腫瘤。當用第二劑致瘤劑量的B16F1細胞第二次攻擊這個動物時，18天後生長出可捫及的腫瘤，而對照動物在6-7天內生長出腫瘤。
總而言之，這些結果表明NGR-TNF抑制腫瘤生長的效力比TNF大10-15倍而毒性是相似的。此外，NGR-TNF比TNF能更有效地誘導保護性免疫應答。
實施例IVNGR-TNF的作用機理經蛋白-G瓊脂糖層析(Pharmacia-Upjohn，Uppsala，Sweden)從腹水中純化抗小鼠CD13單克隆抗體R3-63，並用0.9％氯化鈉透析。
兔多克隆抗血清從Primm srl(Milan，Italy)購買並在蛋白-A-瓊脂糖(Pharmacia-Upjohn)上親和層析純化。肽CNGRC和CARAC如前所述製備(28)。
為提供NGR-TNF的改良活性是依賴藉助於NGR部分的腫瘤靶向的證據，我們研究NGR-TNF的體內活性是否能被CNGRC部分競爭。為這個目的我們給予帶RMA-T腫瘤的小鼠NGR-TNF(1μg)(含或不含過摩爾量的CNGRC)。平行地，其它動物用TNF(3或9μg)治療(也含或不含CNGRC)。正如所料，CNGRC顯著降低了NGR-TNF的抗腫瘤活性(圖2a)但沒有降低TNF的抗腫瘤活性(圖2b)。相矛盾的是，對照肽(CARAC)不能引起NGR-TNF活性顯著降低(圖2c)。這些結果表明CNGRC競爭NGR-TNF與CNGRC受體的綴合，並支持改善活性的靶向機制假說。值得注意的是，CNGRC不能降低NGR-TNF的體外細胞毒性作用(數據未列出)。
因為近來報導氨肽酶N(CD13)是肽CNGRC的受體，於是我們研究這個受體在NGR-TNF靶向機制中的貢獻。為這個目的，我們研究了抗-CD13單克隆抗體(R3-63)對NGR-TNF和TNF抗腫瘤活性的作用。單克隆抗體R3-63顯著抑制NGR-TNF的抗腫瘤活性(圖2a)但沒有抑制TNF的抗腫瘤活性(圖2b)，表明所述CD13確實決定性地涉及NGR-TNF的抗腫瘤活性。通過用單克隆抗體R3-63對培養細胞的FACS分析觀測到在RMA-T細胞表面沒有CD13的表達(未列出)，表明所述抗體識別其它體內細胞。
雖然這些數據表明CD13是NGR-TNF的重要受體，我們不能完全排除綴合其它尚未識別的NGR受體也對所述靶向機制有貢獻(即使較低程度)。
蛋白質部分水解的初步實驗表明TNF的N-末端部分(2-3個殘基)中的Arg-Ser鍵對胰蛋白酶非常敏感，而該分子其餘部分有非常強的抗性。因此，為了進一步提供NGR-TNF改善的活性與它的NGR部分有關係的證據，我們試圖通過用固定的胰蛋白酶部分消化從突變型蛋白的N-末端區域切除NGR結構域。這個處理將NGR-TNF和TNF都轉變為一個相當於TNF3-156片段的分子(預期分子量為16986.2Da；測定分子量和預期序列參見圖3a)。
儘管消化作用不降低NGR-TNF在體外對L-M細胞的細胞溶解活性((2.3±1.4)×108U/mg)，它在體內的抗腫瘤活性降低到TNF的水平(圖3b)。值得注意的是根據治療後1天動物體重的減少判斷(圖3b，右圖)，NGR-TNF和TNF的毒性在消化前後是相似的，表明所述NGR-依賴的靶向機制不改變毒性。
實施例V人TNF和NGR-TNF的製備和表徵人重組TNF和NGR-TNF(包含融合有CNGRCG的C末端的人TNF1-257)通過重組DNA技術製備並基本如所述小鼠TNF和NGR-TNF純化。用下列引物-NGR-hTNF/1(有義)5』A TATCAT ATGTGC AAC GGC CGTTGC GGC GTC AGA TCA TCdT TCT CG 3』-NGR-hTNF/2(反義)5』TCAGGA TCCTCA CAG GGC AATGAT CCC AAA GTA GAC 3』對包含所述hTNF編碼序列(33)的質粒pET11b/hTNF通過PCR製備編碼人NGR-TNF的cDNA。
擴增片段經酶切克隆到pET-11b(Nde I/BamH I)中，並用於轉化BL21(DE3)有義細胞(Novagen)。按照pET-11b廠商說明書用異丙基-β-D-硫代半乳糖苷誘導NGR-hTNF的表達。通過在2mM乙二胺四乙酸，20mM Tris-HCl，pH8.0中超聲處理細菌接著離心(15000×g，20分鐘，4℃)從兩升培養物中回收可溶性的NGR-TNF。
所述提取液與硫酸銨混合(飽和度35％)，4℃放置1小時，如上再離心。然後使上清液中的硫酸銨達到65％的飽和度，4℃放置24小時並進一步離心。將各沉澱物溶於1M硫酸銨，50mM Tris-HCl，pH8.0中，通過在Phenyl-Sepharose 6 Fast Flow(Pharmacia-Upjohn)上疏水層析純化(梯度洗脫，緩衝液A100mM磷酸鈉，pH8.0，含有1M硫酸銨；緩衝液B70％乙二醇，5％甲醇，100mM磷酸鈉，pH8.0)。合併含有hTNF免疫活性物質(經ELISA)的流分，用20mM Tris-HCl，pH8.0透析，並進一步通過在DEAE-Sepharose Fast Flow(Pharmacia-Upjohn)上離子交換層析純化(梯度洗脫，緩衝液A20mM Tris-HCl，pH8.0；緩衝液B1M氯化鈉，20mM Tris-HCl，pH8.0)。所述層析步驟中使用的所有溶液都用無菌無內毒素的水製備(Salf，Bergamo，Italy)。
這裡從兩升培養物中回收了大約30mgTNF和32mg NGR-TNF。非還原性SDS-PAGE顯示相應於單體、二聚體和三聚體的條帶，表明人NGR-TNF也是具有正確的鏈內二硫鍵的三聚體和具有一個或多個鏈間二硫鍵的三聚體的混合物(圖4A，泳道b)(與用小鼠NGR-TNF觀察的一樣)。
具有正確的鏈內二硫鍵的三聚體經如下四個步驟的變性-再摺疊過程從該混合物中分離出來用7M尿素使純化的人NGR-TNF變性，然後通過7M尿素，100mM Tris-HCl，pH8.0預平衡的HR Sephacryl S-300柱(1025ml)(Pharmacia)凝膠過濾。合併相應單體TNF的流分，經YM MWCO 10kDa膜(Amicon)超濾，然後用33倍體積2.33M尿素，100mM Tris-HCl，pH8在4℃透析(140分鐘)，接著經1.55M尿素，100mM Tris-HCl，pH8透析(140分鐘)和1M尿素，100mM Tris-HCl，pH8透析(140分鐘)而再摺疊。最後產物用80倍體積的100mM Tris-HCl透析(16小時)，在13000×g離心(30分鐘)，經SFCA 0.45μm膜(Nalgene)過濾並用0.15M氯化鈉，0.05M磷酸鈉(PBS)預平衡的HRSephacryl S-300柱(1020ml)凝膠過濾。回收大約23mg再摺疊蛋白。
在非還原性SDS-PAGE後最終產物大部分為單體(圖4A，泳道c)，在Superdex 75 HR柱上經分析性凝膠過濾HPLC，液體力學體積與三聚體人TNF相似(未列出)，電噴霧質譜測定法測定分子量17937.8+1.8Da(CNGRCG-TNF1-157預期分子量為17939.4Da)。未再摺疊和再摺疊的NGR-TNF對小鼠L-M細胞的體外細胞溶解活性分別是(6.11×107)+4.9和(5.09×107)+0.3單位/mg，而純化的人TNF是(5.45×107)+3.1單位/mg。這些結果表明所述變性-再摺疊過程不影響人NGR-TNF和小鼠p55受體的相互作用。
1μg人NGR-TNF(未再摺疊)的體內抗腫瘤活性比10μgTNF更大(圖4B)，而通過動物體重減少判斷的毒性顯著地較低(圖4C)。0.3μgNGR-TNF再摺疊後足以誘導比10μgTNF達到的更強烈的抗腫瘤作用(圖4D，4E)。
這些結果說明人NGR-TNF的抗腫瘤活性比人TNF的抗腫瘤活性更大。
此外，我們觀察到再摺疊的人NGR-TNF和小鼠NGR-TNF對帶有RMA-T的小鼠，即使以沒有毒性作用證據的非常低的劑量(1-10ng/小鼠)也能引起顯著的抗腫瘤作用，而TNF以這樣的劑量不能引起顯著作用(未列出)。
實施例VI小鼠NGR-IFNγ的製備和表徵基本如NGR-TNF所述，與CNGRCG融合的重組小鼠幹擾素(IFN)γ(NGR-IFNγ)經重組DNA技術製備。CNGRC結構域與IFNγ的C末端融合。此外134位的半胱氨酸被絲氨酸替換；甲硫氨酸被引入位點-1，用於在大腸桿菌細胞中表達。用於製作NGR-IFNγ cDNA的PCR引物是5』-A TAT CTA CAT ATG CAC GGC ACA GTC ATTGAA AGC C(有義)和5』-TC GGA TCC TCA GCA ACG GCC GTTGCA GCC GGA GCG ACT CCT TTT CCG CTT CCT GAG GC。在pET-11b(Nde I/BamH I)中克隆所述cDNA並用於轉化BL21(DE3)有義細胞(Novagen)。按照pET-11b廠商說明書用異丙基-β-D-硫代半乳糖苷誘導蛋白表達。按照標準技術，通過固定在瓊脂糖上的抗小鼠IFNγ單克隆抗體(AN18)免疫親和層析從大腸桿菌提取液中純化所述產物。最終產物的還原和非還原性SDS-PAGE顯示出16Kda的單一條帶。電噴霧質譜測定法測定顯示相當於小鼠Met-IFNγ1-134(C134S)CNGRC(NGR-IFNγ)的分子量為16223+3.6Da(預期1625.5Da)。
NGR-IFNγ和NGR-TNF與抗-CD13抗體競爭結合到腫瘤相關血管的能力通過使用免疫組織化學方法研究。
從the Histopathology Department of the San Raffaele H ScientificInstitute獲得人腎臟細胞癌的新鮮外科標本。製備Bouin固定(4-6小時)的石蠟包埋標本的切片(5-6μm厚)並吸附到聚賴氨酸包被的玻片上。如下用抗生物素蛋白-生物素複合法檢測CD13抗原組織切片按照標準程序用二甲苯和分級乙醇系列再水合。將組織切片置於含有1mM EDTA的容器中並用微波爐(1000W)煮沸7分鐘。然後往容器中再裝1mM EDTA並再煮沸5分鐘。將所述組織切片放置冷卻，然後在含有0.3％的過氧化氫的PBS中孵育15分鐘來抑制內源性過氧化物酶。然後用PBS漂洗所述標本並用100-200μl PBS-BSA孵育(室溫1小時)，接著用單克隆抗體WM15(抗hCD13)(單獨或與各種競爭劑混合(見表2))在PBS-BSA中孵育(4℃過夜)。然後用PBS洗滌玻片3次(每次3分鐘)並用含2％普通馬血清的PBS-BSA(PBS-BSA-NHS)(Vector Laboratories，Burlingame，CA)孵育5分鐘。用3μg/ml生物素化馬抗小鼠IgG(H+L)(Vector Laboratories，Burlingame，CA)的PBS-BSA-NHS代替上述溶液，然後室溫再孵育1小時。再洗滌玻片，用PBS 1∶100稀釋的Vectastain Elite Reagent(Vector Laboratories，Burlingame，CA)孵育30分鐘。然後將一片3，3』-二氨基-聯苯胺-四鹽酸鹽(Merck，Darmstadt，Germany)溶於10ml含有0.03％過氧化氫的去離子水中，經0.2μm膜過濾並覆蓋在組織切片上5-10分鐘。如上所述洗滌玻片並用Harris』蘇木紫復染。腫瘤相關血管用抗CD13單克隆抗體(mAb JC/70A，抗人CD31，IgG1，DAKO，Copenhagen，Denmark)經連續組織切片染色鑑定。
結果總結於表2。如表所示，WM15對腫瘤相關血管的結合被過量NGR-TNF、NGR-IFNγ和CNGRC所抑制，但沒有被其它缺乏NGR基元的對照試劑所抑制。這表明CD13上的NGR結合位點與所述WM15抗原決定簇在空間上重疊。相反地，NGR-TNF不能與13C03競爭結合到上皮細胞上。
我們的結論是，NGR-IFNγ和NGR-TNF的NGR部分能和在腫瘤相關血管上由單克隆抗體WM15識別的CD13形式相互作用。此外，這些結果表明當被連接到細胞因子的N-末端或C-末端時CNGRC基元是有功能性的。
表2.在各種競爭劑存在的條件下WM15與腎臟細胞癌切片的結合競爭劑 WM15與腫瘤相關血管的結合無 +NGR-TNF(25μg/ml)-NGR-IFNγ(50μg/ml) -CNGRC(100μg/ml) -TNF(25μg/ml)+人血清白蛋白(25μg/ml) +合成CgA(60-68)(100μg/ml)+a在封閉步驟中在含有2％BSA的PBS中添加競爭劑並和最初的抗體混合。b單克隆抗體WM15(抗人CD13，IgG1)來自Pharmingen(San Diego，CA)；合成肽CgA(60-68)相應於嗜鉻粒蛋白A片段60-68。
實施例VII用抗腫瘤抗體和抗生物素蛋白定向傳遞生物素化NGR-TNF到腫瘤(預導向)下列實例闡明TNF(基於腫瘤自動靶向抗體和肽CNGRC的聯合應用)的「雙」靶向可能性。
通過將NGR-TNF和D-生物素基-6-氨基己酸N-羥基琥珀醯亞胺酯(Societá Prodotti Antibiotici S.p.A，Milan，Italy)在1M碳酸鈉緩衝液pH6.8中混合(室溫3小時)，製備生物素-NGR-TNF綴合物(21)。用1MTris-HCl，pH7.5中斷反應。
所述綴合物用質譜測定法檢定發現含有1個生物素/三聚體(平均)。然後用5×104RMA-T活細胞左肋皮下注射攻擊C57BL/6(CharlesRiver Laboratories，Calo，Italy)。當腫瘤面積達到40mm2時，按照如前(26)所述的「3天」方案相繼注射生物素化抗體、抗生物素蛋白和生物素-TNF。我們注射40μg生物素-mAb19E12(腹腔內注射，步驟I)，分別在18和19小時後60μg抗生物素蛋白和60μg鏈黴抗生物素蛋白(腹腔內注射，步驟II)，在24小時後3μg生物素-NGR-TNF(腹腔內注射，步驟III)。每種化合物用無菌的0.9％氯化鈉溶液稀釋。在對照實驗中，省略抗生物素蛋白和鏈黴抗生物素蛋白。每個實驗用5隻小鼠/組完成。通過每日用卡尺測量腫瘤大小監測腫瘤生長。在用mAb19E12-生物素/抗生物素蛋白/鏈黴抗生物素蛋白/生物素-NGR-TNF(5隻動物，平均±SE值)治療的組中，腫瘤面積在治療前和治療10天後分別是39±4mm2和8±5mm2。在對照組中(只用mAb 19E12-生物素/生物素-NGR-TNF治療)腫瘤面積在治療前和治療10天後分別是40±4mm2和20±6mm2，表明用腫瘤自動靶向抗體和抗生物素蛋白預靶向提高了NGR-TNF活性。
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序列表110Fondazione Centro San Raffaele del Monte Tabor120用於治療癌症的修飾細胞因子130modcyt140
141
1607170PatentIn Ver.2.1210121130212DNA213人工序列220
223人工序列描述PCR引物4001ctggatcctc acagagcaat gactccaaag30210221129212DNA213人工序列220
223人工序列描述PCR引物4002tgcct cacat atgctcagat catcttctc29
210321146212DNA213人工序列220
223人工序列描述PCR引物4003gcagatcata tgtgcaacgg ccgttgcggc ctcagatcat cttctc46210421145212DNA213人工序列220
223人工序列描述PCR引物4004atatcatatg tgcaacggcc gttgcggcgt cagatcatct tctcg45210521136212DNA213人工序列220
223人工序列描述PCR引物4005tcaggatcct cacagggcaa tgatcccaaa gtagac 36210621135212DNA213人工序列220
223人工序列描述PCR引物4006atatctacat atgcacggca cagtcattga aagcc 35210721158212DNA213人工序列220
223人工序列描述PCR引物4007tcggatcctc agcaacggcc gttgcagccg gagcgactcc ttttccgcttcttgaggc 58
權利要求
1.一種綴合製品，該綴合製品為選自TNF或IFNγ的細胞因子和CD13受體配體的綴合物。
2.權利要求1要求保護的綴合製品，其中所述細胞因子是TNFα或TNFβ。
3.權利要求1-2要求保護的綴合製品，其中所述CD13受體配體選自抗體或其活性片段、肽或肽模擬物。
4.權利要求3要求保護的綴合製品，其中所述配體是一種包含NGR基元的肽。
5.權利要求4要求保護的綴合製品，其中所述肽選自CNGRCVSGCAGRC、NGRAHA、GNGRG、環形CVLNGRMEC、線性或環形CNGRC。
6.任一項前述權利要求要求保護的綴合製品，其中所述細胞因子是用聚乙二醇或醯基殘基衍化的細胞因子。
7.任一項前述權利要求要求保護的綴合製品，其中所述細胞因子進一步與抗體或其片段或者與生物素綴合，所述抗體或其片段為針對腫瘤抗原、腫瘤血管形成標記物或胞外基質組分的抗體。
8.權利要求7的綴合製品，其中所述細胞因子是TNF，並且在不同亞基上與CD13配體和抗體或其片段或生物素綴合。
9.一種編碼選自TNF和IFN的細胞因子的cDNA，該cDNA帶有編碼CD13配體的5』或3』連續序列。
10.權利要求9的cDNA，其中所述CD13配體是權利要求5的肽。
11.一種包含權利要求9-10的cDNA的基因治療載體。
12.一種藥物組合物，它包含有效量的權利要求1-8保護的綴合製品和製藥學允許的載體及賦形劑。
13.權利要求12要求保護的組合物，該組合物為注射溶液或懸混液或用於輸注的液體形式。
14.權利要求12-13要求保護的組合物，它為脂質體形式。
15.權利要求1-8要求保護的綴合製品或權利要求9-10的cDNA在製備用於治療癌症的藥物或診斷試劑中的應用。
16.權利要求15的綴合製品用途，它可與其它抗腫瘤藥物或診斷性腫瘤成像化合物聯合應用。
全文摘要
能自動靶向腫瘤血管和抗原呈遞細胞的細胞因子衍生物及其作為抗腫瘤藥物的應用。
文檔編號A61K38/19GK1446261SQ01807712
公開日2003年10月1日 申請日期2001年2月13日 優先權日2000年2月15日
發明者A·科爾蒂 申請人:聖拉斐爾德爾蒙特塔博基金中心